CC BY
92
УДК 613.98, 612.67/68, 612.017.1
ЭКСПРЕССИЯ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ - РЕГУЛЯТОРОВ АПОПТОЗА В ПЛАЦЕНТЕ У ЖЕНЩИН РАЗНОГО ВОЗРАСТА
ЕА Лапина1, Н.С. Линькова,
А.О. Дурнова, В.О. Полякова2 ,
НА Пальченко, А.В. Костылев , С.С. Коновалов3, И.М. Кветной
1 Международный центр репродукции человека
г. Санкт-Петербург
2 НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта
СЗО РАМН
г. Санкт-Петербург
3 Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН
г. Санкт-Петербург e-mail: [email protected]
В статье впервые рассматривается вопрос о старении плаценты с точки зрения усиления апоптоза, который является универсальным проявления инволюции в различных органах и тканях. Показано, что у женщин старшего репродуктивного возраста, в особенности после 40 лет усиливается экспрессия проапоптотического белка р53. В то же время показано, что у женщин старше 35 лет возрастает экспрессия антиапоптотического белка Мс1-1, что свидетельствует о развитии компенсаторно -
приспособительных механизмов.
Ключевые слова: плацента, апоптоз, р53, Mcl-1,
старение.
Усиление апоптоза является одним из основных проявлений возрастной инволюции различных органов и тканей. Поскольку в плаценте были обнаружены признаки старения, характерные и для других тканей [1], представляется возможным утверждать, что апоптоз играет важную роль в поддержании морфофункционального состояния плаценты как в норме, так и при ее инволюции.
Интенсивность апоптоза зависит от восприятия множества вне- и внутриклеточных сигналов, интеграции и амплификации этих сигналов вторичными мессенжерами и, наконец, активации протеаз, непосредственно вызывающих гибель клетки [8-10].
Основной функциональной единицей зрелой плаценты человека служат терминальные ворсины, состоящие из стромы с кровеносными сосудами и хориального эпителия, представленного в доношенной плаценте синцитиотрофобластом [3-4]. Хориальный эпителий является наиболее метаболически активной тканью плаценты, именно здесь происходит синтез и обмен многих жизненно важных веществ. В третьем триместре беременности синцитиотрофобласт значительно истончается, образуются синцитиокапилярные мембраны, а цитотрофобласт почти полностью исчезает [4]. Число клеток, подвергшихся апоптозу в третьем триместре, значительно выше, чем в первом. По некоторым данным, апоптоз синцитиотрофобласта является одним из факторов, приводящих к деградации синцития [8].
В регуляции клеточного цикла участвует белковый продукт гена опухолевого супрессора р53. Включение гена р53 может привести к аресту клеточного цикла, следствием которого является репарация ДНК или апоптоз [10]. Взаимодействуя со многими клеточными белками, р53 формирует комплекс, который является критичным для контроля клеточного цикла, регуляции генов, процессов дифференцировки, апоптоза и опухолевой супрессии. В плаценте ген р53 экспрессируется в цито- и синцитиотро-фобласте, в клетках базальной пластинки, тогда как в стороме и эндотелии экспрессии данного белка не наблюдается. Высокая экспрессия р53 верифицирована во внутренних слоях цитотрофобласта и в колоннах клеток цитотрофобласта, в синцитии экспрессия несколько ниже [10].
На ранних этапах роста и развития плаценты в цитотрофобласте запускается апоптозный каскад, который препятствует слиянию клеток в синцитий. Включению этого каскада противодействуют белковые продукты генов Вс1-2 и Мс1-1, экспресси-
рующиеся в синцитиотрофобласте [9]. Белковый продукт гена Мс1-1 блокирует апоп-тоз, вызываемый различными эндо- и экзогенными факторами.
Таким образом, гены и их белковые продукты р53 и Мс1-1 вовлечены в регуляцию процессов дифференцировки и пролиферации структурных элементов плаценты.
Материал и методы. Для проведения оценки степени экспрессии р53 и Мс1-1 использовались образцы 10 доношенных плацент, полученных при родах в НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН у женщин различного возраста как с нормально протекающей беременностью, так и с различными осложнениями. Кусочки плацент фиксировались в 4% нейтральном формалине (рН 7,0-7,2). Проводка и заливка материала в парафин осуществлялась согласно общепринятым гистологическим методикам. На стекла, предварительно обработанные адгезивом, наносились срезы толщиной 5 мкм. Для детекции белковых продуктов р53 и Мс1-1 использовался авидин-биотиновый иммуно-пероксидазный метод.
После депарафинизации и дегидротации срезы помещались в 3% раствор перекиси водорода для блокирования эндогенной пероксидазы, а затем промывались дважды в дистиллированной воде и трис-НС1-буфере (рН 7,6). Для оптимизации условий проведения реакции и минимизации фоновой окраски для антител к р53 после депа-рафинизации использовали высокотемпературную демаскировку в цитратном буфере. После промывок на срезы наносили по 50 мкл нормальной, не иммунной, сыворотки и инкубировали во влажной камере в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем стряхивали сыворотку с препаратов и наносили по 50 мкл первых (специфичных) антител, разбавленных концентрированным раствором трис-НС1-буфера в соотношении 1:100, и инкубировали при +37°С в течение 1 часа. После инкубации срезы дважды промывали в рабочем растворе трис-НС1-буфера и инкубировали со вторыми биотини-лированными антителами в течение 30 минут при комнатной температуре. Препараты дважды промывали в рабочем растворе трис-НС1-буфера и инкубировали с авидин-биотин-пероксидазным комплексом в течение 30 минут, после чего срезы промывали в рабочем растворе трис-НС1-буфера и производили детекцию пероксидазы хрена диа-минобензидином. После выявления реакции с ДАБ препараты дважды промывали в воде и дегидротировали, а затем заключали в бальзам.
Анализ препаратов проводили с помощью системы анализа микроскопических изображений №коп и программы обработки микроскопических изображений ВидеоТест. Для каждого образца проводили измерение оптической плотности и площади экспрессии исследуемых маркеров на 5 терминальных ворсинах хориона плаценты. Статистическая оценка полученных результатов проводилась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.
В ходе проведения исследования были сформированы следующие возрастные группы женщин: 1 группа — беременные до 18 лет; 2 группа — от 18 до 28 лет, 3 группа — от 29 до 35 лет, 4 группа - от 36 до 40 лет и 5 группа - старше 40 лет. Группой сравнения нами были выбраны женщины от 18 до 28 лет.
Для идентификации белкового продукта р53 нами использовались моноклональные антитела (N^^53^07, Novocastra). Эти антитела распознают как мутантные, так и дикие формы белка р53 человека, окрашивая ядро клетки. Число ядер, экспрессирующих р53, во всех исследованных случаях в эпителии ворсинчатого хориона было значительно больше, чем в элементах стромы. Для идентификации белкового продукта Мс1-1 нами использовались моноклональные антитела (№^-Мс!-1; Novocastra). Антитела к этому маркеру связывают цитоплазматический и ядерный продукт гена.
Результаты и обсуждение. При сравнении степени экспрессии р53 в эпителии ворсин у женщин 1 и 2 групп, 3 и 2 групп, 4 и 2 групп нами не было выявлено достоверных отличий. Однако, в плаценте 40-летних женщин зарегистрировано большее число ядер синцития, позитивно окрашенных к р53, чем в плаценте женщин нормального репродуктивного возраста (1 и 2 группы, Р<0,01). Полученные результаты согласуются с данными литературы о нарастании дегенеративно-дистрофических процессов в связи с возрастом беременной. У женщин старше 35 лет отмечается истончение хориального эпителия опорных ворсин, частые дефекты синцитиотрофобласта мелких ворсин, увеличение фибриноидных отложений на местах дефектов синцитиотрофобласта,
утолщение его базальной мембраны. Возможно, что вышеперечисленные структурные изменения ворсинчатого хориона могли быть связаны с регуляторной функцией р53.
С другой стороны, принимая во внимание тот факт, что беременность у женщины была осложнена гестозом и гипотрофией плода, увеличение площади экспрессии р53 может быть связано с патологичным течением беременности. При гестозе — патологии, связанной с нарушением иммунного статуса плаценты, уменьшается объем хориального эпителия, что сопровождается снижением большинства его функций: транспортной, барьерной и гормональной [2, 5-6]. Согласно последним литературным данным, дисфункция плаценты тесно связана с апоптозом. Так, при преэклампсии нарушается дифференцировка цитотрофобласта и процесс его инвазии в матку, что тесно связано с программированной клеточной гибелью [7]. Многочисленные исследования указывают на гиперэкспрессию р53, а следовательно, и увеличение числа апоптозных клеток в цитотрофобласте при хорионкарциноме и пузырном заносе [4, 10].
Экспрессия белка Mcl-1 в ткани ворсинчатого хориона была достаточно высокой, что свидетельствует о высокой антиапоптозной активности ткани плаценты. Им-мунопозитивное окрашивание на Mcl-1 наблюдалось как в эпителии, так и в строме ворсинчатого хориона. Достоверного влияния возраста женщины на степень экспрессии маркера выявить не удалось.
Несмотря на это, наблюдались индивидуальные различия в характере экспрессии белка Mcl-1. Так, сильная степень экспрессии была выявлена в плаценте у 2 женщин из 2 и 4 групп, при этом у обеих женщин беременность была осложнена. У 36-летней женщины (4 группа) беременность отягощалась отеками, крупным плодом, анемией, варикозной болезнью, синдромом гипоксии. У 24-летней беременной (2 группа) беременность была осложнена хронической плацентарной недостаточностью. Некоторыми авторами отмечается, что при гипоксии плода возрастает доля хориального эпителия в общем объеме плаценты и увеличивается площадь поверхности, что свидетельствует о возросшей нагрузке на эти элементы [3]. При хронической плацентарной недостаточности в плаценте встречаются участки незрелых ворсин с выраженной пролиферацией цитотрофобласта и атрофией синцития [3]. Возможно, что повышенная экспрессия белка Mcl-1 в этих случаях связана с включением компенсаторно-приспособительных процессов в ворсинчатом хорионе, направленных на увеличение площади обменной поверхности хориального эпителия между матерью и плодом.
Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что регуляторные белки р53 и Mcl-1 играют важную роль в процессе регуляции клеточного цикла в плаценте, причем у женщин старшего репродуктивного возраста их соотношение смещается в сторону увеличения экспрессии проапоптотического белка Р53.
Литература
1. Айламазян, Э.К. Старение плаценты / Э.К. Айламазян, Е.А. Лапина, А.В. Колобов // Журнал акушества и женских болезней. - 2004. - Т. 53. - № 2. - С. 4-10.
2. Айламазян, Э.К. Выявление эндотелиальной NO-синтазы в плаценте и оксида азота в сыворотке крови беременных женщин в комплексной оценке эффективности лечения гестоза / / Э.К. Айламазян (и др.) // Арх. патол. - 2010. - Т. 72. - № 1. - С. 26-29.
3. Глуховец, Б.И. Патология последа /Глуховец Б.И., Глуховец Н.Г. - СПб., 2002. 447 с.
4. Кветной, И.М. Сигнальные молекулы - маркеры зрелости плаценты / И.М. Кветной (и др.) - М., 2005. - 96 с.
5. Линькова, Н.С. Экспрессия CD8 как маркера риска невынашивания беременности у женщин с гестозом / Н.С. Линькова (и др.) // Вестник РУДН. Акуш. и гинек. - 2009. - № 6. -С. 326-331.
6. Линькова, Н.С. Роль плацентарных макрофагов в патогенезе гестоза у женщин разных возрастных групп / Н.С. Линькова (и др.) // Усп. геронтол. - 2009. - Т. 22, № 3. -С. 503-506.
7. Aziziech, F. Maternal cytokine production patterns in women with pre-eclampsia / F. Aziziech, R. Raghupathy, M. Makheed // Am. J. Reprod. Immunol. - 2005. - Vol. 54. - № 1. - P. 30-37.
8. Chen, Z.Y. Effect of Bushen Yiqi Huoxue Recipe on placental trophoblast apoptosis in fetal growth restricted pregnant rat / Z.Y. Chen, Q. Wang, G.Y. Huang // Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. - 2010. - Vol. 6. - P. 611-616.
9. Ray, J. IFPA Trophoblast Research Award Lecture: the dynamic role of Bcl-2 family members in trophoblast cell fate / J. Ray, A. Jurisicova, I. Caniggia // Placenta. - 2009. - Vol. 30. -Suppl. A. - P. 96-100.
10. Staun-Ram, E. Ets-2 and p53 mediate cAMP-induced MMP-2 expression, activity and trophoblast invasion / E. Staun-Ram, S. Goldman, E. Shalev // Reprod Biol Endocrinol. - 2009. - Vol. 7. -P. 135-138.
EXPRESSION OF SIGNAL MOLECULES - REGULATORS OF PLACENTA APOPTOSIS
IN WOMAN OF VARIOUS AGE
E.A. Lapina1, N.S. Linkova2,
A.O. Durnova2, V.O. Polyakova2,
N.A. Palchenko3, A.V. Kostylev3 ,
S.S. Konovalov3, IM Kvetnoy2
3 Institute of bioregulation and gerontology Russian Academy of Medical Sciences,
Saint-Petersburg
11nternational Center of Human Reptoduction
Saint-Petersburg
There are investigated aging of placenta as the universal involution mechanism - apoptosis at the first time. The immunogisto-chemical research showed, that expression of proapoptosis protein p53 increased of placenta of oder age group woman. Howewer, aging placenta had compensatiry prosesses, one of which is increasing expression antiapoptosis protein Mcl-1.
2 Ott Institute
of Obstetrics and Gynecolog ofNWB RAMS,
Saint-Petersburg
Key words: placenta, apoptosis, р53, Mcl-1, ageing
e-mail: [email protected]
