CC BY
103
гттт
Оригинальные исследования
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
гтт
Экспрессия эпителиальных [ЕМА, ЕЭА] и мезенхимальных (а-ЭМА, С031] антигенов в клетках пульпы зубов человека
М.И. Шамсутдинов, МЛ. Титова, Г.Т. Салеева, АЛ. Киясов Казанский государственный медицинский университет
The Expression of Epithelial (EMA, ESA) and Mesenchymal (a-SMA, CD31) Antigens in Human Dental Pulp Cells
M.I. Shamsutdinov, M.A. Titova, G.T. Saleeva, A.P. Kiyasov Kazan State Medical University
В отличие от мультипотентных мезенхимальных стромаль-ных клеток костного мозга одонтобласты не являются клетками истинно мезенхимального происхождения и относятся к клеткам зктомезенхимы, которые развиваются из нервного гребня. Кроме маркеров нервной ткани, в частности — нестина, дифференцирующиеся одонтобласты экспрессируют цитокератин 19. Нами была выдвинута гипотеза о том, что одонтобласты и их предшественники могут характеризоваться не только цитокератинами, но и другими маркерами эпителия, с помощью которых станет возможно определить как сами предшественники (стволовые клетки) одонтобластов, так и их нишу.
Для проверки этой гипотезы была изучена пульпа зубов человека (58 зубов), удаленных по ортодонтическим показаниям при воспалении пульпы или заболеваниях пародонта. Парафиновые срезы обрабатывали антителами, которые используются для выявления популяции стволовых клеток (c-kit, CD 31, CD 34) в том числе и в пульпе (—-SMA). Одновременно был проведен анализ экспрессии двух эпителиальных антигенов, которые широко используются для выявления эпителиальных клеток и дифференциальной диагностики опухолей (ЕМА, ESA).
В нашем исследовании впервые показано, что одонтобласты как эктомезенхимные клетки экспрессируют эпителиальные маркеры и, в частности, эпителиальный мембранный антиген.
Ключевые слова: одонтобласты, пульпа, стволовые клетки, иммуногистохимия.
Unlike multipotent mesenchymal stromal cells of bone marrow odontoblasts are not true mesenchymal cells and belong to cells of ectomesenchyme originating from the neural crest. Besides markers of the nervous tissue, in particular nestin, differentiating odontoblasts express cytokeratin 19 as well. A hypothesis was proposed that odontoblasts and their progenitors could be characterized by not only cytokeratins but another epithelial markers which can help in identifying both odontoblast progenitors (stem cells) and their niche.
To test this hypothesis human dental pulp was studied. The pulp was obtained from 58 teeth extracted for ortodontal indications with pulp inflammation and disorders of the parodont. Paraffin sections were processed with antibodies which are used to identify stem cell populations (c-kit, CD 31, CD 34) as well as within the pulp (—-SMA). At the same time the expression of two epithelial antigens that are widely used to identify epithelial cells and for tumor differential diagnosis (EMA, ESA) was analyzed.
Thus, our investigation was the first to show that odontoblasts as ectomesenchymal cells expressed epithelial markers and, in particular, an epithelial membrane antigen.
Key words: odontoblasts, pulp, stem cells, immuno-histochemistry.
Зубы и окружающая их кость челюстей развиваются в результате взаимодействия эпителиальных и мезенхимальных (эктомезенхимальных] клеток, поэтому в зубе можно выделить две популяции стволовых клеток: эпителиальные, из которых образуются амелоблаты, и мезенхимальные, дающие начало одонтобластам, цементобластам, остеобластам и фибробластам периодонтальной связки. Микроокружение [клетки и межклеточный матрикс], в котором находятся стволовые клетки, принято определять термином «ниша» стволовых клеток. Предполагают, что ниша эпителиальных [для амелобластов] стволовых клеток в резцах грызунов — это пришеечная область зуба [1, 2], а мезенхимальные стволовые клетки, из которых образуются одонтобласты, находятся в периваскулярных областях пульпы [3]. Не исключено, что одним из кандидатов на роль мезенхимальной стволовой клетки пульпы является перицит, поскольку in vitro эти клетки могут дифференцироваться
в остеобласты и одонтобласты [3—5]. Несмотря на все имеющиеся предположения и доказательства того, что мезенхимальные стволовые клетки можно выделить из пульпы зуба [6, 7], периодонтальной связки [8, 9] и зубного сосочка — в плодном периоде [10], тканевая ниша этих клеток, а также их морфо-функциональная организация in vivo до сих пор не известны. Среди мезенхимальных стволовых клеток зуба наибольший практический и теоретический интерес представляют стволовые клетки пульпы. В первую очередь потому, что после повреждения зуба именно пульпа вовлечена в процесс репаративного дентиногенеза, когда клетки начинают вырабатывать и откладывать новый дентинный матрикс для восстановления поврежденной области [11]. Неоднократно было показано, что в пульпе имеются клетки, из которых образуются предшественники одонтобластов [4, 12—16]. В то же время, сами кпет-ки-предшественницы [стволовые клетки], до сих пор не
-ф-
Оригинальные исследования
53
идентифицированы, а, следовательно, неизвестен и их фенотип. В отличие от мезенхимальных стволовых клеток костного мозга или жировой ткани одонтобласты не являются клетками истинно мезенхимального происхождения, а формируются из т. н. эктомезенхимы [17], берущей начало из региона нервного гребня. Кроме свойственных нервной ткани маркеров, в частности, нестина [18], дифференцирующиеся одонтобласты экспрессируют цитокератин19 [19] — белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток.
Учитывая вышесказанное, нами была выдвинута гипотеза о том, что одонтобласты и их предшественники могут экспрессировать не только цитокератины, но и другие маркеры эпителия, с помощью которых станет возможным определить сами предшественники одонтобластов и их тканевую нишу. Цель исследования — проверка гипотезы о возможности экспрессии клетками пульпы поверхностных эпителиальных антигенов с одновременным in situ анализом экспрессии антигенов, которые in vitro используют для выявления «стволового компартмента» пульпы зуба.
Материал и методы
В работе была использована пульпа, полученная из 58 зубов человека. Вид зуба и медицинские показания, по которым был удален зуб, представлены в табл. 1.
Зубы фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 24 ч. После чего извлекали пульпу. Для этого зуб подвергали равномерной механической нагрузке по всей длине до возникновения трещины. Без избыточного давления щель расширяли стоматологическими инструментами для эндодонтического лечения и извлекали пульпу. Выделенную пульпу помещали в 10% забуференный формалин, фиксировали 12 ч., осуществляли стандартную гистологическую проводку в ряду спиртов возрастающей концентрации и заливали в па-
рафин. Парафиновые срезы после депарафинизации обрабатывали антителами, позволяющими выявить in situ отдельные клеточные популяции стрептавидин-биотино-вым методом. В качестве хромогена для выявления пе-роксидазной активности использовали аминоэтилкарба-зол. Все первичные и вторичные антитела были получены из компании Novokastra (Великобритания). Характеристика первичных антител представлена в табл. 2.
Результаты и обсуждение
Проведенный в ходе выполнения работы иммуноги-стохимический анализ пульпы зуба человека позволил получить следующие результаты.
Экспрессия a-гладкомышечного актина
Экспрессия этого белка в пульпе здоровых зубов и пульпе зубов, удаленных по медицинским показаниям, была различной. В пульпе здорового зуба белок экспрессировали в основном гладкомышечные клетки кровеносных сосудов (рис.1А). Совершенно иную картину наблюдали в пульпе после обточки зубов под ортопедические коронки и при хроническом пульпите. При воспалении пульпы после подготовки зуба под ортопедическую конструкцию количество клеток, экспрессирующих —-гладкомышечный актин, которые в основном располагались в субодонтобластическом слое, было значительным и это уже были не единичные, а многочисленные —-гладкомышечный актин-позитивные клетки. В ряде случаев эти клетки располагались в виде многослойного пласта, лежащего на границе между одонтобластами и центральной часть пульпы (рис. 1Б). При хроническом пульпите
—
были обнаружены во всех зонах пульпы, а не только в субодонтобластическом слое. Более того, часть этих клеток располагалась непосредственно среди одонтобластов (рис. 1В).
Таблица 1. Характеристика зубов, из которых была выделена пульпа
Медицинские показания Моляры Премоляры Резцы Клыки Всего
Ортодонтические зубы 6 20 6 - 32
Воспаление пульпы 8 5 5 1 19
Заболевания пародонта 2 2 2 1 7
Таблица 2. Характеристика первичных антител
Антитела Клон Антиген Клетки, которые экспрессируют этот антиген
Анти-C-kit Т595 с-кК (рецептор к фактору стволовых клеток), С0117 Эпителии, глиальные клетки, тучные клетки, меланоциты
Анти-CD 31 1А10 С031 Эндотелиальные клетки, тромбоциты, гранулоциты, моноциты, В-лимфоциты
Анти-CD 34 QBEnd/10 С034 Эндотелиальные клетки, кроветворные стволовые клетки
Анти-а-ЭМА 1А4 а-гладкомышечный актин Гладкомышечные клетки, миофибробласты
Анти-ЕМА GP1.4 Эпителиальный мембранный антиген Эпителий
Анти-ЕЭА VU-1D9 Эпителиальный специфический антиген Эпителий, за исключением мезотелия
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009
Оригинальные исследования
м
•' * г »*■
■ . ' .. ’ л
. ■ : ■;■ .. fc ,
* .
ф: '■?, v/v
г* ~ 'S , Ч-Я*
' Л '■ чг?
» ‘Г
■ ' . : . * / • * . *. V0
':> •• V • t у
> < -
5 ...
" VJ
¿Я» Гг-, - ' * * *
i-
f:;K
*°ыХ. % £ V 5i* Cl
Рис. 7.
Иммуногистохимическое окрашивание на a-гладкомышечный актин.
Продукт реакции красного цвета:
А- в стенке сосудов интактной пульпы;
Б - в субодонтобластическом слое при воспалении пульпы; В - в стенке сосудов при хроническом пульпите.
Ув.: А,В-х400; Б - х200
—-Гладкомышечный актин используют в качестве маркера при изучении популяции малодифференцированных клеток, которые образуются из мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (мезенхимальных стволовых клеток) [20], кроме того, он часто присутствует в цитоскелете как стволовых, так и прогениторных клеток [21, 22]. При культивировании клеток коронковой пульпы, выделенной из моляров, было показано, что в культуре образуются узлы или центры минерализации, где происходит отложение фосфатов кальция, а клетки этих узлов экспрессируют —-гладкомышечный актин [23]. Таким образом, именно этот белок часто используется в качестве маркера клеток-предшественниц одонтобластов [24] при изучении стволовых клеток пульпы in vitro.
Данные, полученные в нашем исследовании, подтверждают предположение о том, что предшественники одон-
—
актин. Причем, при отсутствии патологии в пульпе
—
плазме гладкомышечных клеток и единичных клетках субодонтобластического слоя. При повреждении же зуба или пульпы количество таких клеток возрастает и расширяется зона их распределения в зависимости от степени выраженности действия повреждающего фактора. Сначала увеличивается количество клеток в субодонтобластическом слое, при более выраженном повреждении появляются клетки в центральных зонах пульпы, а затем и среди одонтобластов. Таким образом, на осно-
вании уже известных фактов и наших данных следует заключить, что предшественники одонтобластов могут экспрессировать —-гладкомышечный актин. Однако необходимо иметь в виду, что в ходе развития зуба на стадиях зубного зачатка и эмалевого органа в клетках эктомезенхимы этот протеин отсутствует [25]. Таким образом, —-гладкомышечный актин — не облигатный маркер предшественников одонтобластов и появляется в последних лишь при миграции этих клеток на периферию пульпы, в ходе ответных реакций на повреждение зуба для замещения погибших одонтобластов.
Экспрессия СО 31 и СО 34
Оба антигена были обнаружены в эндотелии кровеносных сосудов пульпы. Отличия в экспрессии этих двух антигенов были лишь в интенсивности окраски клеток эндотелия. При проведении иммуногистохимических реакций во всех случаях наблюдали более интенсивное окрашивание клеток с антителами против С034. В то же время паттерн распределения эндотелиальных клеток и кровеносных сосудов непосредственно в пульпе был одинаков, то есть отличалась только интенсивность окраски. Во всех здоровых зубах наблюдали несколько крупных сосудов, проходящих из корня в коронку зуба (рис. 2А) и капиллярное сплетение в субодонтобластическом слое. Аналогичные результаты были получены и другими авторами при использовании в качестве маркера эндотелия только С034 [26]. В тех случаях, когда
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 1, 2009
Оригинальные исследования
мы исследовали пульпу, выделенную из зубов на стадии обострения хронического пульпита, наблюдали выраженное увеличение количества капилляров в субодонтобластическом слое (рис. 2Б).
Кроме сосудов, которые имели четко выраженный просвет и находились ближе к центру пульпы, имелись многочисленные клетки, находящиеся в непосредственной близости с одонтобластами. Следует отметить, что слой одонтобластов в этих случаях терял свою морфологическую гомогенность, то есть имела место альтерация одонтобластов и появление рядом с ними вновь образующихся капилляров. В работе A. Graziano с соавт. (2008) была продемонстрирована способность CD34+ клеток, выделенных из пульпы зуба человека, дифференцироваться в преостеобласты, которые начинали синтезировать костный матрикс после трансплантации под кожу иммунодефицитным мышам [27]. Поэтому регистрируемое скопление CD34+ клеток в непосредственной близости от поврежденных одонтобластов, может свидетельствовать о том, что дифференцировка этих клеток возможна не только в преостеобласты, но и в пре-одонтобласты. Подтверждением этого могло быть обнаруженное нами появление CD34+ клеток в непосредственной близости от поврежденных одонтобластов при пульпите. Однако мы использовали два маркера эндотелиальных клеток и идентичность распределения CD31 + и CD34+ клеток позволила нам исключить возможность дифференцировки CD34+ клеток в одонтобласты. Увеличение плотности капиллярной сети и появление
Рис. 2. Иммуногистохимическое окрашивание на СП34 интактной пульпы [А] и при пульпите [Б].
Продукт реакции красного цвета. У в.: А - х 20; Б - х 40
эндотелиальных клеток в непосредственной близости с одонтобластами может быть проявлением ангиогенеза (образования новых сосудов за счет ответвления от уже существующих) или васкулогенеза (образование сосудов из предшественников эндотелиальных клеток), как одного из звеньев регенераторного ответа в пульпе. Последний является основным механизмом образования сосудов у эмбриона, но был описан в постоянных зубах человека [28]. Кроме того, было показано, что выделенные из пульпы зуба SP-клетки, экспрессирующие CD34, демонстрируют выраженный васкулогенный потенциал на модели ишемии конечности у мышей [29]. Таким образом, используя два маркера эндотелиальных клеток, один из которых является также маркером кроветворных стволовых клеток, мы не нашли подтверждения в пользу одонтогенного потенциала CD34+ клеток, а увеличение количества этих клеток, как и CD31 + клеток, при повреждении зуба может быть лишь ответной реакцией, направленной на восстановление метаболизма в пульпе.
Экспрессия c-kit (рецептор к фактору
стволовых клеток, CD 117]
При окрашивании с антителами против c-kit было обнаружено два типа клеток, которые экспрессировали этот антиген. Первая группа — это округлые клетки, расположенные в субодонтобластическом слое (рис. ЗА), а вторая группа — это веретеновидные и отростчатые клетки, которые локализовались в центральных отделах пульпы (рис. ЗБ). Следует отметить, что количество c-kit+ клеток значительно увеличивалось при воспалении пульпы в центральных зонах, и практически все клетки пульпы, прилежащие к слою одонтобластов, начинали экспрессировать рецептор фактора стволовых клеток при пульпите (рис. ЗВ, Г).
C-kit ^рецептор, с которым связывается фактор стволовых клеток (stem cell factor, SCF), их взаимодействие играет важную роль в пролиферации, дифференциров-ке и активации прогениторных клеток в различных биологических системах. Оба — и фактор, и его рецептор — были обнаружены в клетках пульпы, причем есть клетки, которые одновременно экспрессируют и лиганд, и рецептор [30]. При помощи проточной цитометрии и сортинга клеток группа итальянских исследователей под руководством G. Papaccio (2006) выделила из пульпы постоянных и молочных зубов популяцию (c-kit+/CD34+/ CD45~) клеток [31]. Эти клетки при создании определенных условий in vitro дифференцируются в остеобласты, мышечные трубочки, жировые или эндотелиальные клетки [32—37]. Исследователи обнаружили, что регуляция ряда генов ответственных за адгезию, строение цитоскелета и дифференцировку отличаются в остеобластах из кости от остеобластов из клеток пульпы. Поскольку ни в одной из работ не была обнаружена дифференцировка, выделенных клеток в одонтобласты, то, опираясь на данные полученные в нашем исследовании, можно предположить, что итальянские ученые выделяли c-kit+ клетки, которые локализованы в центральных областях пульпы. Более того, нет никаких противоречий с нашими данными по экспрессии клетками пульпы CD34. Если c-kit+/CD34+ клетки, использованные в выше указанных работах, получены из центральных областей, то это клетки истинно мезенхимального происхождения, среди них могут находиться мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (мезенхимальные стволовые клетки), что и было показано итальянскими учеными. Мы, как и группа G. Papaccio, не обнаружили
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009
I I I I I
■ I I I
Оригинальные исследования
фактов, подтверждающих дифференцировку Сй34+ клеток в одонтобласты. В тоже время, мы предполагаем, на основании данных по экспрессии —-гладкомышечного актина и с-кй, что предшественники одонтобластов находятся в субодонтобластическом слое пульпы. Другими
словами в пульпе находится как минимум два типа стволовых клеток — мезенхимальных и эктомезенхималь-ных, которые отличаются не только по происхождению и локализации внутри пульпы, но и по потенциям дальнейшего развития и дифференцировки.
'Г'Л' **¿4*0 'У* ' '■ ША*
V. *:<' *x/r- V¿
л 3> Ч - ■ і ' ■' _ • .
* ■ * °
- V '
\* V V - • 4'.' ^ M
V * * vV *- í \ * ,* *■ ’
4 ¿ ^ " чЧч V л ^ • *'
, ' «'y'1 t
%■ *
'' 4 v vv:. •
• >■ ^-4 * vv
.*5 4 ¿ * ; Jrt > ‘ 4>'
« ^ 4 ‘ % V
'V' ,-N’
•_ , \ ~ - A Jft
%
Рис. 3. Экспрессия c-k.it в интактной пульпе [А, Б] - округлые клетки в субодонтобластическом слое; при пульпите [В] - отросчатые клетки в центральной части < пульпы. Продукт иммуногистохимической реакции красного цвета.
* У в. х40
Экспрессия эпителиальных маркеров ЕМА (epithelial membrane antigen, эпителиальный мембранный антиген) — гликозилированные трансмембранные белки массой 40^425 kDa. В пульпе зуба ЕМА строго экспрессировали только одонтобласты. В здоровых зубах никакие клеточные элементы пульпы, за исключением одонтобластов, не экспрессировали на своей поверхности этот антиген (рис. 4А, Б). У одонтобластов хорошо прокрашивалась клеточная мембрана, но антиген не был обнаружен на мембране отростков клеток. При воспалении пульпы ЕМА выявлялся в клетках субо-донтобластического слоя. Причем не все клетки этого слоя экспрессировали ЕМА, а лишь те, которые находились ближе к периферии пульпы, то есть прилежали к слою одонтобластов (рис. 4В).
ESA (epithelial specific antigen, специфический для эпителия антиген) ^поверхностный гликопротеин (40 kD) экспрессируется на базолатеральных поверхностях эпителиальных клеток. ESA не был обнаружен ни в одном из исследованных зубов (рис. 4Г).
Из двух эпителиальных антигенов, которые широко используются для выявления эпителиоцитов и дифференциальной диагностики опухолей, только ЕМА был
обнаружен в пульпе зуба. Этот антиген присутствовал на мембране одонтобластов и их предшественников. Проанализировав научную литературу, мы можем сказать, что мы впервые описали экспрессию эпителиального мембранного антигена в одонтобластах человека. Таким образом, наша гипотеза о том, что одонтобласты, как эктомезенхимные клетки, могут экспрессировать не только цитокератины, но и другие маркеры эпителия, подтвердилась. Более того, это еще одно подтверждение того, что одонтобласты развиваются из нейроэктодермы, потому что ЕМА был обнаружен в клетках паутинной оболочки, эпендимоцитах и глиальных опухолях.
Следовательно, одонтобласты и их предшественники экспрессируют ЗМА. В пульпе зуба присутствует как минимум два типа стволовых клеток — мезенхимальные и эктомезенхимальные. Это обстоятельство необходимо учитывать при культивировании смешанной популяции клеток, полученной из пульпы, а эпителиальный мембранный антиген может быть использован в качестве маркера одонтоцитогенеза при поиске условий направленной дифференцировки стволовых и проге-ниторных клеток пульпы в одонтобласты.
А
Оригинальные исследования
Рис. 4. Иммуногистохимическое окрашивание на ЕМА [А, Б) - в интактной пульпе, [В] - при пульпите; ESA [Г] в интактной пульпе отдельных клетках и слое одонтобластов. Продукт реакции красного цвета. У в.: А,В,Г-х40; Б - х 100
ЛИТЕРАТУРА:
1. Harada Н., Kettunen P., Jung H.S. et all. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J. Cell Biol. 1999; 147: 105—120.
2. Mitsiadis T.A., Barrandon 0., Rochat A. et al. Stem cell niches in mammals. Exp. Cell Res. 2DD7; 313(161: 3377—85.
3. Shi S., Gronthos S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone Miner. Res. 2003; 18(41: 696-704.
4. Alliot-Licht B., Bluteau G., Magne D. et al. Dexamethasone stimulates differentiation of odontoblast-like cells in human dental pulp cultures. Cell Tissue Res. 2005; 321(3): 391—400.
5. Lovschall H., Mitsiadis T.A., Poulsen K. et all. Coexpression of Notch3 and Rgs5 in the pericyte-vascular smooth muscle cell axis in response to pulp injury. Int. J. Dev. Biol. 2007; 51: 715—721.
6. Gronthos S., Mankani М., Brahim J. et al. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs] in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97(251:.13625-30.
7. Miura М., Gronthos S., Zhao M. et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100(10): 5807-12.
8. Seo B.M., Miura М., Gronthos S. et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. Lancet 2004; 364(9429): 149-55.
9. Seo B.M., Miura М., Sonoyama W. et al. Recovery of stem cells from cryopreserved periodontal ligament. J. Dent. Res. 2005; 84(10): 907-12.
10. Morsczeck C., Gotz W., Schierholz J. et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biol. 2005; 24(2): 155-65.
11. Mitsiadis T.A., Rahiotis C. Parallels between tooth development and repair: conserved molecular mechanisms following carious and dental injury. J. Dent. Res. 2004; 83(12): 896—902.
12. About I., Bottero M.J., de Denato P., Camps J. et al. Human
dentin production in vitro. Exp. Cell Res. 2000; 258(1): 33—41.
13. About I., Mitsiadis T.A. Molecular aspects of tooth pathogenesis and repair: in vivo and in vitro models. Adv. Dent. Res. 2001; 15: 59-62.
14. Gronthos S., Mankani M., Brahim J. et al. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97(25): 13625-30.
15. Gronthos S., Brahim J., Li W., Fisher L.W. et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J. Dent. Res. 2002; 81(8): 531—5.
16. Tecles 0., Laurent P., Zygouritsas S. et al. Activation of human dental pulp progenitor/stem cells in response to odontoblast injury. Arch. Oral Biol. 2005; 50(2): 103-8.
17. Graham A. The neural crest. Curr. Biol. 2003; 13(10): R381—4.
18. Kuratate M., Yoshiba K., Shigetani Y. et al. Immunohistochemical analysis of nestin, osteopontin, and proliferating cells in the reparative process of exposed dental pulp capped with mineral trioxide aggregate. J. Endod. 2008; 34(8): 970-4.
19. Webb P.P., Moxham B.J., Ralphs J.R., Benjamin M. Cytoskeleton of the mesenchymal cells of the rat dental papilla and dental pulp. Connect. Tissue Res. 1995; 32(1-4): 71—6.
20. Kinner B., Zaleskas J.M., Spector M. Regulation of smooth muscle actin expression and contraction in adult human mesenchymal stem cells. Exp. Cell Res. 2002; 278(1): 72-83.
21. Cai D., Marty-Roix R., Hsu H.P., Spector M. Lapine and canine bone marrow stromal cells contain smooth muscle actin and contract a collagen-glycosaminoglycan matrix. Tissue Eng. 2001; 7(6): 829—41.
22. Yamada M., Kurihara H., Kinoshita K., Sakai T. Temporal expression of alpha-smooth muscle actin and drebrin in septal interstitial cells during alveolar maturation. J. Histochem. Cytochem. 2005; 53(6): 735—44.
23. Alliot-Licht B., Hurtrel D., Gregoire M. Characterization of alpha-smooth muscle actin positive cells in mineralized human dental pulp cultures. Arch. Oral. Biol. 2001; 46(3): 221-8.
24. Lopez-Cazaux S., Bluteau G., Magne D. et al. Culture medium modulates the behaviour of human dental pulp-derived cells: technical note. Eur. Cell Mater. 2006; 11: 35—42.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 1, 2009
Оригинальные исследования
25. Hosoya A., Nakamura H., Ninomiya T. et al. Immunohistochemical localization of alpha-Smooth muscle actin during rat molar tooth development. J. Histochem. Cytochem. 2DD6; 54C12): 1371—8.
26. Digka A., Lyroudia K., Jirasek T. et al. Visualisation of human dental pulp vasculature by immunohistochemical and immunofluorescent detection of CD34: a comparative study. Aust. Endod. J. 2DD6; 32C3]: 101-6.
27. Graziano A., d'Aquino R., Laino G. et al. Human CD34 1 stem cells produce bone nodules in vivo. Cell Prolif. 2DD8; 41 [11: 1—11.
28. Trubiani 0., Tripodi D., Delle Fratte T. et al. Human dental pulp vasculogenesis evaluated by CD34 antigen expression and morphological arrangement. J. Dent. Res. 2DD3; 82C9): 742—7.
29. lohara K., Zheng L., Wake H. et al. A novel stem cell source for vasculogenesis in ischemia: subfraction of side population cells from dental pulp. Stem Cells 2DD8; 26(91: 2408-18.
30. Gagari E., Rand M.K., Tayari L. et al. Expression of stem cell factor and its receptor, c-kit, in human oral mesenchymal cells. Eur. J. Oral. Sci. 2006; 114t5]: 409-15.
31. Papaccio G., Graziano A., d'Aquino R. et al. Long-term cryopreservation of dental pulp stem cells [SBP-DPSCs] and their
differentiated osteoblasts: a cell source for tissue repair. J. Cell Physiol. 2006; 208(21: 319-25.
32. Laino G., d'Aquino R., Graziano A. et al. New population of human adult dental pulp stem cells: a useful source of living autologous fibrous bone tissue [LABI. J. Bone Miner. Res. 2005; 20(B): 1394—402.
33. Laino G., Carinci F., Graziano A. et al. In vitro bone production using stem cells derived from human dental pulp. J. Craniofac. Surg. 2006; 17[31: 511-5.
34. Laino G., Graziano A., d'Aquino R. et al. An approachable human adult stem cell source for hard-tissue engineering. J. Cell Physiol. 2006; 206(31: 693-701.
35. d'Aquino R., Graziano A., Sampaolesi M. et al. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 2007; 14C6):1162-71.
36. Carinci F., Papaccio G., Laino G. et al. Comparison between genetic portraits of osteoblasts derived from primary cultures and osteoblasts obtained from human pulpar stem cells. J. Craniofac. Surg. 2008; 19C3]: 616—25.
37. Graziano A., d'Aquino R., Laino G. et al. Human CD34 1 stem cells produce bone nodule.s in vivo. Cell Prolif. 2008; 41C1 ]: 1—11.
Поступила 91.012009
А
