CC BY
127
УДК 661.123
О. В. Стасевич, аспирант; С. Г. Михаленок, доцент
ЭКСТРАКЦИОННЫЕ СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИГНАНСОДЕРЖАЩИХ КОМПОЗИЦИЙ ИЗ СЕМЯН ЛЬНА МАСЛИЧНОГО
Three methods of receiving of secoisolariciresinol diglucoside (SDG) extract from flaxseed using microwave-assisted extraction were performed. The first method included the using of 50% aqua’s ethanol as a solvent for extraction with sequential alkaline hydrolysis. The second one included the using of 50% aqua’s ethanol as a solvent for extraction witch was grouped with simultaneous alkaline hydrolysis. The third method included the extraction in the aqua’s environment during simultaneous alkaline hydrolysis. The microwave treatment was spent during 5 minutes with the 150 W power of energy. The best results were achieved by the using of second method. The yield of SDG extract achieved by this method was 23,2%, the content of SDG in defatted seeds was 24,5 mg/g. The conditions for subjecting the received extract thin-layer chromatography analysis were worked out.
Введение. Семена льна масличного (Linum usitatissimum) в последние годы все шире используются в продовольственных, диетических и лечебных целях. Они содержат: 41% жиров, 28% диетической клетчатки, 21% протеина, 6% углеводов (сахара, ароматические кислоты, лигнин и гемицеллюлоза) и 4% золы [1]. Каждый из указанных компонентов влияет на пищевую, диетическую, лечебную и иную ценность льняного семени. В последнее время интерес к льняному семени возрос благодаря обнаружению в нем новых биологически активных соединений - лигнанов, обширной группы фенольных соединений растительного происхождения. Лигнан (+)-[2^,2'^]-бис-
[(4-гидрокси-3-метоксифенил)-метил]-1,4-бу-тандиил-бисф-глюкопиранозид), или диглюко-зид секоизоларицирезинола (SDG) (рис. 1), обнаруживается в семенах льна в наибольшем количестве по сравнению с другими минорными лигнанами [2]. Причем, в семенах некоторых сортов льна масличного удельное содержание SDG составляет 1-2%, тогда как в семенах сои и зерновых культур его уровень не превышает 0,002 и 0,001% соответственно. В пределах одного сорта содержание лигнанов также сильно зависит от места произрастания и условий выращивания [3].
Рис. 1. Структура диглюкозида секоизоларицирезинола (800)
Установлено, что физиологическое значение лигнана для самого растения заключается в защите от вредного воздействия ультрафиоле-
тового излучения, поражения грибами и другими паразитами, поэтому максимальное содержание этого вещества в семенах приходится на оболочки. 800 также обладает антивирусным и бактерицидным действием. Именно благодаря совокупности этих свойств и в связи с выявленной способностью ингибировать ряд ферментов он проявляет себя как противоопухолевое средство, которое может применяться при профилактике и лечении онкологических заболеваний. В первую очередь это относится к заболеваниям, затрагивающим половую сферу (рак молочной железы, рак шейки матки, рак простаты) [4].
Основная часть. Цель данного исследования - разработать экстракционный способ получения 8Б0-содержащего экстракта из семян льна масличного. Общая схема, которой мы придерживались, включает в себя до 5 стадий [3]:
1) обезжиривание (семян/оболочек семян);
2) экстракция;
3) гидролиз;
4) нейтрализация;
5) концентрирование экстракта.
Так как основная масса 800 локализована в оболочках семян, то в первую очередь было проведено их отделение от семядолей и механическое измельчение. Полученную фракцию обезжиривали гексаном в течение 4 ч. Затем обезжиренные оболочки подвергались стадиям экстракции и гидролиза. Именно качество проведения этих стадий наибольшим образом влияет на выход экстракта и на содержание 800 в нем. Поэтому прежде чем разработать наиболее эффективный способ проведения экстракции и гидролиза, были проанализированы ранее проведенные исследования в этом направлении [3, 5-9].
В табл. 1 обобщены методики, в которых достигалось наибольшее содержание 800 в экстракте на обезжиренное сырье. Применение систем диоксан - этанол и метанол - вода позволяет достигнуть удовлетворительного содержания 800 в экстракте, но из-за высокой токсичности диоксана и метанола эти методы не достаточно безопасны для реализации.
Таблица 1
Сравнение способов получения 8БС-содержащего экстракта
Соотношение количеств сырья и экстрагента, г/мл Условия проведения процесса Содержание 800 в экстракте в расчете на обезжиренное сырье, мг/г
Экст] я и ц акц О Гидролиз
Параметры проведения (время, температура) Экстраги- рующий агент Гидролизующий агент Параметры проведения (время, температура)
1 : 8 48 ч, 60°С Диоксан : 95%-ный этанол (1 : 1) Водный КаОИ, рН = 10 48 ч, 25°С 11,7
1 : 20 3 ч, 60°С 70%-ный водный метанол Водный КаОИ, рН = 10 3 ч, 25°С 12,9
1 : 6 24 ч,25°С 70%-ный водный этанол Водный КаОИ, рН = 10 4 ч, 50°С 20,0
Экстракция совместно с гидролизом
1 : 10 №ОИ 50%-ный водный этанол, рН = 10 1 ч, 50°С 30
1 : 50 Водный КаОИ, рН = 10 1 ч, 25°С 11,8
1 : 4 Водный КаОИ, рН = 10 19 ч, 25°С 45,8
Поэтому при выборе экстрагента мы предпочли наиболее экологически безопасный растворитель водный этанол; кроме того, водноспиртовая система дает возможность избавиться уже на стадии экстракции от нежелательных цианогенных гликозидов, присутствующих в льняном семени. Выбор 50%-ного водного этанола также обосновывается большим содержанием 800 в полученном экстракте по сравнению с использованием 70%-ного этанола. Способы экстракции, в которых в качестве экстрагента используется водная щелочь, также позволяют получать фракции с высоким содержанием 800, но они требуют либо больших затрат времени, либо большого избытка растворителя по отношению к сырью, что увеличивает продолжительность и энергоемкость процесса на стадии концентрировании экстракта.
Особый интерес, с точки зрения решения проблемы повышения эффективности экстракции биологически активных веществ из растительного сырья, представляют методы с использованием микроволнового излучения. Использование микроволновой энергии дает возможность сократить расход экстрагента, а также продолжительность процесса за счет быстрого нагрева, разрыхления межмолекулярных связей полимеров и соответственно большей доступности компонентов экстрагируемого материала молекулам растворителя [10].
В соответствии с проведенным анализом нами было предложено и апробировано три способа получения 800-содержащего экстракта:
1) экстракция 50%-ным водным этанолом в течение 15 мин при воздействии микроволно-
вого излучения с мощностью 150 Вт с последующим щелочным гидролизом;
2) экстракция 50%-ным водным этанолом в течение 15 мин при воздействии микроволнового излучения мощностью 150 Вт с совмещенным процессом щелочного гидролиза.
3) экстракция в водной среде в течение 15 мин при воздействии микроволнового излучения мощностью 150 Вт с совмещенным процессом щелочного гидролиза.
Время и мощность микроволнового воздействия также определялись в соответствии с тем, чтобы избежать разложения 800.
Несмотря на то что 800 достаточно термостабилен при кратковременном воздействии температуры [11], его выход значительно снижается при продолжительном времени проведения микроволновой экстракции из-за процессов каталитической деструкции, имеющих место в растительном матриксе [12].
Результаты проведения экстракции различными методами приведены в табл. 2.
Из представленных данных видно, что наибольший выход экстракта, а также наибольшее содержание в нем 800 достигается при совмещении процессов гидролиза и экстракции вод-но-этанольной смесью.
При проведении экстракции водным этанолом с последующим гидролизом также получен экстракт с высоким содержанием 800 и удовлетворительным выходом экстрактивных веществ, что делает этот способ приемлемым для использования.
В случае экстракции, совмещенной с гидролизом в водной среде, был получен экстракт с наименьшим содержанием 800.
Таблица 2
Результаты проведения экстракции при использовании микроволнового излучения
Соотношение количеств сырья и экстрагента, г/мл Условия проведения процесса Выход экстрактивных веществ на обезжиренное сырье, % Содержание в экстракте в расчете на обезжиренное сырье, мг/г
Экстракция Гидролиз
Время проведения опыта, мощность микроволнового излучения Экстра- гирую- щий агент Гидроли- зующий агент Время проведения опыта, мощность микроволнового излучения
1 : 10 7,5 мин, 150 Вт 50%-ный водный этанол Водный №ОН, рН = 10 7,5 мин, 150 Вт 18,6 8,9
Экстракция совместно с гидролизом
1 : 10 №ОН 50%-ный водный этанол, рН = 10, 15 мин, 150 Вт 20,2 10,2
1 : 10 Водный №ОН, рН = 10, 15 мин, 150 Вт 16,7 7,8
Данные результаты можно объяснить тем, что выход при проведении экстракции, сопровождаемой облучением микроволновой энергией, в большой степени зависит от концентрации этанола в воде. Ранее было показано [13], что наибольший выход в экстракте наблюдается, когда в экстракционной смеси концентрация этанола находится в пределах от 40 до 50%. Это можно объяснить сольватационной способностью и диэлектрическими свойствами растворителя. И этанол, и вода - хорошие экстрагенты для 8БО, тогда как вода является еще и отличным абсорбером микроволновой энергии.
Для качественного и количественного анализа полученных экстрактов использовали методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и тонкослойной хроматографии (ТСХ). ВЭЖХ является дорогостоящим методом, поэтому для многократных и рутинных определений качественного состава экстракта был выбран метод тонкослойной хроматографии. Качественный анализ состава экстракта осуществляли методом ТСХ на пластинах «Ю8е^е1 60 Б254». Для этого был произведен подбор элюирующей системы, которая позволяла бы четко разделять компоненты системы, а также с точностью идентифицировать наличие в смеси (экстракте).
Были подобраны и проанализированы следующие системы:
1. Хлороформ : этанол : вода (6 : 7 : 0,5) -при использовании этой системы имело место нечеткое разделение компонентов системы (дистанция между компонентами системы была недостаточной для их идентификации).
2. Этилацетат : этанол : муравьиная кислота : вода (77 : 13 : 5 : 10) - при использовании
этой системы имело место удовлетворительное разделение компонентов системы, но пятна компонентов были размыты, что не дало возможность их четко идентифицировать.
3. Вода : пропанол-2 : водный амми-
ак (1 : 8 : 1) - при использовании этой системы наблюдалось четкое разделение компонентов системы, а также при УФ-облучении фиксировавли специфическую бриллиантово-синюю флюоресценцию пятна, принадлежащего именно диглюко-зиду секоизоларицирезинола, что дало возможность четко идентифицировать данный лигнан.
4. С применением элюирующих систем хлороформ : ацетон : муравьиная кислота (75 : 16,5 : 8,5), хлороформ : метанол (9 : 1), хлороформ: ацетон (65 : 35) разделение компонентов вообще не наблюдалось.
Результаты подбора элюирующей системы и Rf значения для в различных условиях
представлены в табл. 3 и на рис. 2.
Таблица 3 Условия и результаты проведения тонкослойной хроматографии
Эюирующая система Окраска пятна при УФ-облучении
А. Вода : пропанол-2 : водный аммиак (1 : 8 : 1) Бриллиантовосиняя с флюоресценцией 0,24
Б. Хлороформ : этанол : вода (6 : 7 : 0,5) Фиолетовая без флюоресценции 0,23
В. Этилацетат : этанол : муравьиная кислота : вода (77 : 13 : 5 : 10) Фиолетовая без флюоресценции 0,12
\ l> В
1 2 1 2 2 1
Рис. 2. ТСХ-хроматограммы экстракта и SDG в различных элюирующих системах:
А - вода : пропанол-2 : водный аммиак (1 : 8 : 1);
Б - хлороформ : этанол : вода (6 : 7 : 0,5);
В - этилацетат : этанол : муравьиная кислота : вода (77 : 13 : 5 : 10); 1 - стандарт SDG;
2 - полученный SDG содержащий экстракт
Заключение. Таким образом, был разработан эффективный способ экологически безопасного получения SDG-содержащего экстракта с высоким содержанием в нем SDG, а также разработана методика для проведения качественного анализа SDG-содержащих экстрактов методом тонкослойной хроматографии.
Литература
1. Зубцов, В. А. Льняное семя, его состав и свойства / В. А. Зубцов, Л. Л. Осипова, Т. И. Лебедева // Журн. Рос. хим. о-ва им. Д. И. Менделеева. - 2002.- № 2.- С. 14-16.
2. On-line liquid-chromatography-nuclear magnetic resonance spectroscopy-mass spectrometry coupling for the separation and characterization of secoisolariciresinol diglucoside isomers in flaxseed / J. Fritsche [et al.] // Journal of Chromatography A. - 2002. - Vol. 972. - P. 195-203.
3. HPLC method for аnalysis of secoisolarici-resinol diglucoside in flaxseeds / P. Johnsson [et al.] // J. Agric. Food Chem. - 2000. - Vol. 48. - P. 5216-5219.
4. Flaxseed lignan in decrease prevention and health promotion / Neil D. Westcott [et al.] // Phytochemistry Revies. - 2003. - Vol. 2. - P. 401-417.
5. A Dry Mechanical Method for Concentrating the Lignan Secoisolariciresinol Diglucoside in Flaxseed / B. Madhusudhan [et al.] // Le-bensm.-Wiss. u. - Technol. - 2000. - Vol. 33. -P.268-275.
6. Process for producing sdg and foods and drinks containing the same pat. US 20050158435A1 A23P 1/00 // Keiichi Abe, Taeko Iino, Wataru Fujii, Yoshinide Suwa; assignee Sun-tory Limited, Osaka (JP). - Appl. № 10/507,127; filed 11.03.2003; pub. date 27.07.2005.
7. Process for extracting lignans from flaxseed US 005705618A C07G 1/00, C08L 97/00 / Neil D. Westcott, Alister D. Muir; assignee Agriculture and Agri-Food Canada, Ottawa, Canada - Appl. № 415,050; filed 31.03.1995; pub. date 06.01.1998.
8. High-performance liquid chromatographic analysis of secoisolariciresinol diglucoside and hydroxycinnamic acid glucosides in flaxseed by alkaline extraction / C. Eliasson [et al.] // Journal of Chromatography A. - 2003. - Vol. 1012. -P.151-159.
9. Dietary secoisolariciresinol diglucoside and its oligomers with 3-hydroxy-3-methyl glutaric acid decrease vitamin E levels in rats / J. Frank [et al.] // British Journal of Nutrition. - 2004. -Vol. 92. - P. 169-176.
10. Comparison of microwave-assisted extraction and Soxhlet extraction for phenols in soil samples using experimental designes / A. Egizabal [et al.] // Analyst. - 1998. - Vol. 123. - P. 16791684.
11. Westcott, Neil D. Quantitation of the lignan secoisolariciresinol diglucoside in baked goods containing flax seed or flax meal / Neil D. West-cott, Alister D. Muir // J. Agric. Food Chem. -2000. - Vol. 48. - P. 4048-4052.
12. Letellier, M. Microwave-assisted extraction of organic compounds / M. Letellier, H Budzinski // Analyst - 1999. - Vol. 27. - P. 259-271.
13. Microwave-assisted extraction of the main phenolic compounds in flaxseed / V. Beejmohun [et al.] // Phytochem. Anal. - 2004. - Vol. 92. -P.169-176.
