CC BY
41
лей указует на коррегирующее действие «Глутар-гина».
Ключевые слова: поджелудочная железа, тяжелые металлы, регенерация, «Глутаргин».
comparison of morphometry indexes indicate to correcting action of «Glutargin».
Key words: pancreas, heavy metals, regeneration, «Glutargin».
УДК: 597.58-133:57.043
ЭМБРИОНЫ ЛЯЛИУСА (COLISA LALIA, Hamilton 1822) - МОДЕЛЬНЫЙ ОБЪЕКТ ДЛЯ
КРИОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Криоконсервирование эмбрионов рыб - важный этап сохранения биоразнообразия, поскольку в этом случае сохраняются как материнский, так и отцовский геном [4].
До настоящего времени попытки криоконсервирования яиц и эмбрионов рыб не привели к положительным результатам. Одним из существенных факторов, затрудняющим криоконсервирование, является большой объем этих биологических объектов [17].
Представляется целесообразным использование в качестве модельного объекта лялиуса (С. lalia), поскольку его эмбрионы намного меньше, чем у данио рерио (Brachydanio rerio) - наиболее распространенного биологического объекта в криобиологических исследованиях [10,11]. Физиологические параметры этих эмбрионов облегчают наблюдение за эмбриогенезом и влиянием факторов эксперимента. Кроме того, эмбрионы С. lalia можно легко получать на разных стадиях развития в любое удобное для исследователя время года. Преимуществами объекта также являются короткая продолжительность периода эмбрионального развития, отсутствие особых трудностей при содержании в лабораторных условиях [15], однако эмбриональное развитие этих рыб не описано.
Целью работы было изучение и описание стадий развития эмбрионов С. lalia для дальнейшего их криоконсервирования.
Материал и методы исследования. Из общей лабораторной группы отбирали 810-месячных молодых особей номинативного окраса и конституции с четко выраженными половыми различиями [13] и нормальной активностью. Перед нерестом самцов и самок рассаживали на 5-10 дней. Для нереста использовали стеклянные емкости объемом 15 л с отстоянной водопроводной водой (pH 7,0; dH 12°). Температуру в течение суток плавно повышали до 28±0,2 °С.
За развитием оплодотворенной икры и эмбрионов наблюдали при постоянной температуре 22-30 °С с интервалом 0,5 °С (±0,2 °С). В процессе инкубации периодически производили выемку небольших порций икры (не менее 5 икринок) для изучения морфологического состояния зародышей. За единицу времени принимали продолжи -тельность одного митотического цикла в период синхронных делений дробления т 0. В ходе наблюдений в каждом режиме температуры определяли значение т0. Время т0 оценивали по продолжительности 2-го деления дробления (от 2 до 4 бластомеров). Возраст эмбрионов во время инкубации определяли с момента осеменения икры в абсолютном значении времени и в относительном эквиваленте из соотношения tn/T0.
Эмбрионы переносили в капле воды на предметное стекло рабочего стола микроскопа «Olympus-SZ» и снимали цифровым фотоаппаратом «Olympus SP-350». Подвижные эмбрионы перед микроскопированием обездвиживались с помощью анестетика трикаинметансульфата. Размерные характеристики изучаемых объектов определяли по шкале микрометра.
Результаты исследований и их обсуждение. Параметром эмбрионального развития рыб принят временной показатель одного митотического цикла в период синхронных делений дробления т0 [1]. Поэтому мы измеряли этот показатель для С. lalia в диапазоне 26-30 °С, который был выбран по оптимальным температурам нереста [15].
На рис. 1 представлен график продолжительности одного митотического цикла в период синхронных делений дробления в зависимости от температуры у эмбрионов С. lalia.
По приведенному графику можно определить величину т0 и рассчитать время наступления определенной стадии развития при любой температуре инкубации. Общее время развития до стадии выклева при температуре 28±0,2 °С составило 24 ч (±1,0). При определении времени относительной продолжительности различных периодов эмбрионального развития у С. ¡эНв установлено, что при 26-30 °С для одноименных периодов развития оно достоверно не изменяется.
\
V
ь к
N !
\
1 и
ь ■ ■
I
Рис. 1. Продолжительность одного митотического цикла в период синхронных делений дробления (то) в зависимости от температуры у эмбрионов С. ¡эНв (п=5).
В таблице описаны признаки выделения стадий эмбрионального развития С. ¡эНв, а также продолжительность стадий в часах и единицах т0 при температуре развития 28±0,2 °С. Целесообразно сопоставить исследованные стадии эмбрионального развития С. ¡эНв с описанными ранее криобиологическими исследованиями, проведенными на эмбрионах других видов рыб.
За развитием эмбрионов наблюдали с момента оплодотворения икринок до стадии выклева. Диаметр оплодотворенной икринки в момент первого митотического деления без хориона составляет 0,61±0,03 мм; с перивителлиновым пространством и хорионом - 0,7±0,1 мм. Мы предполагаем, что маленькое перивителлиновое пространство обеспечит быстрое проникновение криозащитных сред внутрь развивающихся эмбрионов, вследствие чего значительно сокращается время обезвоживания. Настоящее предположение выгодно отличает данный объект от других биологических моделей.
В первый час развития происходит отделение желточной оболочки от поверхности яйца. Образуются перивителлиновое пространство и цитоплазматический бугорок на анимальном полюсе икринки. Борозды первого и второго деления проходят меридионально, образуя в течение этого времени 8 бластомеров (рис. 2).
Большинство исследований, связанных с криоконсервированием бластомеров эмбрионов рыб, проводилось на ранних стадиях развития [5, 6, 14], поскольку эмбрионы на стадии образования 2-8 бластомеров (соответствует первому часу развития) устойчивы к воздействию криопротекторов на протяжении длительного времени [18]. Учитывая наши результаты, криобиологические исследования с использованием эмбрионов С. ¡эНв на ранних стадиях развития целесообразно проводить в течение первого часа после оплодотворения.
Стадии развития, следующие за ранней бластулой, менее чувствительны к переохлаждению, но чувствительность повышается при субнулевых температурах [7, 12, 18]. На стадиях развития 7-10 ч заканчивается обрастание бластодермой желтка. Начинается закладка сомитов. Появляются первые пигментные пятна на поверхности туловищного отдела. На этом этапе эмбрионы более устойчивы к воздействию криопротекторов и влиянию временного переохлаждения [2, 19] (рис. 3).
Стадии, соответствующие 15-17 ч развития, характеризуются обособлением хвостового отдела, происходит закладка глазных бокалов, начинаются пигментация поверхностных покровов всего эмбриона и пульсация сердца (рис. 4).
Исследования при обработке эмбрионов криопротекторами показали, что наиболее устойчивые стадии развития находятся в промежутках между стадией пост-гаструлы и стадией "бьющегося сердца".
Таблица
Описание стадий эмбрионального развития С. 1аНа при температуре 28 ± 0,2 °С
Часы Внешние отличительные признаки стадий зародышевого развития
- 0 Зрелое яйцо в момент осеменения.
30 мин 1/2 Желточная оболочка отделена от поверхности яйца. Образование
перивителлинового пространства и бороздки первого деления.
1 2 8 бластомеров; две борозды третьего деления проходят меридионально
и перпендикулярно борозде второго деления.
3 32 бластомера; борозда деления проходит параллельно экватору
икринки.
2 4 Больше 100 бластомеров.
21/2 5 Морула - бластомеры расположены в несколько слоев и образуют
бугристую шапочку. Десинхронизация делений ядра.
3 6 Ранняя бластула. Шапочка бластомеров возвышается над желтком или
несколько расплющена. Наружные бластомеры образуют эпибласт, но
31/2 его поверхность еще бугристая.
7 Средняя бластула; бластомеры стали мельче, чем на стадии 6,
поверхность бластулы ровная.
4 8 Поздняя высокая бластула. Шапочка мелких бластомеров еще
несколько приподнята над желтком. Отдельные бластомеры при малом
увеличении плохо различимы.
Часы ито Внешние отличительные признаки стадий зародышевого развития
5 10 Начало гаструляции. Нижний контур бластодермы четкий, ее диаметр
увеличился.
6 12 Образование зародышевого щитка.
7 14 Бластодерма обросла 1/2 поверхности желтка. Зародышевый щиток
имеет форму язычка, слегка расширенного в передней части.
Обособление хорды от мезодермы.
8 16 Бластодерма обросла 3/4 поверхности желтка. Желточная пробка
большая, зародыш имеет вид сильно вытянутой пластинки.
9 18 Бластодерма обросла от 4/5 до 7/8 поверхности желтка.
10 20 Завершение обрастания бластодермой желтка. Бластодерма полностью
обросла желток, в головном отделе зародыша образовались
мезодермальные валики.
11 22 Образование 2-й пары туловищных сомитов. Начало образования
пигментных пятен на поверхности туловищного отдела.
12 24 Образование 8-й пары туловищных сомитов.
13 26 Образование 13-й пары туловищных сомитов, головной отдел
увеличился и приподнялся над желтком.
14 28 Образование 18-й пары туловищных сомитов. Появление пигментных
пятен на всей поверхности зародышевой оболочки.
15 30 Образование 23-й пары туловищных сомитов.
16 32 Образование 28-й пары туловищных сомитов. Длина зародыша
увеличилась, и он начал двигаться. Начало обособления хвостового
отдела от туловищного отдела.
17 34 Туловищная мезодерма содержит до 32 пар сомитов. Хвост обособился
от желтка. Начало сегментирования хвостовой мезодермы.
18 36 В туловищной мезодерме 34 сомита.
19 38 Хвостовая мезодерма содержит 4-5 сомитов.
20 40 Начало пульсирования сердца.
21 42 Хвостовая мезодерма содержит свыше 10 сомитов. Оболочки
ослаблены.
22 44 Зародыши импульсивно двигаются.
23 46 Стадия перед выклевом. Зародыши энергично двигаются. Голова
приподнята над желтком.
Часы ито Внешние отличительные признаки стадий зародышевого развития
24 48 Стадия выклева. Сердце слабо пульсирует. Кровь бесцветная, течет
слабо. Хвостовая мезодерма содержит 13 сомитов.
25 50 Вылупившиеся личинки свободно плавают у поверхности воды.
Для карпа (Cyprinus carpio, Linnaeus 1758) это стадия образования хвостовой почки [3], для радужной форели (Salmo gairdneri, Gibbons 1855) - стадия после образования глаз [9] и для данио рерио (Brachidanio rerio, Hamilton 1822) - стадии от образования 6 сомитов до стадии "бьющегося сердца" [19]. Поэтому эти стадии развития C. lalia могут быть использованы при исследовании влияния криопротекторов.
Рис. 2. Эмбрион C. lalia на стадии развития 8 бластомеров.
Рис. 3. Эмбрион C. \a\ia на стадии развития 10 ч. Бластодерма полностью обросла желток, в головном конце зародыша образовались мезодермальные валики. Начало образования сомитов.
Рис. 4. Эмбрион С. \a\ia на стадии развития 17 ч. В туловищной мезодерме до 32 пар сомитов. Хвост обособился от желтка. Хвостовая мезодерма начинает сегментироваться.
На стадии 24-25 ч развития наблюдались выклев и свободно плавающие личинки. На этих этапах заканчивается формирование внутренних органов эмбрионов. Вылупившиеся личинки плавают у поверхности воды (рис. 6).
Рис. 5. Эмбрион С. \a\ia на стадии развития 21 ч (хорион удален). В хвостовой мезодерме свыше 10 сомитов.
Рис. 6. Стадия развития С. \a\ia 25 ч от момента осеменения (свободно плавающая личинка).
Стадии, соответствующие 20-22 ч развития, характеризуются активацией движения эмбрионов внутри хориона (рис. 5). Зародыши интенсивно пигментированы. Считается, что поздние стадии развития у эмбрионов рыб более устойчивы к переохлаждению и воздействию криопротекторов [7]. На этих этапах развития эмбрионов отмечено успешное стеклование [8, 16], что потенциально приближает исследователей к методике замора -живания. Таким образом, C. lalia, имея достаточно короткий репродуктивный цикл и период эмбрионального развития, может быть успешно использован наряду с другими биологи -ческими объектами как лабораторная модель для криобиологических исследований.
Описание стадий эмбрионального развития C. lalia позволяет стандартизировать состояние эмбрионов на разных временных этапах в зависимости от температуры инкубации, выраженных в количестве т0.
Отмеченные характеристики основных периодов эмбрионального развития вида C. lalia позволяют использовать его как потенциальный объект в криобиологических исследованиях.
Для определения токсичности криопротекторов, влияния температуры инкубации и оптимизации процедур витрификации эмбрионов C. lalia целесообразно использовать поздние стадии их развития, описанные в данной работе.
1. Детлаф Т. А., Детлаф А. А. О безразмерных характеристиках продолжительности развития в эмбриологии / Т. А. Детлаф, А. А. Детлаф // Докл. АН СССР. — 1960. — Т. 134, № 1. — С. 199—202.
2. Миксон К. Б. Влияние компонентов криозащитной среды на эмбрионы вьюна (Misgurnus fossilis, L. 1758) / К .Б. Миксон, Е. Ф. Копейка, Г. С. Ишков // Вет. медицина. — 2008. — № 89. — С. 271—274.
3. A study on the cryopreservation of common carp (Cyprinus carpio) embryos / X. S. Zhang, L. Zhao, T. C. Hua [et al.] // Cryo-Letters. — 1989. — № 10. — P. 271—278.
4. Bart A. N. New approaches in cryopreservation of fish embryos / Bart A. N. // Cryopreservation in Aquatic Species. The World Aquaculture Society. — Louisiana : Baton Rouge, 2000. — P. 179—187.
5. Calvi S. L. Cryopreservation of rainbow trout blastomeres: influence of embryo stage on post-thaw survival rate / S. L. Calvi, G. Maisse // Cryobiology. — 1999. — № 36. — P. 255—262.
6. Calvi S. L. Cryopreservation of carp (Cyprinus carpio) blastomers / S. L. Calvi, G. Maisse // Aquatic Living Resources. — 1999. — № 12. — P. 71—74.
7. Dinnyes A. Chilling sensitivity of carp (Cyprinus carpio) embryos at different development stages in the presence or absence of cryoprotectants: work in progress / A. Dinnyes, B. Urbanyi, B. Baranyai // Theriogenology. — 1998. — Vol. 50. — P. 1—13.
8. El-Battawy K. A. Preleminary studies on cryopreservation of common tench (Tinca tinca) embryos (Work in progress) / K. A. El-Battawy, O.Linhart // Journal of Fisheries International. — 2008. — Vol. 3, № 1. — P. 12 — 18.
9. Haga Y. On the subzero temperature preservation of fertilised eggs of rainbow trout / Y. Haga // Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries. — 1982. — № 11. — P. 1569—1572.
10. Hagedorn M. Cryopreservation in aquatic species / M. Hagedorn, F. W. Kleinhans // Problems and prospects in cryopreservation of fish embryos. The World Aquaculture Society. — Louisiana: Baton Rouge, 2000. — P. 161—178.
11. Stages of embryonic development of the zebrafish / C. Kimmel, W. Ballard, S. Kimmel [et al.] // Develop. Dyn. — 1995. — № 203. — P. 253—310.
12. Liu K. C. Cryosurvival of goldfish embryo after subzero freezing / K. C. Liu, T. C. Chou, H. D. Lin // Aquatic Living Resources. — 1993. — № 6. — P. 63—66.
13. Miller R. J. Behavior and Phylogeny of Fishes of the Genus Colisa and the Family Belontiidae / R. J Miller., J. Ambrose // Behaviour. — 1983. — Vol. 83. — № 1—2. — P. 155—185.
14. Nilsson E. E. Cryopreservation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) blastomeres / E. E. Nilsson, J. G. Cloud. // Aquat. Living Resour. — 1993. — № 6. — P. 77—80.
15. Richter H.-J. Das Buch der Labyrinth-fische / H.-J. Richter — Leipzig: Neumann Verlag, 1979. — 164 p.
16. Robles V. Vitrification assays with embryos from a cold tolerant sub-arctic fish species / V. Robles, E. Cabrita, G. L. Fletcher // Teriogenology. — 2005. — Vol. 64, № 7. — P. 1633—1646.
17. Zhang T. T. Cryopreservation of Gametes and Embryos of Aquatic Species / T. T. Zhang // Life in the Frozen State.- London: Royal Free & University College Medical School, 2004. — P. 415 — 436.
18. Zhang T. T. Studies on chilling sensitivity of on zebrafish (Brachydanio rerio) / T. T. Zhang, D. M. Rawson // Cryobiology. — 1995. — № 32. — P. 239—246.
19. Zhang T. T., Rawson D. M., Morris G. J. Cryopreservation of pre-hatch embryos of zebrafish (Brachydanio rerio) / T. T. Zhang, D. M. Rawson, G. J. Morris // Aquatic Living Resources. — 1993. — № 6. — P. 145—153.
ЕМБР1ОНИ ЛЯЛ1УСА (COLISA LALIA, Hamilton 1822) - МОДЕЛЬНИЙ ОБ'СКТ ДЛЯ КРЮБЮЛОГ1ЧНИХ ДОСЛЩЖЕНЬ Míkcoh К.Б.
Дослiджували стадп ембрiонального розвитку лялiуса (Colisa lalia) вщ заплiднення iкринок до виходу личинок, як вiльно плавають. У процесi ембрiогенезу описано морфолопчш змiни, що вiдповiдають стадiям ембрюнального розвитку. Подана характеристика основних пер^в ембрiонального розвитку на рiзних етапах, яка виражалася в одиницях т0. У температурному дiапазонi 26-30 °С середовища шкубацп в значеннях т0 достовiрних вiдмiнностей не виявлено, тому цей дiапазон можна вважати зоною оптимальних температур ембрюнального розвитку цього виду. Загальний час ембрюнального розвитку вщ першого дтення до виходу з iкринок при температурi 28±0,2 °С складае 24 години (±1,0).
Ключовi слова: ембрiогенез, лялiус (Colisa lalia), морфологiчнi дослiдження.
DWARF GOURAMI (COLISA LALIA, Hamilton 1822) EMBRYOS AS MODEL FOR CRYOBIOLOGY RESEARCHES Mikson K.B.
The stages of embryonic development of dwarf gourami (Colisa lalia) from the moment of fertilisation to a stage of freely floating larvae were investigated. Morphological changes
corresponding to stages of embryonic development are described. The characteristic of the basic periods of embryonic development at different stages depending on temperature of incubation was expressed in terms of. In temperature range 26-30 °C the significant differences in t0 values were not observed. This temperature range was characterized as optimal for dwarf gourami embryos. The total time of embryonic development in range of optimal temperatures from first division to hatching stage at 28±0,2 °C is 24 hours (±1,0).
Key words: embryogenesis, dwarf gourami (Colisa lalia), morphological researches.
УДК 612.13:613.956:612.6.06:616-071.2
ВЗАеМОЗВ'ЯЗКИ АНТРОПО-СОМАТОТИПОЛОГ1ЧНИХ характеристик i РЕОГРАФ1ЧНИХ ПАРАМЕТР1В ЦЕНТРАЛЬНО! ГЕМОДИНАМ1КИ У М1СЬКИХ ЮНАК1В
Людину характеризуе велика мЫливють морфолопчних та фiзiологiчних ознак, i для визначення нормативних параметрiв серцево-судинноТ системи недостатньо вкових та статевих особливостей. Необхщно враховувати Ыдивщуальы особливост людини, в першу чергу, ТТ антропометричнi та соматотипологiчнi особливостi. У сучаснм лiтературi зустрiчаeться достатньо об'ективних пiдтверджень про взаемозв'язки окремих розмiрiв тiла та параметрiв серцево-судинноТ системи [1, 9, 10]. Встановлено, що у пщл^юв рiзноТ статi тотальн розмiри тiла мають сильнiший зв'язок з ехокардiографiчними параметрами (переважають сильн та середньоТ сили кореляцп), ыж парцiальнi (переважають середньоТ сили кореляцп); з парцiальних - найбiльш виражен зв'язки мають обхватнi та поперечн розмiри тiла; усi кореляцiйнi зв'язки е прямопропорцiйними [8]. Д. А. Василенко з ствавт. [3] виявили, що у дiвчаток мiж бтьш^ю амплiтудних i часових показникiв реоенцефалограми i антропометричними та соматотипологiчними показниками (за винятком: товщини шюрно-жирових складок, ендоморфного i ектоморфного компоненпв соматотипу, а також жировоТ маси тта, де встановленi достовiрнi зворотн слабкi i середньоТ сили (г вщ -0,21 до -0,54) зв'язки) переважають достовiрнi прямi слабкi (г вщ 0,20 до 0,29) кореляцмы зв'язки; у хлопчикiв - переважають достовiрнi зворотнi середньоТ сили (г вщ -0,31 до -0,55) кореляцмы зв'язки. Не зважаючи на безсумывы успiхи, якi досягнутi за останн роки, стосовно вивчення кореляцiй мiж зовнiшнiми особливостями тiла людини та морфо-функцюнальними параметрами серцево-судинноТ системи оаб певного вiку, статi, етнотериторiальноТ та со^ально-побутовоТ належностi, питання, що стосуються особливостей взаемозв'язюв
