CC BY
68
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
экспрессия рецепторов TLR2 и TLR4 на лимфоидных клетках как маркер инфекционных поражений пародонта
в.н. Царев1, E.H. Николаева1, Е.В. Ипполитов1, Е.М. Грецов2
1 ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России
2 ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, Москва
Изучена экспрессия толл-подобных рецепторов ^2 и на нестимулированных клетках периферической крови (нейтрофилах, моноцитах и лимфоцитах) и клетках десневой жидкости у людей со здоровым пародонтом и больных хроническим паро-донтитом, ассоциированным с остеопенией и остео-порозом. Установлено, что экспрессия ^2 и ^4 на
лейкоцитах периферической крови у разных людей, независимо от их принадлежности к обследуемой группе, значительно варьировала. У больных хроническим пародонтитом, ассоциированным с остеопо-розом, выявлена разнонаправленная экспрессия ^2 и ^4 на клетках периферической крови в сторону как увеличения, так и уменьшения.
Ключевые слова:
TLR1, TLR2, пародонт, толл-подобные рецепторы, пародонтит, остеопороз, остеопения
Expression of TLR2 and TLR4 on lymphoid cells as a marker of infectious periodontal lesions
V.N. Tsarev1, E.N. Nikolaeva1, E.V. Ippolitov1, E.M. Gretsov2
1 Moscow State University of Medicine and Dentistry
2 Hematologic scientific center» of Ministry of Health of Russia
A research has been carried out of expression of Tolllike receptors (TLR) of TLR2 and TLR4 on unstimulated cells of peripheral blood (neutrophils, monocytes and lymphocytes) and cells of gingival fluid at people with healthy periodontium and patients with chronic periodontal disease associated with osteopenia and osteoporosis.
No matter which survey group people belonged to, it has been established that TLR2 and TLR4 expression on leukocytes of peripheral blood considerably varied. Patients with chronic periodontitis associated with osteoporosis revealed multidirectional expression of TLR2 and TLR4 on cells of peripheral blood both upward and downward.
Keywords:
TLR1, TLR2,
periodontium,
toll-like receptor,
periodontitis,
osteoporosis,
osteopenia
Среди факторов врожденного иммунитета в последние годы все большее внимание уделяется толл-подобным рецепторам (toll-like receptors - TLR). Универсальность механизмов, обусловленная как широким представительством данных маркеров на разнообразных клетках организма, так и широким спектром лигандов для них, определяет включение TLR в патогенетические звенья развития многих заболеваний. В настоящее время установлены различные нарушения в системе механизмов врожденного иммунитета, ассоциированных с TLR, в частности нарушения экспрессии TLR и распознавания лигандов, трансдукции сигналов, выработки эффектор-ных молекул, а также полиморфизм генов TLR. Показано проявление этих нарушений при развитии атеросклероза,
инфекционных, аутоиммунных, аллергических и некоторых других заболеваний [1, 2, 6, 7]. Так, отмечено, что дефекты молекул, участвующих в трансдукции сигнала от ПК, лежат в основе повышенной восприимчивости к инфекционным болезням.
Значимость этих механизмов для широкой клинической практики определяет необходимость внедрения адекватных и надежных методов оценки компонентов системы ПК, которые могут быть воспроизведены в условиях клинической лаборатории лечебно-профилактических учреждений.
Целью работы являлось исследование экспрессии маркеров врожденного иммунитета Т1_1К2 и Т1_1К4 на лимфоидных клетках пародонта (десневой жидкости) и пе-
риферической крови методом иммунофлюоресцентной микроскопии у практически здоровых и больных хроническим пародонтитом.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследовании принимали участие 150 пациентов -88 (59%) женщин и 62 (41%) мужчины в возрасте от 18 до 73 лет с хроническим пародонтитом в фазе обострения (ХП) и 32 человека без признаков хронического воспаления пародонта (условно здоровые люди той же возрастной категории). Пациенты с ХП были разделены на 2 группы по пародонтологическим критериям, принятым в Российской Федерации: 1-я группа - ХП средней степени тяжести, 2-я группа - ХП тяжелой степени. Пациенты последней группы имели рентгенологические признаки выраженного остеопороза челюстных костей.
Для выполнения поставленной задачи исследовали десневую жидкость у здоровых людей и экссудат паро-донтального кармана больных ХП в фазе обострения с использованием стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Выделенные клетки окрашивали антителами к маркерам CD282 (соответствует рецептору TLR2) или CD284 (соответствует рецептору TLR4), меченными FITC, и фиксировали параформальдегидом. Готовые препараты просматривали под микроскопом ECLIPSE 50i (Nicon, Япония) при увеличении х1000.
Для определения фенотипа лейкоцитов периферической крови использовали метод проточной лазерной цитофлуориметрии [3]. Для этого к 100 мкл крови добавляли по 10 мкл раствора антител, меченных флюоресцентными многоцветными красителями против TLR2 (TLR2 IgG1 - FITC), CD14 - PE, CD45 - PerCP, CD19 - APC, CD3 -AF700 или TLR4 (TLR4 IgG1 - FITC) и CD14 - PE, CD45 -PerCP, CD19 - APC, CD3 - AF700. В пробирки с негативным контролем добавляли мышиные антитела, меченные FITC (IgG1 - FITC), а также антитела, меченые PE, PerCP, APC и AlexaFluor 700. Инкубировали 30 мин в темноте при ±4 °С. Для удаления эритроцитов использовали ли-зирующий буфер FACSLyse (BDBioscience) в объеме 2,0 мл в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте. Затем проводили центрифугирование при 500g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли. К осажденным клеткам добавляли по 2,0 мл фосфатно-солевого буфера. Клеточную взвесь дважды отмывали центрифугированием, после чего лейкоциты ресуспендировали и добавляли 0,5 мл фиксирующего буфера FACS CellFix (BD Bioscience). Полученные пробы исследовали на проточном цитометре FACSCanto 2, определяя экспрессию TLR2 и TLR4 на основных субпопуляциях Т-лимфоцитов ^3+-лимфоциты), В-лимфоцитов ^19+-лимфоциты), моноцитах (CD14+-моноциты) и гранулоцитах ^45<Нт-нейтрофилы).
Вероятность различия исследуемых показателей оценивали с помощью критерия Стьюдента t. Все расчеты проводили с помощью пакета программ Statistica 7.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При проведении исследования с помощью иммуно-люминесцентной микроскопии впервые в отечествен-
ной практике показано, что клетки десневой жидкости или экссудата пародонтального кармана, большую часть которых составляли лейкоциты, экспрессировали рецепторы врожденного иммунитета ^2 и ^4 с различной интенсивностью.
По данным, полученным в контрольной группе, частота выявления клеток, экспрессирующих эти маркеры, составила 12,3+3,2%, а в группе пациентов с ХП в фазе обострения - 4,1+2,1% (р<0,05), т.е. оказалась статистически достоверно сниженной (в 3 раза).
Так, на рис. 1 в поле зрения люминесцентного микроскопа продемонстрированы 2 клетки, экспрессирующие CD282 (^2), меченные FITC. Видны ярко окрашенные скопления в виде гранул. На рис. 2 в фазовом контрасте видны 4 клетки, выделенные из экссудата пародонтального кармана. На рис. 3 при люминисцентном микроско-пировании представлены эти же 4 клетки с неярким диффузным окрашиванием CD284-FITC (^4). Таким образом, в результате данного пилотного исследования выявлена и визуализирована экспрессия рецепторов врожденного иммунитета ^2 и ^4 в десневой жидкости и экссудате пародонтального кармана при патологии пародонта (ХП).
К сожалению, содержание клеточных элементов в десневой жидкости меньше, чем требуется для исследования им-мунофенотипа клеток на проточном цитометре - 3,5-9,4х106 клеток в 1 мл [3]. При выделении клеток из десневой жидкости обычно используют ее смывы изотоническим раствором хлорида натрия, которые позволяют получить 5-10х103 клеток в 1 мл, т.е. примерно в 2 раза меньше, чем требуется. Поэтому для получения дополнительных данных проводили исследования на клетках периферической крови.
В первой серии экспериментов определяли экспрессию ^2 и ^4 на лейкоцитах, выделенных из периферической крови пациентов (и условно здоровых людей) с помощью осаждения эритроцитов на 2% желатине в фосфатно-солевом буфере, согласно стандартным методикам, применяемым для определения фенотипа иммуно-компетентных клеток [3].
Полученные данные, позволяют утверждать, что экспрессия ^2 и ^4 на лейкоцитах периферической крови у разных людей независимо от группы, к которой они принадлежали (больные ХП, условно здоровые), значительно варьировала от полного отсутствия до 100% экспрессии на моноцитах крови некоторых людей. На рис. 4 и 5 представлены примеры определения маркеров CD14/CD282 и CD3/CD284 на нейтрофилах, лимфоцитах и моноцитах периферической крови.
Оказалось, что экспрессия ^2 на моноцитах (двойное окрашивание CD14/CD282) и ^4 на лимфоцитах (двойное окрашивание CD3/CD284) была очень низкой и не превышала 1%.
Во второй серии экспериментов клетки цельной крови одновременно окрашивали с помощью нескольких антител против определенных популяций лейкоцитов, меченых различными флюоресцентными метками. В данной модификации реакции иммунофенотипирования не теряли клетки никаких субпопуляций, что обычно происходит при выделении лейкомассы из периферической крови.
В.Н. Царев, Е.Н. Николаева, Е.В. Ипполитов, Е.М. Грецов ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРОВ ^2 И ^4 НА ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТКАХ КАК МАРКЕР ИНФЕКЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ПАРОДОНТА
Рис. 1. Клетки десневой жидкости, экспрессирующие CD282 - FITC. Увеличение х1000
Рис. 2. Клетки десневой жидкости. Фазовый контраст. Увеличение х1000
Рис. 3. Клетки десневой жидкости, экспрессирующие CD284 - FITC. Увеличение х1000
CD282F/CD14PE Рис. 4. Экспрессия TLR2 на лейкоцитах периферической крови
Здесь и на рис. 5: а - график переднего и бокового светорассеяния: нейтрофилы - область, окрашенная в зеленый цвет, лимфоциты - участки красного цвета, моноциты - синего цвета; б-г - двумерный точечный график (dot-plot) - экспрессия CD14, CD282 и CD14/CD282 на клетках разных популяций лейкоцитов.
б
а
г
R
Мтакоуа-СОЗР
1-0 - « 1 ч)- - Ш сэ-, О. "" Е -сз Г- ■
н02
Осч = 2т
1111 1 102 1М| 11111^ ШН| 1 10а 10* 103
С0284 ¥ 1ТС-А
CD284F/CD3PE
б
а
г
в
Рис. 5. Экспрессия TLR4 на лейкоцитах периферической крови
Тем не менее доля клеток, экспрессирующих CD282 (Т1^2), также была невысокой.
Оказалось, что выше всего уровень экспрессии маркеров CD282 (Т1^2) наблюдали на лимфоцитах людей со здоровым пародонтом (1,06+0,45%), т.е. на 56,24+24,12 млн кл/л (табл. 1). У пациентов 1-й группы относительное и абсолютное содержание лимфоцитов, экспрессирующих CD282, было в 3 раза ниже, чем у представителей контрольной группы (0,35+0,01% и 18,82+0,93 млн кл/л). У пациентов 2-й группы относительное содержание лимфоцитов, экспрессирующих CD282, было в 4 раза ниже, чем у представителей контрольной группы (0,26+0,05%), а абсолютное - в 5,7 раза (9,91+1,91 млн кл/л).
Экспрессия CD282 на моноцитах периферической крови у пациентов 2-й группы (0,91+0,43%, 43,72+5,34 млн кл/л) была в 1,4 раза выше, чем у людей в контрольной группе (0,65+0,11%, 34,45+5,71 млн кл/л). Тем не менее, у пациентов 2-й группы относительное количество моноцитов, экспрессирующих Т1^2, было в 10 раз меньше, чем в контрольной группе, а абсолютное содержание - в 13,9 раза (2,48+1,12 млн кл/л). На нейтрофилах экспрессия CD282 была еще ниже. Так, у представителей контрольной
группы эти рецепторы были определены на 0,34+0,04% (18,15+2,16 млн кл/л) нейтрофилов. У пациентов 1-й группы - относительное и абсолютное содержание было в 2,8 (0,12+0,01%) и 3 раза (6,13+0,93 млн кл/л) меньше, а у больных 2-й группы - в 4,3 (0,08+0,01%) и 6,8 раза (2,67+3,05 млн кл/л) меньше, чем в контрольной группе.
Экспрессия CD284 (Т1^4) на лейкоцитах периферической крови у обследованных пациентов имела такой же характер, хотя на лимфоцитах у пациентов 1-й группы этих рецепторов было в 2,8 (0,73+0,13%) и 2,9 раза (39,06+2,79 млн кл/л) больше, чем в контрольной группе (0,26+0,12%, 13,52+6,50 млн кл/л). У представителей 2-й группы относительное содержание CD284+-лимфоцитов было выше, чем у людей со здоровым пародонтом, только в 1,2 раза (0,31+0,11%), а абсолютное количество - в 1,14 раза ниже (11,81+4,19 млн кл/л).
На моноцитах самая высокая экспрессия CD284 была также у пациентов 1-й группы с ХП средней степени тяжести: 2,17+0,18% (117,02+3,8 млн кл/л) - в 15 раз больше, чем у пациентов контрольной группы (0,145+0,003%, 7,63+1,51 млн кл/л). Самая низкая экспрессия - у пациентов 2-й группы с ХП тяжелой степени и признаками остеопороза челюстных костей - относительное коли-
В.Н. Царев, Е.Н. Николаева, Е.В. Ипполитов, Е.М. Грецов ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРОВ 1^2 И 1^4 НА ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТКАХ КАК МАРКЕР ИНФЕКЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ПАРОДОНТА
чество (0,085±0,038%) в 1,7 раза меньше, а абсолютное (3,39±2,67 млн кл/л) - в 2,3 раза меньше, чем у представителей контрольной группы (условно здоровых).
На нейтрофилах самая высокая экспрессия CD284 была в крови у людей контрольной группы (0,35±0,05%, 18,25±3,11 млн кл/л); у пациентов 1-й группы относительное количество (0,275±0,083%) - в 1,3 раза, абсолютное (14,79±1,78 млн кл/л) - в 1,2 раза ниже, а у пациентов 2-й группы относительное количество (0,21±0,07%) -в 1,7 раза и абсолютное (8,05±2,67 млн кл/л) - в 2,3 раза ниже, чем у людей в контрольной группе (табл. 2).
Следует отметить, что у пациентов 1-й группы относительное количество нейтрофилов, экспрессирующих Т1_1К2, в 1,5 раза выше, чем у пациентов 2-й группы, моноцитов -в 15 раз и лимфоцитов - в 1,3 раза выше. Разница в абсолютном содержании была еще больше, соответственно в 2,3, 17,6 и 1,9 раза.
Относительное количество нейтрофилов, экспрессирующих Т1_1К4, у пациентов 1-й группы в 1,3 раза выше, чем у пациентов 2-й группы, моноцитов - в 25,5 раза и лимфоцитов - в 2,3 раза. Разница в абсолютном содержании также была выше, соответственно в 1,84, 34,5 и 3,3 раза.
Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что основные популяции лейкоцитов периферической крови (нейтрофилы, моноциты и лимфоциты) экспрессируют на своей поверхности Т1_1К2 и Т1_1К4, выявляемые с помощью моноклональных антител к CD282 и CD284. У людей со здоровым пародонтом самая высокая экспрессия Т1_1К2 наблюдается на лимфоцитах, в меньшей степени - на моноцитах и самая низкая - на нейтрофилах периферической крови. Наоборот, у здоровых людей больше всего было выявлено нейтрофилов с Т1_1К4, в меньшем количестве - лимфоцитов и еще в меньшем - моноцитов.
У больных пародонтитом экспрессия Т1_1К2 была выше на моноцитах, но ниже на нейтрофилах и лимфоцитах по сравнению с контролем; экспрессия Т1_1К4 выше на моноцитах и лимфоцитах, но ниже на нейтрофилах. Экспрессия Т1_1К2 на всех изучаемых популяциях лейкоцитов у пациентов с ХГП, ассоциированным с остеопорозом, была ниже, чем у здоровых людей в 4-14 раз и в 1,3-15 раза, чем у больных пародонтитом, ассоциированным с остео-пенией. Экспрессия Т1_1К4 у этих пациентов также была ниже в 1,2-2,3 раза, чем у здоровых людей и в 1,3-25,5 раза ниже, по сравнению с экспрессией ТоН-подобных рецепторов на лейкоцитах больных пародонтитом, ассоциированным с остеопенией.
выводы
1. Уровень экспрессии толл-подобных рецепторов Т1_1К2 и Т1_1К4 принципиально не отличается на нестиму-лированных клетках периферической крови (нейтро-филах, моноцитах и лимфоцитах) и десневой жидкости у людей со здоровым пародонтом, но варьирует при развитии ХП.
2. У больных ХП средней и тяжелой степени в фазе обострения выявлена разнонаправленная экспрессия рецепторов Т1_1К2 и Т1_1К4 на клетках периферической крови как в сторону увеличения, так и уменьшения.
3. Достоверно более низкие показатели экспрессии маркеров Т1_1К2 и Т1_1К4 на клетках периферической крови наблюдали при ХП тяжелой степени, который сопровождался признаками остеопороза челюстных костей, что позволяет сделать предположение о том, что изменения в системе врожденного иммунитета, проявляющиеся на уровне экспрессии толл-подобных рецепторов, связаны с системной потерей минеральной плотности костной ткани и прогрессированием ХП.
Таблица 1. Экспрессия CD282 (^2) на лейкоцитах периферической крови
Группа Единица измерения Экспрессия CD 282 ("^ 2)
нейтрофилы моноциты лимфоциты
Контрольная % 0,34±0,04 0,65±0,11 1,06±0,45
абс., млн кл/л 18,15±2,16 34,45±5,71 56,24±24,12
1-я (ХП средней степени) % 0,12±0,01* 0,91±0,43* 0,35±0,01*
абс., млн кл/л 6,13±0,93* 43,72±5,34* 18,82±0,93*
2-я (ХП тяжелой степени) % 0,08±0,01* 0,065±0,028 0,26±0,05*
абс., млн кл/л 2,67±3,05* 2,48±1,12* 9,91±1,91*
Примечание. Здесь и в табл. 2: * - статистически значимо достоверная разница по сравнению с контрольной группой при р<0,05.
Таблица 2. Экспрессия CD284 (^4) на лейкоцитах периферической крови
Группа Единица Экспрессия CD284 (1^4)
измерения нейтрофилы моноциты лимфоциты
Контрольная % 0,35±0,05 0,145±0,003 0,26±0,12
абс., млн кл/л 18,25±3,11 7,63±1,51 13,52±6,50
1-я (ХП средней степени) % 0,275±0,083* 2,17±0,18* 0,73±0,13*
абс., млн кл/л 14,79±1,78 117,02±3,8* 39,06±2,79*
2-я (ХП тяжелой степени) % 0,21±0,07* 0,09±0,04* 0,31±0,11
абс., млн кл/л 8,05±2,67* 3,39±2,67* 11,81±4,19*
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Царев Виктор Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России E-mail: [email protected]
Николаева Елена Николаевна - доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории молекулярно-биологических исследований Научно-исследовательского медицинского стоматологического института ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России Ипполитов Евгений Валерьевич - кандидат медицинских наук, доцент, старший научный сотрудник лаборатории молекулярно-биологических исследований Научно-исследовательского медицинского стоматологического института ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России Грецов Евгений Михайлович - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, Москва
ЛИТЕРАТУРА_
1. Байракова А.Л., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Егорова Е.А. и др. Роль и биологическое значение Толл-подобных рецепторов в антиинфекционной резистентности организма // Вестн. РАМН. 2008. № 1. С. 45-54.
2. Бондаренко В.М., Гинцбург А.Л., Лиходед В.Г. Роль инфекционного фактора в патогенезе атеросклероза // Эпидемиология и инфекц. бол. 2011. № 1. С. 7-11.
3. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы. М. :ГЭОТАР-Медиа, 2009. 345 с.
4. Burns E., Bachrach G., Shapira L., Nussbaum G. Cutting Edge: TLR2 is required for the innate response to Porphyromonasgingi-
REFERENCES_
1. Bayrakova A.L., Voropaeva E.A., Afanas'ev S.S., Egorova E.A. et al. The role and biological significance of Toll-like receptors in immunity. Vestnik RAMN [Bulletin RAMN]. 2008; N 1: 45-54. (in Russian)
2. Bondarenko V.M., Gintsburg A.L., Likhoded V.G. The role of the infectious agent in the pathogenesis of atherosclerosis. Epidemiologiya i infektsionnye bolezni[Epidemiology and Infectious Diseases]. 2011; N 1: 7-11. (in Russian)
3. Khaitov R.M., Pinegin B.V., Yarilin A.A. Manual of clinical immunology. diagnosis of diseases of the immune system. Moscow : GEOTAR-Media, 2009: 345 P. (in Russian)
4. Burns E., Bachrach G., Shapira L., Nussbaum G. Cutting Edge: TLR2 is required for the innate response to Porphyromonasgingi-
vaLis: Activation leads to bacterial persistence and TLR2 deficiency attenuates induced alveolar bone resorption // J. Immunol. 2006. Vol. 177. P. 8296-8300.
5. Flemmig T.F., Beikler T. Control of oral biof'lms // Periodontology 2000. 2011. Vol. 55, N 1. P. 9-15.
6. Koren O., Spor A., Felin J., Fak F. et al. Human oral, gut, and plaque microbiota in patients with atherosclerosis // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2011. Vol. 108, suppl 1. P. 4592-4598.
7. Krauss J.L., Potempa J., Lambris J.D., Hajishengallis G. Complementary Tolls in the periodontium: How periodontal bacteria modify complement and Toll-like receptor responses to prevail in the host // Periodontology 2000. 2010. Vol. 52. P. 141-162.
valis: Activation leads to bacterial persistence and TLR2 deficiency attenuates induced alveolar bone resorption. J Immunol. 2006; Vol. 177: 8296-300.
5. Flemmig T.F., Beikler T. Control of oral biofilms. Periodontology 2000. 2011; Vol. 55 (1): 9-15.
6. Koren O., Spor A., Felin J., Fak F. et al. Human oral, gut, and plaque microbiota in patients with atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; Vol. 108 (suppl 1): 4592-8.
7. Krauss J.L., Potempa J., Lambris J.D., Hajishengallis G. Complementary Tolls in the periodontium: How periodontal bacteria modify complement and Toll-like receptor responses to prevail in the host. Periodontology 2000. 2010; Vol. 52: 141-62.
