CC BY
11© Коллектив авторов, 2014 УДК 616.33-02:616.149-008.331.1]-091.8
ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРОВ АПОПТОЗА ПРИ ПОРТАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИОННОЙ ГАСТРОПАТИИ И СВЯЗЬ С ИНФЕКЦИЕЙ HELICOBACTER PYLORI
Е.М. Пальцева, доктор медицинских наук, Т.С. Семенова, С.Б. Жигалова, доктор медицинских наук, И.С. Пестин, А.Г. Шерцингер, доктор медицинских наук, профессор
Российский научный центр хирургии им. академика Б.В. Петровского РАМН, Российская Федерация, 119991, Москва, Абрикосовский пер., д. 2
E-mail: [email protected]
Введение. Несмотря на то, что портальная гипертензионная гастропатия (ПГГ), развивающаяся у пациентов с портальной ги-пертензией (ПГ), представляет собой серьезную клиническую проблему, ее патогенез остается малоизученным.
Цель. Изучение экспрессии проапоптотического белка Bax и антиапоптотического белка Bcl-2 в эпителиальных клетках слизистой оболочки желудка (СОЖ) при ПГГ, а также поиск связи между инфекцией Helicobacter pylori (Нр), степенью тяжести ПГГ и содержанием данных факторов апоптоза.
Методы. Иммуногистохимическое исследование проведено на материале биоптатов СОЖ пациентов с ПГГ, циррозом печени и ПГ без признаков ПГГ, контрольную группу составили образцы нормальной СОЖ.
Результаты. Не выявлено достоверных различий между группами пациентов в зависимости от наличия Нр, а также связи между степенью тяжести ПГГ и обсемененностью Нр. Экспрессия Bax в эпителиальных клетках желез желудка была достоверно ниже у больных ПГГ, чем в контрольной группе, а также в подгруппах с легкой и средней степенью ПГГ(р<0,05). Содержание Bax было ниже и у пациентов с ПГ без ПГГ по сравнению с нормой (р<0,05). Сопоставление уровней экспрессии Bax с наличием инфицирования Нр ни в одной из групп ассоциаций не выявило. Экспрессия ингибитора апоптоза Bcl-2 отсутствовала в эпителиальных клетках СОЖ во всех группах в 100% случаев.
Заключение. Полученные нами данные свидетельствуют о подавлении механизмов, запускающих апоптоз эпителиальных клеток СОЖ при ПГГ и при ПГ без признаков гастропатии, а также об отсутствии связи с инфекцией Нр.
Ключевые слова: портальная гипертензионная гастропатия, Helicobacter pylori, апоптоз, Bax, Bcl-2
EXPRESSION OF APOPTOSIS FACTORS IN PORTAL HYPERTENSIVE GASTROPATHY AND ASSOCIATION WITH HELICOBACTER PYLORI INFECTION E.M. Paltseva, T.S. Semenova, S.B. Zhigalova, I.S. Pestin, A.G. Shertsinger B.V. Petrovsky Russian Surgery Research Center, Abrikosovskiy by-street, 2, Moscow, Russian Federation, 119991
Introduction. Despite the fact that portal hypertensive gastropathy (PHG) developing in patients with portal hypertension (PH) is a serious clinical problem, its pathogenesis remains to be poorly studied.
The aim of our research was to study theproapoptotic protein Bax and anti-apoptoticprotein Bcl-2 expression in epithelial cells of gastric mucosa in patients with PHG, and to find the association between Helicobacter pylori infection, the PHG severity and the content of these factors of apoptosis.
Methods. Immunohistochemical research was held on the gastric mucosa biopsies of patients with PHG, hepatic cirrhosis and PH without signs of PHG. The normal gastric mucosa examples constituted the control group.
Results. We haven't revealed statistically reliable differences between groups of patients in dependence on H. pylori presence, and association between the degree of PHG severity and H. pylori. Bax expression in gastric epithelial cells in PHG patients was significantly lower than in control group (р<0,05) and in subgroups with the mild and moderate degree of PHG severity in comparison with control (р<0,05). Bax content was also lower in the group of patients with PH without PHG in comparison with norm (р<0,05). The comparison of the level of Bax expression with H. pylori infection didn't reveal any association in all groups. The apoptosis inhibitor Bcl-2 expression was absent in gastric mucosa epithelial cells in all groups in 100% cases.
Conclusion. Our data demonstrate the suppression of mechanisms triggering apoptosis of gastric mucosa epithelial cells in PHG and PH without signs of PHG, and also show the absence of association with H. pylori.
Key words: portal hypertensive gastropathy, Helicobacter pylori, apoptosis, Bax, Bcl-2
Портальная гипертензионная гастропатия (ПГГ) представляет собой изменения слизистой оболочки желудка (СОЖ), развивающиеся при портальной ги-пертензии (ПГ) любого генеза, и является серьезной клинической проблемой, так как может осложняться острыми или хроническими желудочными кровотечениями, приводящими к анемии. Частота встречаемости ПГГ у пациентов с циррозом печени и ПГ, по данным разных исследований, колеблется от 20 до 98% [1, 2], составляя в среднем 65% [3—5].
Диагноз ПГГ ставят на основании данных эзофа-гогастродуоденоскопического исследования. Морфологические изменения характеризуются эктазией вен и капилляров слизистой и подслизистой оболочек желудка [2], истончением стенок сосудов. Вены под-слизистой становятся извитыми, с участками утолщения интимы; их количество увеличивается [2, 6]. Кроме того, А. Toyonaga (1998) продемонстрировал большое количество артериовенозных шунтов, открывающихся в подслизистую оболочку желудка [7].
Молекулярная медицина
21
Тем не менее до сих пор единого мнения о том, какие гистологические признаки следует считать патогно-моничными для ПГГ, нет.
Механизмы патогенеза ПГГ до конца не изучены. Предполагается, что в основе ее развития лежит повышение портального давления, которое вызывает изменения местной гемодинамики, в результате чего формируется застой в верхнем отделе желудка. Это, в свою очередь, приводит к повреждению СОЖ. При этом связь между выраженностью ПГГ и уровнем портального давления и выраженностью цирроза остается спорной [6]. В патогенезе данного заболевания задействовано множество других факторов — таких, как локальные нарушения тонуса сосудов СОЖ, повышенная проницаемость микрососудов, опосредованная эндотелином-1, повышенная экспрессия оксида азота [1], являющегося вазодилататором. Предметом дискуссий до сих пор остается связь между инфекцией Helicobacter pylori (Нр) и тяжестью проявлений ПГГ [1, 8—11]. Определенная роль отводится факторам роста и простагландинам [4], а также апоптозу.
Апоптоз эпителиальных клеток СОЖ играет одну из ключевых ролей в патогенезе ПГГ [12]. К настоящему времени установлено, что решающим моментом в запуске апоптоза является гетеродимеризация белков семейства Bcl-2 — индукторов и ингибиторов апоптоза. Данное семейство включает ключевые медиаторы, которые играют основную роль в терминальной стадии апоптоза [13]. К выбросу проапоптотических молекул приводит в том числе и воспалительный ответ, вызванный колонизацией СОЖ Нр [6].
В то же время процессы апоптоза при ПГГ остаются неизученными, в том числе изменение экспрессии членов семейства Bcl-2, играющих роль как активаторов, так и ингибиторов апоптоза. Поэтому целью нашей работы были изучение экспрессии проапоп-тотического белка Bax и антиапоптотического белка Bcl-2 в эпителиальных клетках СОЖ при ПГГ, а также поиск связи между инфекцией Нр, степенью тяжести ПГГ и содержанием данных факторов апоптоза.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование выполнено на материале биоптатов СОЖ, полученных при эндоскопическом обследовании 26 больных с ПГГ (мужчин — 17, женщин — 9; средний возраст — 54±8,6 года), проходивших лечение в Российском научном центре хирургии им. академика Б.В. Петровского в 2014 г. У 13 пациентов (мужчин — 9, женщин — 4; средний возраст — 54,1+9,8 года) была ПГГ легкой степени и у 13 (мужчин — 8, женщин — 5; средний возраст — 54,0+7,3 года) — ПГГ средней степени тяжести. Пациентов с тяжелой степенью ПГГ в нашей выборке не было. Диагноз ПГГ с указанием степени тяжести ставили на основании эндоскопической картины в соответствии с 3-категорийной классификационной системой ПГГ, согласно которой при легкой степени отмечается мозаичный рисунок слизистой оболочки, при среднетяжелой степени — появление красных скарлатиноподобных элементов СОЖ.
В исследование вошли также 9 пациентов с циррозом печени и ПГ без признаков ПГГ (мужчин — 1, женщин — 8; средний возраст — 55,7±5,4 года). Контролем служили биоптаты неизмененной СОЖ, полученные у 11 пациентов (мужчин — 8, женщин — 3; средний возраст — 55,2+14,8 года).
Для дальнейшего иммуногистохимического (ИГХ) исследования материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине и заливали в парафин. Для морфологического исследования срезы толщиной 3—4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.
Для ИГХ-исследования срезы толщиной 3—4 мкм монтировали на высокоадгезивные предметные стекла (Polysine Slides, Gerhard Menzel GmbH). Депара-финирование и ИГХ-исследование проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max (Leica). Выявление Нр в биоптатах СОЖ осуществляли с помощью первичных антител к Нр (Dako, поликлональные, разведение 1:200). Также использовали первичные антитела к Bax (Santa Cruz Biotechnology, клон B-9, разведение 1:150) и Bcl-2 (Dako, клон 124, разведение 1:200). В каждой серии препаратов использовали соответствующий положительный и отрицательный контроль. Срезы докрашивали гематоксилином. Препараты исследовали с помощью световой микроскопии.
Иммунопероксидазную реакцию с антителами к Нр оценивали как положительную при наличии окрашивания и как отрицательную — при его отсутствии. При наличии инфицирования Нр отмечалась локализация бактерий на слизистых поверхностных эпителиальных клетках и в глубине желудочных ямок. При иммунопероксидазной реакции с антителами к Bax и Bcl-2 оценивали окрашивание цитоплазмы эпителиальных клеток желез желудка; интенсивность окрашивания определяли полуколичественным методом. Для анализа данных типы экспрессии Bax были объединены в 2 группы: пониженная и повышенная экспрессия.
Для визуализации изображения использовали цифровую камеру Leica.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета анализа Excel. Сравнительный анализ выполнен методом Пирсона х2, точным методом Фишера. Критерием достоверности был уровень р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выявление Нр ИГХ-методом показало наличие обсемененности СОЖ у 6 (23%) пациентов с ПГГ (поровну в подгруппах с легкой и среднетяжелой степенью (см. рисунок, а). В контрольной группе Нр определен примерно с такой же частотой (18%). В группе больных ПГ без признаков ПГГ не оказалось ни одного с Нр, что, возможно, является случайностью и связано с небольшой выборкой (табл. 1). Никакой зависимости между обсемененностью Нр и такими морфологическими признаками, как тонко-
22
№б, 2014 Молекулярная медицина
или толсто кишечная метаплазия, воспалительная инфильтрация, атрофия желез нами не выявлено.
Связь между инфекцией Нр и тяжестью проявлений ПГГ до сих пор продолжает обсуждаться. Еще в 1985 г. Т. МсСогшаск при изучении частоты выявления Нр в СОЖ у пациентов с ПГ показал, что колонии Нр в желудочных биоптатах встречаются у больных с ПГ реже, чем у пациентов без признаков нарушения портальной гемодинамики [14]. Исследования А.Г. Жукова [8] показали, что нарастание тяжести ПГ сопровождается снижением частоты обнаружения Нр в СОЖ. В одном из последних исследований показана ассоциация инфекции Нр с ПГГ и степенью ее тяжести [1]. При этом ряд авторов отрицают связь ПГГ с данной инфекцией [10, 11]. Мы также не отметили статистически значимой разницы между группами пациентов в зависимости от наличия Нр, а также взаимоотношения между степенью тяжести ПГГ и обсемененностью Нр.
ИГХ-исследование биоптатов СОЖ у пациентов с ПГГ показало, что пониженная экспрессия проапоптотического белка Вах отмечалась у 15 (58%) обследованных (см. рисунок, б), повышенная — у 11 (42%). В группе с легкой степенью гастропатии пониженное содержание Вах выявлено в 46%, повышенное — в 54% наблюдений. В группе со средней степенью гастропатии пониженная экспрессия Вах обнаружена у 69%, повышенная — у 31% пациентов. У пациентов с ПГ без признаков ПГГ распределение экспрессии Вах имело ту же закономерность, что и в группе с легкой степенью ПГГ: 44% случаев с пониженной экспрессией и 56% — с повышенной (см. рисунок, в). При этом в контрольной группе в 100% случаев выявлена повышенная экспрессия данного маркера (табл. 2).
Сравнение экспрессии Вах в группах пациентов показало, что его в эпителиальных клетках желез желудка она достоверно ниже у больных ПГГ, чем в контрольной группе (р<0,05). При сопоставлении экспрессии данного маркера в подгруппах с легкой и среднетяжелой степенью ПГГ с показателем в контрольной группе также оказалось, что она достоверно ниже в каждой из групп, а также в пациентов с ПГ без ПГГ, чем в контрольной группе (р<0,05) (см. табл. 2).
Достоверных различий в экспрессии Вах не выявлено при сопоставлении следующих групп: гастропа-тия легкой и среднетяжелой степени (р>0,05), ПГГ и ПГ без признаков гастропатии (р=0,25), гастропатия легкой степени и ПГ без ПГГ (р=0,34), гастропатия средней степени и ПГ без ПГГ (р=0,47).
в•
Определение Нр и факторов апоптоза с помощью ИГХ-метода: а — Нр на поверхности СОЖ пациента с ПГГ. х400; б — пониженная экспрессия Вах в эпителиальных клетках СОЖ при ПГГ. х200; в — повышенная экспрессия Вах в эпителиальных клетках СОЖ у пациента с ПГ. х200; г — экспрессия Вс1-2 в железе с тонкокишечной метаплазией, отсутствие экспрессии в остальных железах; также отмечается окрашивание клеток воспалительного инфильтрата. х200. а—г — ИГХ-окраска
Сопоставление уровня экспрессии Вах с наличием инфицирования Нр ни в одной из групп ассоциаций не выявило. Вместе с тем воспалительный ответ, вызванный колонизацией СОЖ Нр, приводит к продукции активных форм кислорода и азота, провоспалительных цитокинов, а также выбросу проапоптотических молекул, таких как фактор некроза опухоли-а, БаБЬ [6]. Известно, что у пациентов с хроническим гастритом при наличии данной инфекции увеличивается экспрессия антиапоп-тотических белков Вс1-2 и Вс1-х1, но снижается — антиапоптотического белка сурвивина [15]. Таким образом, влияние Нр на механизмы апоптоза эпителиальных клеток при ПГГ требует дальнейшего изучения.
Таблица 1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НР В СОЖ У ПАЦИЕНТОВ С ПГГ И В ГРУППАХ СРАВНЕНИЯ
Группа Нр+, абс. (%) Нр", абс. (%)
ПГГ 6 (23) 20 (77)
Всего: легкой степени среднетяжелой степени 3 (23) 3 (23) 10 (77) 10 (77)
ПГ 0 9 (100)
Контрольная 2 (18) 9 (82)
Молекулярная медицина №6, 2014
23
Таблица 2
ЭКСПРЕССИЯ BAX В СОЖ У ПАЦИЕНТОВ С ПГГ, ПГ БЕЗ ПРИЗНАКОВ ГАСТРОПАТИИ И В КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЕ
ПГГ ПГ без гастропатии Контрольная группа
Экспрессия Bax всего легкой степени средне-тяжелая
абс. (%)
Пониженная 15 (58)* 6(46)* 9 (69)* 4 (44)* 0
Повышенная 11 (42) 7 (54) 4 (31) 5 (56) 11 (100)
Примечание. * — p<0,05.
ИГХ-исследование экспрессии антиапоптотиче-ского белка Вс1-2 показало его отсутствие в эпителиальных клетках СОЖ во всех группах в 100% случаев. Исключение составили железы, подвергшиеся тонко- или толстокишечной метаплазии (биоптаты СОЖ 3 пациентов с легкой степенью гастропатии и 2 — с ПГ без гастропатии). В этих железах определялась экспрессия Вс1-2 (см. рисунок, г).
Таким образом, согласно полученным нами данным, у пациентов с ПГГ, а также с ПГ без признаков гастропа-тии отмечалось подавление апоптоза за счет снижения (по сравнению с контрольной группой) содержания активатора апоптоза Вах при отсутствии экспрессии ингибитора апоптоза Вс1-2 в железах СОЖ. Т.е. процесс обновления эпителиальных клеток СОЖ при данном заболевании замедлен по сравнению с нормальной слизистой. Кроме того, аналогичная картина у пациентов с ПГ без ПГГ может свидетельствовать о том, что у них также появляются ранние признаки гастропатии, и им необходимо регулярное обследование желудка.
Процессы гибели клеток путем апоптоза остаются малоизученными при ПГГ. Известно лишь, что экспрессия члена семейства Bcl-2 белка PUMA, являющегося индуктором апоптоза, в СОЖ значительно увеличивается при ПГГ, в то время как в норме он продуцируется в небольшом количестве. PUMA передает сигналы смерти на митохондриаль-ную мембрану, где активирует проапоптотические белки Bax и Bak [16]. Белки семейства Bcl-2 находятся в постоянном динамическом равновесии, что, соответственно, влияет на развитие апоп-тоза клеток [13]. Мы определяли экспрессию 2 членов семейства — Bax и Bcl-2. Остальные же факторы апоптоза требуют дальнейшего изучения у пациентов с ПГГ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в нашем исследовании не выявлена связь инфекции Нр с ПГГ и ПГ без признаков гастропатии, а также со степенью тяжести ПГГ. Сравнение уровней экспрессии фактора апоптоза Bax в зависимости от присутствия Нр также не выявило ассоциаций ни в одной из групп. Полученные нами данные свидетельствуют о подавлении механизмов, запускающих апоптоз эпителиальных клеток СОЖ при ПГГ и при ПГ без признаков гастропатии. В обеих группах отмечено уменьшение содержания активатора апоптоза Bax при отсутствии экспрессии ингибитора апоптоза Bcl-2.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Sathar S.A., Kunnathuparambil S.G., Sreech S., Narayanan P., Vinayakumar K.R. Helicobacter pylori infection in patients with liver cirrhosis: prevalence and association with portal hypertensive gastropathy. Ann. Gastroenterol. 2014; 27: 48-52.
2. Biecker E. Portal hypertension and gastrointestinal bleeding: diagnosis, prevention and management. World J. Gastroenterol. 2013; 19 (31): 5035-50.
3. Draghia A.C. Histochemical and his-topathological study of the gastric mucosa in the portal hypertensive gastropathy. Romanian J. Morphology Embryology. 2006; 47 (3): 259-62.
4. Burak K.W, Lee S.S., Beck P.L. Portal hypertensive gastropathy and gastric antral vascular ectasia syndrome. Gut. 2001; 49: 866-72.
5. Dong L., Zhang Z-N., Fang P., Ma S-Y. Portal hypertensive gastropathy and its interrelated factors. HBPG Int. 2003; 2: 226-9.
6. Abbas Z., Yakoob J., Usman M.W., Shakir T., Hamid S., Jafri W. Effect of Helicobacter pylori and its virulence factors on portal hypertensive gastropathy and interleukin (IL)-8, IL-10, and tumor necrosis factor alpha levels. Saudi J. Gastroenterol. 2014; 20: 120-7.
7. Toyonaga A., Iwao T. Portal-hypertensive gastropathy. J. Gastroenterol. Hepatol. 1998; 13: 865-77.
8. Жуков А.Г. Морфологические особенности слизистой оболочки желудка у больных с портальной гипертензией. Дисс... канд. мед. наук. 2010.
[Jukov A.G. Morphologic features of gastric mucosa in patients with portal hypertension. Diss. cand. med. sci. 2010 (in Russian)]
9. Al Moflen I.A. Does Helicobacter pylori affect portal hypertensive gastropathy. Suadi J. Gastroenterol. 2007; 13 (2): 95-7.
10. Tsai C.J. Helicobacter pylori infection and peptic ulcer disease in cirrhosis. Dig. Dis. Sci. 1998; 43 (6): 1219-25.
11. Обуховский В.И. Портальная гапертензи-онная гастропатия у больных циррозом печени (клинико-морфологические исследования). Дисс. канд. мед. наук. 2006. [Obuhovsky V.I. Portal hypertensive gas-tropathy in patients with hepatic cirrhosis (clinic-morphologic research). Diss. cand. med. sci. (in Russian)]
12. Wu B., Zeng L., Lin Y., Wen Z., Chen G., Iwakiri R. Downregulation of cyclooxygen-ase-1 is involved in gastric mucosal apop-tosis via death signaling in portal hyperten-
sive rats. Cell Res. 2009; 19: 1269-78.
13. Белушкина Н.Н. Апоптоз клеток как пример межклеточного взаимодействия. В: Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин
C.Е. Межклеточные взаимодействия. 2-е изд. М.: Медицина; 2003; 187-218. [Belushkina N.N. Cell apoptosis as an example of intercellular cooperation.
In: Paltsev M.A., Ivanov A.A., Severin S.E. Intercellular cooperation. 2nd ed. M.: Medecine; 2003; 187-218 (in Russian)]
14. McCormack T.T., Sims J., Eyre-Brook I., Kennedy H.,Goepel J., Johnson A.G., Triger
D.R. Gastric lesions in portal hypertension: inflammatory gastritis or congestive gastropathy. Gut. 1985; 26: 1226-32.
15. Valenzuela M., Pérez-Pérez G., Corvalán A.H., Carrasco G., Urra H., Bravo D., Toledo H., Quest A.F.G.. Helicobacter pylori-induced loss of the inhibitor-of-apoptosis protein surviving is linked to gastritis and death of human gastric cells. J. Infect. Dis. 2010; 202 (7): 1021-30.
16. Tan S., Wei X., Song M., Yao J., Yang Y., Khatoon S., Liu H., Jiang J., Wu B. PUMA mediates ER stress-induced apoptosis in portal hypertensive gastropathy. Cell Death Dis. 2014; 5: e1128.
Поступила 2S июня 2014 г.
24
№6, 2014 Молекулярная медицина
