CC BY
13
УДК 616-001.17-085.26:57.084 DOI: 10.34215/1609-1175-2020-2-56-60
Экспрессия маркеров апоптоза и воспаления в коже крыс при лечении экспериментальных термических ожогов наносеребром и его комбинацией с ингибитором протеиназ
О.А. Писарева, А.В. Кубышкин, Е.Ю. Бессалова, Т.П. Макалиш, И.И. Фомочкина, Д.В. Чегодарь
Медицинская академия им. С.И. Георгиевского Крымского федерального университета им. В.И. Вернадского», Симферополь, Россия
Цель: обосновать возможность модификации воспалительного процесса при термических ожогах кожи II степени на фоне использования наночастиц серебра и ингибиторов протеиназ. Материал и методы. Эксперимент проводился на 30 половозрелых крысах-самцах линии Wistar. После моделирования термического ожога 10 животным местно наносили водорастворимую композицию из наночастиц серебра в матрице альгината натрия, 10 - комбинацию водорастворимой композиции наносеребра и апротинина (еще 10 крыс - контроль). Через 7 дней животных выводили из опыта и выполняли гистологическое и иммуногистохимическое исследование кожи в зоне ожога. Результаты. Выявлен максимальный эффект от комбинированной терапии ран водорастворимой композицией наночастиц серебра в матрице альгината натрия с ингибитором протеиназ (апротинином), которая способствовала активации регенераторных процессов. Заключение. Эффект комбинированной терапии связан с улучшением баланса процессов пролиферации и апоптоза в ожоговой ране, а также со специфической стимуляцией воспалительного ответа. Данное направление местной терапии ожогов может считаться патогенетически обоснованным и перспективным. Ключевые слова: термический ожог II степени, иммуногистохимия, наносеребро, апротинин Поступила в редакцию 27.06.2019 г. Принята к печати 07.05.2020 г.
Для цитирования: Писарева О.А., Кубышкин А.В., Бессалова Е.Ю., Макалиш Т.П., Фомочкина И.И., Чегодарь Д.В. Экспрессия маркеров апоптоза и воспаления в коже крыс при лечении экспериментальных термических ожогов наносеребром и его комбинацией с ингибитором протеиназ. Тихоокеанский медицинский журнал. 2020;2:56-60. doi: 10.34215/1609-1175-2020-2-56-60
Для корреспонденции: Писарева Ольга Анатольевна - аспирант кафедры общей и клинической патофизиологии Медицинской академии имени С.И. Георгиевского КФУ (295051, г. Симферополь, б-р Ленина, 5/7); ORCID: 0000-0002-1156-4544; e-mail: [email protected]
Expression of apoptosis and inflammation markers in skin of rats in the treatment of experimental thermal burns with nanosilver and its combination with a proteinase inhibitor
O.A. Pisareva, A.V. Kubyshkin, E.Yu. Bessalova, T.P. Makalish, I.I. Fomochkina, D.V. Chegodar
Medical Academy named after S.I. Georgievsky, Vernadsky Crimean Federal University, Simferopol, Russia
Objective: To substantiate a possibility for modification of inflammation process in thermal burns of stage II using nanoparticles of silver and proteinase inhibitors. Methods: The experiment included 30 mature Wistar male rats. After a thermal burn simual-tion, 10 animals were locally applied with a water-soluble composition of silver nanoparticles in a sodium alginate matrix, 10 - with a combination of a water-soluble composition of nanosilver and aprotinin (another 10 rats were control). After 7 days, animals were withdrawn from the experiment and were run histological and immunohistochemical examination of the skin in the burn area. Results: The maximum effect of combined wound therapy with a water-soluble composition of silver nanoparticles in a matrix of sodium alginate with a proteinase inhibitor (aprotinin), which contributed to the activation of regenerative processes, was revealed. Conclusions: The effect of combined therapy is related to an improvement in the balance of proliferation and apoptosis in a burn wound as well as with a specific stimulation of the inflammatory response. This local therapy for burns can be considered pathogenically justified and promising. Keywords: thermal burn of stage II, immunohistochemistry, nanosilver, aprotinin Received: 27 June 2019; Accepted: 7 May 2020
For citation: Pisareva OA, Kubyshkin AV, Bessalova EYu, Makalish TP, Fomochkina II, Chegodar DV. Expression of apoptosis and inflammation markers in skin of rats in the treatment of experimental thermal burns with nanosilver and its combination with a proteinase inhibitor. Pacific Medical Journal. 2020;2:56-60. doi: 10.34215/1609-1175-2020-2-56-60
Corresponding author: Olga A. Pisareva, MD, postgraduate student, Department of General and Clinical Pathophysiology, Medical Academy named after S.I. Georgievsky, Vernadsky Crimean Federal University (5/7 Lenina Blvd, Simferopol, Russian Federation); ORCID: 0000-0002-1156-4544; e-mail: [email protected]
Термические ожоги доминируют среди травм воен- терапию, ухудшать эстетический результат [1]. Не ного и мирного времени, их лечение связано с риском следует забывать, что несмотря на активное разви-осложнений, которые могут продлевать и усложнять тие и внедрение новых методов лечения, вопрос об
© Писарева О.А., Кубышкин А.В., Бессалова Е.Ю., Макалиш Т.П., Фомочкина И.И., Чегодарь Д.В., 2020
эффективности терапии ожоговых повреждений в целом остается актуальным и дискутабельным.
Механизм ранозаживления представляет собой последовательный гуморальный и клеточный каскад реакций эпителиальных клеток, соединительной ткани, сосудов кожи, который приводит к закрытию дефекта кратчайшим путем, либо через нагноение [2, 3]. Тканевые реакции в ожоговой ране характеризуются альтерацией, коагуляцией, воспалительно-экссудатив-ной реакцией, синтезом и накоплением компонентов внеклеточного матрикса, неоваскуляризацией с формированием грануляционной ткани, контракцией, ремоделированием, а также регенерацией эпителия [4, 5]. Каждый из этих этапов может служить поворотной точкой для патологического ранозаживления, доступен морфологическому изучению и коррекции при местной терапии [6]. Структурно-функциональный анализ клеток и их взаимоотношений среди компонентов тканей в зоне повреждения позволяет морфологически обосновать выбор способа лечения [7].
В современных тенденциях терапии ожогов преобладают патогенетически ориентированные методы нанесения на раневую поверхность биологически активных веществ в сочетании с физическими факторами, корректирующими базовые этапы ранозаживления [8, 9]. Наночастицы серебра и антипротеолитические препараты могут быть примером подобной специфической терапии термических ожогов кожи. Существуют данные о том, что кроме антимикробного воздействия, препараты серебра обладают противовоспалительным и регенераторным эффектами, а ингибиторы протео-лиза зарекомендовали себя как антифлогогенные компоненты при терапии ран [9]. Пролиферации и апоптоз эпидермоцитов в норме сбалансирован, но в условиях репаративной регенерации возможен сдвиг этого баланса с формированием грубых рубцов, особенно при тяжелых, длительно незаживающих ожогах [10].
Цель работы - обосновать возможность модификации воспалительного процесса при термических ожогах кожи II степени на фоне использования нано-частиц серебра и ингибиторов протеиназ.
Материал и методы
Проведен эксперимент на 30 половозрелых белых крысах линии Щ'Ыах (возраст 6 месяцев) с массой тела 190-200 г. Эксперимент проходил в несколько этапов: 1) моделирование ожога кожи; 2) разделение крыс на три группы по 10 особей в зависимости от способа местного лечения; 3) выведение животных из эксперимента через 7 суток (под эфирным наркозом); 4) гистологическое и иммуногистохимическое (ИГХ) исследование; 5) количественный анализ и интерпретация результатов. Эксперимент выполнен с соблюдением правил лабораторной практики, принятых в Российской Федерации, и принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского союза по защите животных, используемых в научных целях (2016).
Протокол исследования одобрен биоэтической комиссией Медицинской академии им. С.И. Георгиевского (протокол № 2 от 11.09.2015 г.).
С целью обезболивания и обездвиживания экспериментальным животным вводили тиопентал натрия из расчета 20 мг/кг массы тела. Ожог II степени моделировали на предварительно обритом участке кожи в области холки, ограниченном деревянным трафаретом размером 15x10 мм, путем прикладывания тонкостенной стеклянной емкости с водой температурой 90 °С на 10 с. Рану вели открыто в соответствии с планом лечения:
1-я группа (контроль) - 10 крыс с моделью ожога, не получавших местной терапии;
2-я группа - 10 крыс с моделью ожога, которым в течение 7 дней местно применяли водорастворимую композицию наночастиц серебра (0,1 %) в матрице альгината натрия (0,6 %), изготовленную на бидисти-лированной воде;
3-я группа - 10 крыс с моделью ожога, которым в течение 7 дней местно применяли комбинацию раствора наносеребра и ингибитора протеиназ (апротинин).
Для изготовления комбинации смешивали 3 мл апротинина (препарат «Гордокс», «Гедеон Рихтер», Венгрия) и 2 мл исходной композиции наносеребра (0,1 %), стабилизированного альгинатом натрия. Затем в смесь вливали в 5 мл наносеребра в форме геля. Полученная таким образом композиция содержала 30 % апротинина, 0,07 % наносеребра и 0,8 % смеси низко-и высокомолекулярного альгината натрия.
Стандартное гистологическое исследование образцов кожи выполнено в соответствии с общепринятой методикой, инструкциями и протоколами к аппаратуре и реактивам. Фрагменты кожи иссекали в пределах здоровых тканей, 24 часа фиксировали в 10 % нейтральном формалине, заливали в парафиновые блоки, из которых готовили серийные срезы толщиной 4 мкм. Исследование выполнено на базе гистологической лаборатории с иммуногистохимией и электронной микроскопией Центральной научно-исследовательской лаборатории Медицинской академии им. С.И. Георгиевского и Центра коллективного пользования научным оборудованием «Молекулярная биология». Использовались станция вырезки LEEC Ltd. (Leica, Германия), гибридный гистологический процессор LOGOS (Millestone, Италия), модульный центр для заливки Leica EG 1150 (Leica, Германия), автоматический ротационный микротом Leica RM 2255 (Leica, Германия), лабораторный микроскоп Leica DM2000 (Leica, Германия), цифровой сканер препаратов Aperio CS2 (Leica, Германия).
С каждого блока один срез, включающий раневую поверхность и подлежащие слои кожи, окрашивали гематоксилином Джилла и эозином (компания «Био-Витрум», Россия) и пять срезов изучали ИГХ-методом. При помощи реакции антиген-антитело, по протоколам производителя, в ткани выявляли маркеры апоптоза и воспаления (в т.ч. CD - cluster of differentiation). Для
1 ijL шр YW к» • :: I 7 L б II ь ч L ■' ■' ' ^ ! в - - _
¥ ■ к ъ. • •/4 JrS " k • ш
Рис. 1. Экспрессия маркеров апоптоза в эпителии при лечении термических ожогов: а - 2-я группа, слабая (+) реакция на €095; б - 2-я группа, умеренная (++) реакция на Ьс1-2; в - 3-я группа, умеренная (++) реакция на €095; г - 3-я группа, отсутствие реакции на Ьс1-2; д - контроль, умеренная (++) реакция на €095; е - контроль, слабая реакция (+) на Ьс1-2. Имму-ногистохимия, х400.
визуализации использовали систему детекции на основе полимера Novolinc Polimer Detection System (Leica, Германия) с позитивным и негативным контролями.
Экспрессию Fas-R (маркер CD95) и белка-ингибитора апоптоза bcl-2 определяли с помощью моно-клональных антител фирмы Leica (Германия). Оценку данных маркеров с цитоплазматической локализацией проводили полуколичественным методом: 0 - окрашивание отсутствует, либо имеется слабое/среднее окрашивание менее 25 % клеток; + - слабоинтенсивное окрашивание более 25 % клеток, либо окрашивание сильной интенсивности менее 25 % клеток; ++ - 25-75 % клеток имеют окрашивание средней интенсивности, либо 25-50 % клеток окрашены высокоинтенсивно; +++ - более 75 % клеток окрашены средне-интенсивно, либо более 50 % клеток окрашены высокоинтенсивно.
Для исследования интенсивности воспаления применяли моноклональные антитела Dako: на общий лейкоцитарный антиген (CD45), популяции натуральных киллеров (CD56) и макрофагов (CD68). Реакцию оценивали в световом поле при 400-кратном увеличении в десяти полях зрения, подсчитывая количество иммунопозитивных клеток и вычисляя среднюю арифметическую и ее стандартную ошибку (M±s). Изменения оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при вероятности ошибки р<0,05.
Результаты исследования
В коже крыс 2-й группы по сравнению с контролем в эпидермальных клетках регенерата под струпом была умеренно снижена интенсивность реакции на СБ95 и значительно повышена экспрессия Ьс1-2, что
могло свидетельствовать о торможении апоптоза путем активации его белка-ингибитора в эпидермоцитах. В коже крыс 3-й группы значимой разницы уровня экспрессии СБ95 по сравнению с контролем не обнаружено, но зафиксировано отсутствие экспрессии Ьс1-2. При сравнении групп крыс, получавших разные виды местной терапии, отмечено, что в группе комбинированного лечения уровень экспрессии СБ95 был выше, а Ьс1-2 - ниже (рис. 1).
Количество лейкоцитов (СБ45+) и натуральных киллеров (СБ56+) в сетчатом слое дермы и эпидермисе при лечении наносеребром уменьшалось, а в 3-й группе оказалось выше, чем в контроле. При комбинированной терапии уровень СБ56-позитивных клеток был выше по сравнению с группой без лечения. Количество лейкоцитов в сетчатом слое дермы прямо коррелировало с таковым в эпидермисе. Во всех группах макрофаги (СБ68+) преобладали СБ56-позитивными клетками (табл., рис 2).
Обсуждение полученных данных
На различных стадиях ранозаживления, на этапах альтерации, воспалительно-экссудативной реакции, накоплении компонентов внеклеточного матрикса, васкуляризации с формированием грануляционной ткани, контракции, ремоделировании, регенерации эпителия активны различные диффероны клеток. Макрофаги при репаративной регенерации выступают в роли ключевых элементов, подключая в процесс ранозаживления другие клеточные диффероны посредством секреции цитокинов [4, 5]. Эти клетки мигрируют из кровеносного русла в рану уже на этапе
59
1 ■
0
iV § , % - Щ
'; -, i'J
лч
'F
_^
-1> -
■ 1 r^i^"-
'I - ' I- p ■ ^
[ v V- * .j via
Vv ■ , - ж ■-ТРГ- -
rwvriff.
'-'-¿г4
«
■V —
* * V * /
S" * j ч y iM-y
r } reii
Ii_- ^ v
, . ¿À*SÄT«
''"■-ci '
e
_ч . I
Рис. 2. Экспрессия лейкоцитарных маркеров при лечении термических ожогов: а - 2-я группа, малое количество СВ45-позитивных клеток; б - 2-я группа, малое количество СВ56-позитивных клеток; в - 2-я группа, умеренное количество СВ68-позитивных клеток; г - 3-я группа, умеренное количество СВ45-позитивных клеток; д - 3-я группа, значительное количество С056-позитивных клеток; е - 3-я группа, значительное количество СВ68-позитивных клеток; ж - контроль, умеренное количество С045-пози-тивных клеток; з - контроль, умеренное количество С056-позитивных клеток; и - контроль, умеренное количество С068-позитивных клеток. Иммуногистохимия, х400.
г
Таблица
Экспрессия маркеров СВ45, СВ56 и СЭ68 при различных способах лечения термических ожогов кожи
Группа CD45, % CD56, клеток/п.з. CD68, клеток/п.з.
1-я 9,7±1,2 6,5±0,9 8,7±1,0
2-я 4,4±1,1а 4,7±0,7а 6,5±1,0
3-я 9,9±1,5б 10,5±1,4а- б 15,9±2,1а- б
а Разница с контролем (1-й группой) статистически значима (р<0,05). б Разница со 2-й группой статистически значима (р<0,05).
альтерации в отличие от специфического воспаления, когда макрофаги часто характеризуют как «ленивые», долго вступающие в работу клетки, при ожогах они сразу включаются в фагоцитоз, иммунные реакции и организуют деятельность эпителиальных клеток и фибробластов [1-3]. Именно макрофаги определяют темп ранозаживления и качество регенерата, следовательно, могут служить точкой приложения патогенетической терапии. В этом ключе, по данным нашего эксперимента, перспективно комбинированное
лечение ожогов. Макрофаги стимулируют миграцию и пролиферацию фибробластов, синтез ими и накопление в ране компонентов внеклеточного матрикса. При этом описан процесс ингибирования макрофа-гальными активными веществами протеиназ и замедление деградации интерстициальной основы вновь формирующейся соединительной ткани [10]. Таким способом апротинин в ране может пролонгировать свои функции за счет макрофагальной реакции.
Использование наночастиц серебра для монотерапии и в комбинации с апротинином позитивно сказывается на формировании регенерата при термических ожогах. На клеточном и молеякулярном уровнях эти способы местного лечения действуют посредством различных механизмов. С точки зрения баланса «пролифе-рация/апоптоз» наносеребро, на наш взгляд, запускает каскад реакций, приводящих к активации белка-ингибитора апоптоза. При комбинированной терапии состояние ткани способствует активации регенераторных процессов, при этом в регенерате усилен и апоп-тоз. Согласно последним данным, в очаге ожогового
повреждения происходит усиление высвобождения воспалительных медиаторов и проапоптотических эффекторов [2-5]. Полученные данные подтверждают интересную закономерность, выявленную и другими авторами: в эпидермисе на молодых келоидных рубцах, несмотря на активные процессы пролиферации, кера-тиноциты активно элиминируются апоптозом, который сдерживает гипертрофию эпителия [2-4]. В зоне роста молодых келоидов наблюдается активная пролиферация клеток, апоптоз которых ингибируется геном Вс1-2. Все ткани реализуют свои регенераторные возможности в соответствии с общими закономерностями эмбрионального гистогенеза [2-4]. Апоптоз считается морфологическим проявлением реализации внутриклеточной программы самоуничтожения клетки и отличается от других известных форм ее гибели высокой организацией и четкостью молекулярного каскада реакций [3, 9]. Этот механизм играет важную роль, как в патогенезе кожных болезней, так и в поддержании гомеостаза здоровой кожи. Он имеет прямое отношение к проблеме устранения келоидных рубцов, формирование которых в значительной степени обусловлено усиленной пролиферацией фибробластов и повышенной выработкой ими компонентов межклеточного матрикса [3, 9]. Негативным регулятором апоптоза выступает Вс1-2 [3]. Путем изменения транскрипции промитотических генов Вс1-2 поддерживает клеточный рост и затрудняет вхождение клетки в клеточный цикл [3]. Он положительно влияет на транскрипцию генов антиапоптоти-ческих белков и в тоже время ингибирует экспрессию белков типа Вах и ВН3 [3]. Вс1-2 удлиняет жизнь клетки, блокируя апоптоз даже в условиях стимуляции химиотерапевтическими препаратами, гипертермией, факторами некроза опухолей и трансфекцией генов р53 или С-тус. Уменьшение количества белка Ьс1-2 индуцирует развитие апоптоза [3]. Этот белок может считаться перспективной мишенью для различных манипуляций с целью воздействия на судьбу клетки. По нашим данным, ингибитор апоптоза Ьс1-2 присутствует в клетках росткового слоя эпидермиса в зоне молодых келоидных рубцов.
Заключение
Использование наночастиц серебра в качестве монотерапии и в комбинации с апротинином позитивно сказывается на формировании регенерата при термических ожогах. С точки зрения баланса «пролифера-ция/апоптоз» наносеребро запускает каскад реакций, приводящих к активации белка-ингибитора апопто-за. При комбинированной терапии состояние ткани способствует активации регенераторных процессов в эпидермоцитах, при этом в регенерате усиливается и апоптоз, что сдерживает гипертрофию эпидермиса. Эффект комбинированной терапии связан также со специфической стимуляцией звеньев воспалительного ответа, что целесообразно на ранних этапах лечения ожогов. Данное направление местной терапии ожогов может считаться патогенетически обоснованным и перспективным.
Конфликт интересов: авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи. Источники финансирования: исследование проведено при финансовой поддержке программы развития КФУ им. В.И. Вернадского» и научного проекта «Патогенетические механизмы реэпителизации и ремоделирова-ния ожоговых ран и оптимизация процессов репарации посредством потенцирования противовоспалительных эффектов наночастиц серебра и апротинина» (№ 17-415-92011), поддержанного РФФИ и Советом министров Республики Крым. Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования - АВК, ИИФ, ОАП Сбор и обработка материала - ЕЕБ, ТПМ, ОАП Статистическая обработка - ТПМ, ДВЧ Написание текста - ЕЕБ, ОАП, ИИФ Редактирование - ОАП, ЕЕБ
Литература / References
1. Алексеев А.А., Салахиддинов К.З., Гаврилюк Б.К., Тюрни-ков Ю.И. Комплексное лечение глубоких ожогов на основе применения хирургической некрэктомии и современных биотехнологических методов. Анналы хирургии. 2012;6:41-5. [Alekseev AA, Salahiddinov KZ, Gavrilyuk BK, Tyurnikov YuI. Complex treatment of deep burns of surgical necrectomies and modern biotechnological methods. Annals of Surgery. 2012;6: 41-5 (In Russ).]
2. Oseni OG, Olamoyegun KD, Olaitan PB. Paediatric burn epidemiology as a basis for developing a burn prevention program. Ann Burns Fire Disasters. 2017;30(4):247-9.
3. Reddy AS, Abraham A, McClain SA, Clark RA, Ralen P, Sandoval S, Singer AJ. The role of necroptosis in burn injury progression in a rat comb burn model. AcadEmergMed. 2015;22(10):1181-6.
4. Алексеева Н.Т. Участие клеточного компонента в регенерации раны. Журнал анатомии и гистопатологии. 2014;3(1):9-15. [Alekseeva NT. The participation of cell component in regeneration of wounds. Journal of Anatomy and Histopathology. 2014;3(1):9-15 (In Russ).]
5. Guillory AN, Clayton RP, Herndon DN, Finnerty CC. Cardiovascular dysfunction following burn injury: what we have learned from rat and mouse models. Int J Mol Sci. 2016;17(1):53.
6. Мартынюк А.В. Пролиферативная и апоптотическая активность клеток кожи человека при патологическом регенераторном гистогенезе. Укратський журнал клШчног та лабораторной медицини. 2013;8(3):209-12. [Martynyuk AV. Proliferative and apoptotic activity of cellsof human skin at patol-ogy regeneration histogenesis. Ukrainian Journal of Clinical and Laboratory Medicine. 2013;8(3):209-12 (In Russ).]
7. Rodero MP, Khosrotehrani K. Skin wound healing modulation by macrophages. Int J Clin Exp Pathol. 2010;25(7):643-53.
8. Jia Z, Xiu P, Xiong P, Zhou W, Cheng Y, Wei S, et al. Additively manufactured macroporous titanium with silver-releasing mi-cro-/nanoporous surface for multipurpose infection control and bone repair - A proof of concept. ACS Appl Mater Interfaces. 2016;8(42):28495-510.
9. Liu M, Luo G, Wang Y, Rui X, Ying W, Weifeng H, et al. Nano-silver-decorated microfibrous eggshell membrane: Processing, cytotoxicity assessment and optimization, antibacterial activity and wound healing. Sci Rep. 2017;7(1):436.
10. Мнихович М.В., Еремин Н.В., Фомина Л.В., Мигляс В.Г. Межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия при заживлении ран (лекция). Журнал анатомии и гистопатологии. 2013;2(2):63-72. [Mnihovich MV, Eremin NV, Fomi-na LV, Miglyas VG. Intercellular and cell-matrix interactions in wound healing (lecture). Journal of Anatomy and Histopathology. 2013;2(2):63-72 (In Russ).]
