CC BY
51
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ИЗУЧЕНИЮ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
А.М. Коваленко, В. Ю. Жабина
Аннотация. Проведены экспериментальные исследования по изучению диагностической ценности лабораторных методов при туберкулезе крупного рогатого скота.
Ключевые слова: туберкулёз, крупный рогатый скот, эксперимент, ПЦР.
Обнаружение и детекция возбудителей микобакте-риальных и туберкулёзных инфекций животных и птиц, представляет собой одну из самых важных задач ветеринарной медицины. Её решение обеспечивается разнообразным арсеналом методических подходов, начиная от общего эпизоотологического комплексного метода исследования, клинических методик, бактериологических исследований, иммунохимических и молеку-лярно-генетических тестов. Применяются для детекции микобактерий туберкулёза применяются биохимические, аллергические и молекулярно-генетические тесты. Биохимические исследования в большинстве случаев не позволяют правильно установить родовую и очень редко видовую принадлежность. Поскольку ми-кобактерии туберкулёза можно рекультивировать на питательных средах лишь в случаях присутствия более 100 микробных клеток в 1 см3, то диагностическая ценность данного метода сводиться к выявлению животных находящихся на последней стадии развития туберкулёзного процесса (генерализованная стадия). А если учитывать тот факт, что при выращивании на питательных средах существует целый ряд ингибиторов тормозящих рекультивацию, то можно говорить о невероятности выделения на питательных средах микобактерий со слабыми рекультивирующими свойствами. К этому можно добавить, что в последнее время, в связи с широким применением в ветеринарной медицине антибиотиков широкого спектра действия, происходит клонирование в макроорганизме полирезистентных форм микобактерий, которые изменяют свои биохимические и тинкториальные свойства и, таким образом, плохо, а иногда и вовсе не выделяются на питательных средах. В последние десятилетия всё большую распространенность получают молекулярно-генетические тесты, которые способны обнаружить ДНК в исследуемых образцах специфические нуклеотидные последовательности генома микобактерий. Наиболее часто в клинической и ветеринарной медицине используется полиме-разная цепная реакция, в основе которой лежит амплификация нуклеотидной последовательности. Главное достоинство метода высокая чувствительность, а в результате получение десятков миллионов копий искомых последовательностей генома возбудителя. Разработка более совершенных, высокочувствительных, специфических диагностических систем, лечебных и профилактических препаратов при туберкулёзе крупного рогатого скота является наиболее актуальной в ветеринарной медицине.
Целью исследований явилось изучение эпизоотической ситуации по туберкулёзу крупного рогатого скота с использованием наиболее чувствительного современного высокоточного анализа (ПЦР).
Исследования проводились на поголовье крупного рогатого скота ООО "Семхоз Ракитянский" (ММК Ва-сильевка) неблагополучного по туберкулёзу крупного рогатого скота с ноября 2012 г., в бактериологическом отделе Ракитянской районной ветеринарной лаборатории Белгородской области и кафедры инфекционной и инвазионной патологии ФГБОУ ВПО «Белгородская ГСХА». Использовали эпизоотологический, аллергиче-
ский, бактериологический и патологоанатомический методы исследований. Для проведения массовых аллергических исследований использовали внутрикожную и офтальмо туберкулиновые пробы с ППД-туберкулином для млекопитающих производства Курской биофабрики.
Для бактериологического исследования использовали - заглоточные, подчелюстные, бронхиальные, сре-достенные лимфатические узлы и кусочки органов с подозрительными на туберкулёз изменениями. Пробы хранили в лаборатории до окончания исследований.
Кусочки органов и тканей, отмытые от консервирующей жидкости, промывают в стерильной дистиллированной водой или физиологическим раствором, измельчают, растирают в ступке со стерильным песком или стеклом и заливают 5-10% раствором серной или щавелевой кислоты в соотношении 1:4 на 10-30 минут. Затем кислоту удаляют, гомогенная масса промывается в течение 5-10 минут физиологическим раствором и используется для приготовления мазков и посева на питательные среды.
Обработку органов и тканей проводили не только щавелевой, но и 3-5% перекисью водорода и последующим удалением надосадочной жидкости, нейтрализацией гомогенной массы или срезов органов и тканей аммиаком.
Биологические исследования (биопроба) применили для обнаружения возбудителя болезни и определения его видовой принадлежности. Для биопробы использовали морских свинок. Биопробы от патматериала млекопитающих проводили на двух морских свинках. Для определения вида возбудителя туберкулёза заражали двух морских свинок. Биопробу проводят на животных, не реагирующих на туберкулин.
Суспензию патматериала вводили подкожно морским свинкам в области паха в дозе 1-2 мл. Через 35 дней морских свинок после диагностического убоя подвергали патологоанатомическим исследованиям на предмет наличия туберкулёзных изменений.
Патологоанатомический гомогенизированный материал применяли по выше упомянутой методике обработки патматериала, высевали на питательную среду Ливенштейна-Йесена и подвергали термостатированию в течение двух месяцев при температуре 37-39 С, проводя еженедельно осмотр питательных сред на предмет обнаружения микроколоний микобактерий.
Проведение исследований с использованием моле-кулярно-генетического теста проводили по следующей схеме. Клинический материал и образцы культур мико-бактерий отбирали одноразовыми инструментами в пробирки Эпендорфа и заливали 3-% раствором ЭДТА. Далее брали по 100 мкл образцов жидкой культуры микобактерий и использовали её для выделения ДНК без предварительной обработки. Кусочки паренхиматозных органов и лимфоузлы, размером 3-3-3 мл., помещали в пробирки объёмом 1,5 см3, и также использовали для выделения ДНК.
В пробирки 1,5 см3 вносили по 100 мкл исследуемых проб, добавляли по 300 мл. лизирующего раствора и тщательно перемешивали пипетированием 5-10 раз. Затем добавляли 15-20 мкм суспендированного сорбента, перемешивали на вортексе и ставили в штатив на 5-7 мин. до полного осаждения сорбента. Дополнительно проводили осаждение сорбента микроцентрифугированием при 5000-8000 об/мин в течение 30 сек, полученные супернатанты подвергали двукратному отмыванию по 300-800 мкл. растворами при 4-8 и 6-10 об/мин в течение 10 сек. Двукратно отмытые супернатанты убирали, а осадок сорбента помещали в термостат при 65 С в
течение 5 мин. Ресуспендировали сорбент в 30-40 мкл элюируещего буфера, помещая его обратно в термостат и периодически встряхивали его на вортаксе. затем мик-роцентрифугировали при 10000-15000 об/мин в течение 1 мин. Готовые образцы использовали для амплификации. Подготовленную реакционную смесь для которой использовали деионизирующую воду, смеси нуклеотид-трифосфатов и праймеров, перемешивали, раскапывали в микробирки Эпендорфа по 15 мкл и наслаивали сверху по 15 мкл расплавленного воска. Приготовленную верхнюю реакционную смесь, в которую входили 5-кратный реакционный буфер, дионизирующая вода и Taq-полимераза, перемешивали центрифугировали и раскапывали на поверхность застывшего воска. Затем наслаивали по 2 капли минерального масла и вносили под поверхность масла по 10 мкл ДНК, выделенной из проб и по 1 пробирки использовали для контроля. Готовые смеси ставили в амплификатор при следующих программах: 95 С - 5 мин; 95 С - 0,5 мин; 65 С - 0,5 мин; 72 С - 0,5 мин. Полученные ампликоны визуализировали с использованием электрофоретического анализа. Для этого использовали агарозу для электрофареза, 1-% р-р этидиаб-ромида и раствор однократного буфера. В камеру для горизонтального электрофореза в агарозном геле с постоянным источником энергии вносили приготовленные агарозные слои с луночками для амплификонов. В луночки вносили под раствор буфера ампликоны и подсоединяли постоянный источник энергии. Результат электрофореза в агарозном геле после извлечения из буфера располагали в трансиллюминатор для просмотра в ультрафиолетовом свете. Полосы элетрофореза фиксировали фотографированием.
Проведенными исследованиями установлено, что с первой по девятую серию опытов проведенных с ноября 2012 г. по август 2013 г. реагировало на ППД-туберкулин для млекопитающих 194, 99, 94, 166, 117, 58, 43, 7, 55 гол.
При проведении послеубойных диагностических исследований в соответствующие периоды исследований туберкулёзные изменения в лимфатических узлах (сре-достенных, бронхиальных) верхних дыхательных путей обнаружили у 41,75; 32,3; 37,9; 11,7; 4,3; 1,7; 25,6; 4% голов от общего числа реагирующих животных.
Разработанные нами совместно с сотрудниками НПО"Синтол" РАН РФ праймеры были синтезированы фосфоамитидным методом на синтезаторе ASM-1000 ("BioSet", Новосибирск, Россия). Все праймеры были обессолены и очищены методом электрофореза в поли-акриламидном геле (ПААГ). Сформированная тест-система подвергалась апробационному сравнительному изучению с ПЦР тест-системы ВНИИЭ (коммерческой).
Подвергли исследованию 29 проб патологоанато-мического материала (бронхиальные и средостенные лимфатические узлы), обработанного для уничтожения кислото неустойчивой микрофлоры. При проведении культуральных исследований с данными образцами патологоанатомического материала с использованием стандартной питательной среды Левенштейна-Йесена для микобактерий установлено, что в 10 случаях не выявлено роста микобактерий в течение 2 месяцев.
Данные таблицы 1 свидетельствуют, что с помощью культуральных исследований были выделены культуры микобактерий M. Bovis от заведомо пораженных туберкулёзом образцов, в 19 пробах, что составило 65,5%, а с помощью ПЦР тест- системы (коммерческой) выявлено последовательности ДНК специфичная для M. Bovis и M. Tuberculosis в образцах 18, что составило 62,6%. При использовании, разработанной нами ПЦР тест-системы было выявлено присутствие ДНК M. Bovis в 27 пробах, что составило 93%.
Таблица 1 - Результаты ПЦР исследований культур M. Bovis и пат. материала с туберкулёзными изменениям
Пат. материал Результаты исследований
№ п/п с туберкулёзными изменениями Культу-ральный метод ПЦР (Прототип НИИЗЖ) ПЦР (Предлагаемая нами) Примечание
1. - - - +
2. - - - +
3. - - - +
4. + - + +
5. + + + +
6. + + + + * Получен ные отри-
7. + + - -
8. + + - + цательные
9. + + + + результа-
10. + + + + ты в пробах связа-
11. + + + +
12. + + + + подавле-
13. + + + + нием
14. + + + + действия ДНК-полимера-зы щелочей и
15. + + + +
16. + - + +
17. - + - +
18. + + + + кислот
19. + - - + *Все
20. + + + + выделенные культуры были отнесены
21. + - - +
22. + + + +
23. + - + + к
24. + + + + Ы.БОУ18
25. + + + +
26. + - - -
27. + + + +
28. + + - +
29. + - - -
Низкий процент выявления ДНК с использованием коммерческой ПЦР тест-системы, объясняется тем, что в ней используется для выделения ДНК фенольные соединения, которые, в свою очередь, обладая ингиби-рующими свойствами, не позволяют работе ДНК поли-меразы. Поэтому при разработке собственной тест-системы на этапе подготовки ДНК к амплификации, т.е. пробоподготовки нами не использовались фенольные соединения.
Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что для диагностики туберкулёза крупного рогатого скота наиболее приемлемыми, являются по нисходящей: полимеразная цепная реакция (позволяющая выявлять до 93% инфицированных особей), па-тологоанатомический метод исследований; аллергическая диагностика и культуральные исследования (позволяющие выявлять до 65,5% инфицированных особей).
Список использованных источников
1 Bottger, E. C., Teske, A., Kirscher, P., Bost, S., Chang, H. R., Beer, V., and Hirschel, B. (1992) Disseminated "Mycobacterium genavense" infection in patients with AIDS. Lancet 340, 76-80.
2 Brown E.J., Goodwin J.L. // J.Exp.Med. -1988. -Vol. 167. -P.777-793.
3 Brown J.A., Harris S., White P.C. // Trends in Mycrobiolo gy.-1994, N2.-P.43-53.
4 Kirschner, P., Meier, A., and Bottger, E. C. (1993) Genotypic identification and detection of mycobacteria: facing novel and uncultured patogens, in Diagnostic Molecular Microbiology (Persing, D. H., Smith, T. F., Tenover, F. C., and White, T. J. Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, pp. 173-190.
5 Kirschner, P., Springer, B., Vogel, U., Meier, A., Wrede, A., Kiekenbeck, M., Bange, F.-C., and Bottger, E. C. (1993) Genotypic identification of mycobacteria by nucleic acid sequence
determination: report of 2-year experience in a clinical laboratory. J. Clin. Microbiol. 31, 2882-2889.
6 Rogall, T., Flohr, T., and Bottger, E. C. (1990) Differentiation of mycobacterium species by direct sequensing of amplified DNA. J. Gen. Microbiol. 136, 1915-1920.
7 Saba T.M., Blumenstock F.A., Shah D.M. et al. // Amer. Surg .-1984.-Vol.199.-P.87-96.
8 Woese, K. H. (1987) Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, 221-271.
Информация об авторах
Коваленко Анатолий Михайлович, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры инфекционной и инвазионной патологии ФГБОУ ВПО «Белгородская ГСХА».
Жабина Виктория Юрьевна, аспирант ФГБОУ ВПО «Белгородская ГСХА».
