CC BY
152
УДК 543.422.3:615.322
Н. А. Коваленко, кандидат химических наук, доцент (БГТУ);
Г. Н. Супиченко, кандидат химических наук, ассистент (БГТУ);
В. Н. Леонтьев, кандидат химических наук, доцент, заведующий кафедрой (БГТУ);
О. В. Стасевич, кандидат химических наук, старший преподаватель (БГТУ)
ЭЛЕКТРОННЫЕ СПЕКТРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ ЭКСТРАКТОВ ТРАВЫ ЗВЕРОБОЯ
Изучены электронные спектры поглощения экстрактов различных видов зверобоя из коллекции Центрального ботанического сада НАН Беларуси. Показано, что характер электронных спектров поглощения экстрактов существенно зависит от природы растительного сырья, температуры, полярности растворителей и рН среды. Выявлено, что наиболее перспективным отечественным растительным сырьем является зверобой продырявленный. Оптимизированы условия экстракционного выделения гиперицина из травы зверобоя продырявленного, включающие температурный режим и рН среды. На основании спектральных исследований показано, что наибольшая степень извлечения гиперицина достигается при использовании этанола и ацетона.
In this study electronic absorption spectra of extracts of St. John's Wort from the collection of Central Botanical Garden of the Belarusian NAS have been investigated. It has been shown that the character of electronic absorption spectra essentially depends on the nature of plant material, temperature, polarity of solvents and pH value of medium. The Hypericum perforatum was found to be the most prospective home plant material. The optimal conditions of hypericin extraction from St. John's Wort, including temperature mode and pH value have been established. On the basis of the obtained spectral data, ethanol and acetone have been shown to be the best extractants for isolation of a hypericin.
Введение. Перспективным и активно развивающимся методом лечения злокачественных новообразований является фотодинамическая терапия. Для успешной реализации фотодинамической терапии онкологических заболеваний необходимо сочетание лазерного облучения и эффективных фотосенсибилизаторов. Основные требования к фотосенсибилизаторам включают в себя высокую селективность к раковым клеткам, низкую токсичность, способность легко выводиться из организма, высокий квантовый выход триплетного состояния с энергией не менее 94 кДж/моль. Большое значение при выборе фотосенсибилизатора имеет также наличие интенсивного поглощения в красной и ближней ИК области спектра.
В современной медицинской практике наблюдается тенденция к расширению использования фитопрепаратов для лечения и профилактики различных заболеваний, поскольку лекарственные средства на растительной основе сочетают в себе широту и мягкость терапевтического действия с отсутствием значительного числа побочных эффектов. По литературным данным, основными источниками получения растительных препаратов фотосенсибилизи-рующего действия являются лекарственные растения, содержащие производные кумарина и антрахинона. Среди растений, произрастающих на территории Республики Беларусь, наиболее перспективными для извлечения высокоэффективных фотосенсибилизаторов являются различные виды зверобоя, содержащие гиперицин и его производные. Известно [1], что гиперицин
обладает достаточно высокой избирательностью к раковым клеткам, не оказывает влияния на нормальные пролиферирующие клетки и быстро выводится из организма. Поэтому оптимизация условий выделения гиперицина из отечественного растительного сырья некоторых представителей рода Hypericum (семейство Hypericaceae) является актуальной задачей.
Для идентификации и определения гипери-цина в растительных извлечениях применяются различные методы анализа [1-4], однако наиболее доступным и информативным является спектрофотометрический метод. В этой связи изучение спектральных характеристик экстрактов травы зверобоя, различающихся условиями проведения экстракции, представляет научный и практический интерес.
Основная часть. Объектами исследования являлись этанольные экстракты зверобоя продырявленного Hypericum perforatum L., зверобоя олимпийского Hypericum olympicum L., зверобоя густоцветкового Hypericum densiflorum L. из коллекции Центрального ботанического сада НАН Беларуси. Сбор растений осуществляли в фазу цветения растений в период с июня по август 2012 г. с соблюдением общих правил сбора для этого лекарственного сырья [5]. Воздушно-сухое растительное сырье измельчали до размера частиц 1 мм. Для извлечения гипе-рицина из фитомассы использовали водно-этанольные растворы с массовой долей этанола 50 мас. %. Экстракцию проводили при комнатной температуре при непрерывном перемешивании в течение 1 ч без доступа дневного света.
Электронные спектры поглощения записывали в диапазоне 400-1100 нм (шаг длины волны 0,1 нм) на приборе Specord-200 в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Температурный интервал составлял 5-65°С с шагом 10°С.
В экспериментах по влиянию полярности растворителя этанольные экстракты подвергали вакуумированию до полного удаления этанола, а твердый остаток растворяли в растворителях различной полярности. Диэлектрическая проницаемость растворителей варьировалась от 2,20 до 78,3.
Для изучения влияния кислотности среды проводили запись электронных спектров поглощения экстрактов в интервале значений рН = 2,0-11,0 с интервалом 0,1. Для доведения рН экстрактов до заданного значения использовали водные растворы NaOH и HCl. Контроль рН осуществляли с помощью рН-метра Hanna HI 8314.
На рис. 1 представлен электронный спектр стандартного образца гиперицина в метаноле. Спектр поглощения гиперицина в УФ области содержит полосы с максимумами около X « 280 (белковая полоса) и 330 нм. В видимой области спектра наблюдается широкое плато в интервале длин волн 400-500 нм и присутствуют полосы с максимумами при X « 547 и 590 нм, причем последняя полоса является наиболее интенсивной. На основании анализа литературы [3] и полученных нами спектральных данных именно эта полоса поглощения с максимумом при X = (590 ± 1) нм принята в качестве аналитической длины волны гиперицина в экстрактах зверобоя.
u -О о
и
Л
ч
(D
н s
о о и н О
(D
S
и
(D
а
о
ч
L-
о a
215.45
200 225 250 275 300 325 350 315 400 425 450 «5 500 525 550 5^5 600
Длина волны, нм
Рис. 1. Электронный спектр стандартного образца гиперицина в метаноле
Для скрининга растительного сырья представителей рода Hypericum, произрастающих на территории Республики Беларусь, были получены этанольные экстракты из различных видов зверобоя и сняты их электронные спектры поглощения. Фрагменты электронных спектров поглощения полученных экстрактов в видимом интервале длин волн приведены на рис. 2.
л н о о и н о
W о
(D
Ё о
0,2 -
0
540
590
Рис
640 690
Длина волны, нм 2. Фрагмент спектров поглощения экстрактов из различных видов зверобоя
Сравнение интенсивности полос поглощения исследованных образцов при X « 590 нм показывает, что экстракт зверобоя продырявленного содержит наибольшее количество гиперицина (рис. 2, кривая 1). Концентрация ги-перицина в экстракте зверобоя олимпийского практически на порядок ниже (рис. 2, кривая 2), чем в Hypericum perforatum. В экстракте зверобоя густоцветкового гиперицин присутствует в следовых количествах (рис. 2, кривая 3).
Таким образом, наиболее перспективным растительным материалом для выделения гипе-рицина является трава зверобоя продырявленного. Поэтому последующие спектральные исследования проводили только с экстрактом Hypericum perforatum L.
На рис. 3 приведен типичный электронный спектр поглощения этанольного экстракта зверобоя продырявленного.
240 340 440 540
Длина волны, нм
Рис. 3. Электронный спектр поглощения экстракта зверобоя
Сопоставление электронных спектров стандартного образца гиперицина и экстракта свидетельствует о наличии общих полос поглощения. Гиперицин в экстракте проявляется в виде полос поглощения с максимумами X « 550 и 590 нм, однако их интенсивность значительно ниже по сравнению со стандартным образцом. Следует отметить, что оптическая плотность экстракта в УФ области существенно превышает таковую в спектре стандартного образца
5
гиперицина. По видимому, поглощение в УФ области спектра образцов экстрактов связано с наложением полос поглощения как гиперици-на, так и сопутствующих соединений, присутствующих в этанольных экстрактах Hypericum perforatum.
Известно [1], что положение максимума и интенсивность полос поглощения природных пигментов в существенной мере зависит от ряда факторов, важнейшими из которых являются природа растворителя, рН среды и температура.
Температурная зависимость спектра поглощения экстракта зверобоя в видимой области приведена на рис. 4.
мума поглощения (X « 590 нм) экстракта зверобоя от полярности растворителя.
Влияние природы растворителя на спектральные характеристики экстрактов зверобоя
Растворитель е Xmax, нм A
Эфир диэтиловый 4,22 591,7 0,051
Этилацетат 6,00 595,7 0,047
Изо-амиловый спирт 14,70 593,4 0,238
Ацетон 20,74 597,2 0,265
Этиловый спирт 25,80 592,0 0,660
Муравьиная кислота 57,90 578,9 0,432
Вода 78,30 600,2 0,141
0,8
0,6
0,4
0,2
0
520
- 5
- 15
- 25
- 35
- 45
- 55
- 65
540
560 580 600 620 Длина волны, нм
Рис. 4. Влияние температуры на электронный спектр экстракта зверобоя (рН = 5,7)
Из представленных данных видно, что зависимость носит экстремальный характер. Поскольку содержание гиперицина в исходных этанольных экстрактах было одинаковым, то наблюдаемые спектральные различия при варьировании растворителя связаны как с электронным состоянием самого гиперицина, так и с его различной растворимостью. В этаноле или ацетоне, имеющих близкие значения диэлектрической проницаемости, гиперицин хорошо растворим и находится в мономерной солевой форме. Резкое снижение оптической плотности гиперицина в спектре водного раствора обусловлено низкой растворимостью гиперицина в воде [6].
Видно, что нагревание экстракта приводит к снижению интенсивности поглощения во всем исследуемом интервале длин волн. Наиболее заметное снижение интенсивности поглощения наблюдается в области полосы 590 нм за счет увеличения степени разложения гиперицина.
С целью установления оптимальных условий экстрагирования гиперицина из травы зверобоя было изучено влияние полярности растворителя на спектральные характеристики экстрактов. Значения диэлектрической проницаемости растворителей составляли от 4,22 до 78,30. Анализ полученных спектральных данных показал, что изменение полярности растворителя приводит не только к изменению интенсивности аналитической полосы поглощения гиперицина (X и (590 ± 1) нм), но и к смещению ее максимума в длинноволновую или коротковолновую области.
В таблице приведены данные по влиянию диэлектрической проницаемости растворителей на величину оптической плотности экстрактов зверобоя при длине волны, соответствующей максимуму светопоглощения при длине волны X и 590 нм.
На рис. 5 приведена зависимость величины оптической плотности при длине волны макси-
л н о о и н о ч а
w
о
(D
S Ё о
0,6 0,4 0,2 0
0 20 40 60 80
Диэлектрическая проницаемость Рис. 5. Влияние полярности растворителя на оптическую плотность экстракта зверобоя при X и 590 нм
Использование в качестве растворителя муравьиной кислоты приводит к аналогичным спектральным изменениям. В спектре наблюдается снижение оптической плотности при аналитической длине волны гиперицина (X и 590 нм) за счет уменьшения растворимости гиперицина в кислой среде. Наблюдаемое смещение максимума полосы поглощения при X и 590 нм в область более коротких длин волн связано с образованием протонированных форм гиперицина [6].
Подтверждением полученных результатов являются данные по влиянию кислотности
среды на спектральные характеристики экстрактов зверобоя. На рис. 6 (а и б) приведены спектры поглощения экстрактов при варьировании рН от 2,3 до 11,2.
1,2
S л
1 S
a g 0,8
s н
I §
5 0,4
рН=5,37 рН=5,00 рН=3,96 рН=3,16 рН=2,26
530
550
570 590 610 Длина волны, нм
н а О
1,2 -
0,8
0,4
0
рН=7,6 рН=9,0 рН=10,6
530 550
570 590 610 Длина волны, нм
б
Рис. 6. Влияние кислотности среды на электронные спектры поглощения экстракта зверобоя
Из представленных данных видно, что в кислых растворах (рН = 2,26) интенсивность полосы поглощения при X « 590 нм мала и увеличивается при повышении рН до 5,37 единиц (рис.6, а). Наблюдаемые спектральные изменения связаны с образованием в кислых растворах преимущественно протонированных форм гиперицина, а также с понижением его растворимости. При повышении рН экстрактов от 5,4 до 9,0 оптическая плотность практически не изменяется (рис. 6, б). По литературным данным [6], в слабощелочных растворах образуются мономерные солевые формы гиперицина, хорошо растворимые в воде. Дальнейшее повышение рН среды сопровождается некоторым снижением интенсивности аналитической полосы поглощения гиперицина.
Заключение. Таким образом, наиболее перспективным из исследованного нами растительного сырья отечественного происхождения, пригодного для извлечения гиперицина, являются растения Hypericum perforatum L. Проведенные спектральные исследования позволили установить предпочтительные условия проведения экстракции гиперицина из травы зверобоя. Извлечение гиперицина необходимо проводить при комнатной температуре, с применением экстрагирующих систем, включающих ацетон или этанол. Интервал значений рН должен составлять 5,4-9,0.
Литература
1. Karioti, A. Hypericins as potential leads for new therapeutics / A. Karioti, A. R. Bilia // Int. J. Mol. Sci. - 2010. - Vol. 11. - P. 562-594.
2. Mauri, P. High perfomance liquid chroma-tography/electrospray mass spectrometry of Hypericum perforatum extracts / P. Mauri, P. Pietta // Rapid. Commun. Mass. Spectrom. - 2000. -Vol. 14. - P. 95-99.
3. Правдивцева, О. Е. Сравнительное исследование химического состава надземной части некоторых видов рода Hypericum L. / О. Е. Правдивцева, В. А. Куркин // Химия растительного сырья. - 2009. - № 1. - С. 79-82.
4. Identification by high-perfomance liquid chromatography-diode array detection-mass spect-rometry and quantification by high-perfomance liquid chromatography-UV absorbance detection of active constituents of Hypericum perforatum / M. Brolis [et al.] // J. Chromatogr., A. - 1998. -Vol. 825. - P. 9-16.
5. Островок здоровья. Правила сбора, сушки и хранения лекарственных трав [Электронный ресурс]. - 2008. - Режим доступа: http://bonoesse.ru/ blizzard/RPP/O/Herba/sbor_hran.html. - Дата доступа: 24.01.13.
6. Ломовский, И. О. Исследование механо-химической активации гиперицина в составе травы зверобоя спектролюминесцентным методом / И. О. Ломовский // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: материалы V Всероссийской конф., 24-26 апр. 2012 г. / под ред. Н. Г. Базарновой, В. И. Маркина. - Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2012. - 533 с.
Поступила 01.03.2013
0
а
