CC BY
40
УДК 57.084.1. © Коллектив авторов, 2015
П.В. Глыбочко, Ю.Г. Аляев, В.Н. Николенко, Е.А. Безруков, Д.Ф. Кантимеров, Г.А. Машин, А.С. Титов, А.В. Проскура, К.В. Кудричевская ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СОЗДАНИЯ ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАТРИЦЫ НА ОСНОВЕ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗИРОВАННОЙ СОСУДИСТОЙ СТЕНКИ И КЛЕТОК СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЩЕКИ С ЦЕЛЬЮ ПРОВЕДЕНИЯ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ УРЕТРОПЛАСТИКИ ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, г. Москва
Наиболее эффективными методами лечения стриктур мочеиспускательного канала являются анастомотические и заместительные уретропластики. Потенциальные трудности, связанные с заместительной уретропластикой, следующие: осложнения в донорской зоне, дефицит тканей при протяженных стриктурах, дополнительный разрез и увеличение времени операции в связи с необходимостью получения лоскута или трансплантата. Тканевая инженерия может оказаться полезной в решении указанных выше проблем. Нами проведена оценка возможности создания матрицы для заместительной уретропластики в эксперименте на животных. В качестве матрицы использовалась децеллюляризированная трупная артериальная стенка. В эксперименте на первом этапе на крысах отмечены крайне слабые биоактивность и биодеградация децеллюляри-зированной матрицы из трупной артериальной стенки (ДМТАС) в связи с низкой иммуногенностью материала. На втором этапе успешно произведена заместительная пластика интраоперационно созданного дефекта уретры кролика с использованием трубчатой ДМТАС. Использование матрицы показало хорошие структурно-функциональные результаты. Учитывая результаты предыдущих этапов, была создана тканеинженерная конструкция на основе ДМТАС и клеток слизистой оболочки щеки. Тканеинженерная конструкция на основе трупной артериальной стенки и эпителиоцитов слизистой щеки может рассматриваться в качестве материала для заместительной уретропластики.
Ключевые слова: тканевая инженерия, регенеративная медицина, стриктура уретры, пластика уретры, децеллюляризи-рованная сосудистая матрица.
P.V. Glybochko, Yu.G.Alyaev, V.N. Nikolenko, E.A. Bezrukov, D.F. Kantimerov, G.A. Mashin, A.S. Titov, A.V. Proskura, K.V. Kudrichevskaya EXPERIMENTAL JUSTIFICATION OF THE DEVELOPMENT OF TISSUE ENGINEERING CONSTRUCTION USING MATRIX BASED ON DECELLULAR VASCULAR WALL AND CELLS OF BUCCAL MUCOSA FOR SUBSTITUTION URETHROPLASTY
The most effective methods for the treatment of urethral strictures are anastomotic and substitution urethroplasties. Potential difficulties associated with the substitution urethroplasty are complications in the donor area, the lack of tissue in long strictures, an additional incision and increase of operation time due to the need to obtain a flap or graft. Tissue engineering may prove to be useful in solving the above problems. We have evaluated the possibility of creating a matrix for substitution urethroplasty in animal experiments. We used decellular cadaveric arterial wall as matrix. At the first stage of the experiment on rats decellular matrix of cadaveric arterial wall (DMCAW) was marked by extremely poor bioavailability and biodegradation due to the low immunogenicity of the material. At the second stage plastic replacement of the intraoperative urethral defect on rabbit was made successfully by using tubular DMCAW. Good structural and functional results were shown using the matrix. Considering the results of the previous stages, the tissue-engineering construction on the basis of DMCAW and cells of buccal mucosa was created. Tissue-engineering construction based of cadaveric the arterial wall and epithelial cells may be regarded as a material for substitution urethroplasty.
Key words: tissue engineering, regenerative medicine, urethral stricture, urethroplasty, decellular vascular matrix.
Распространенность стриктур мочеиспускательного канала имеет лишь приблизительную оценку. В период с 1992 по 2000 годы зарегистрировано около 1,5 миллиона обращений по поводу сужений уретры [1].
Метаанализ литературы показал, что большинство стриктур передней уретры имеют ятрогенное происхождение (33%), идиопа-тические стриктуры составляют 33%, посттравматические - 19% и постинфекционные стриктуры - 15% [2].
В последние два десятилетия получила широкое распространение буккальная пластика уретры. Новый толчок для развития реконструктивной хирургии уретры дают современные возможности тканевой инженерии.
Цель настоящего исследования - создание тканеинженерной конструкции на основе децеллюляризированной матрицы из трупной артериальной стенки (ДМТАС), пригодной для заместительной уретропластики.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
• отработка технологии получения ДМТАС;
• оценка биосовместимости и биодеградации ДМТАС в эксперименте на крысах;
• оценка эффективности реконструкции дефекта уретры с использованием ДМТАС в эксперименте на кроликах;
• оценка возможности создания тканеинженерной конструкции на основе
ДМТАС и клеток слизистой оболочки щеки человека.
Материал и методы
Выбор стенки артерии человека в качестве основы для создания тканеинженерной матрицы обусловлен ее успешным использованием в сосудистой хирургии в качестве го-мографта [3,4].
Изъятие трупного материала производили в соответствии с приказами № 483 МЗ СССР от 14.06.1972 и № 189 от 19.08.1993 в условиях морга в течение 24 ч после констатации смерти. Механически удаляли периар-териальную клетчатку и фасциальный футляр, выделяли отходящие сосудистые ветви. Затем промывали водой (в течение 4 ч), физиологическим раствором (в течение 18 ч со сменой раствора каждые 6 ч), 1/15 М раствором двух-замещенного фосфата натрия (в течение 8 ч). Проводили ферментную обработку раствором террилитина при 40°С в течение 4 ч в фосфатном буфере рН 7,5-8,0 и расходом фермента 15-25 ПЕ/г влажной ткани. Промывали водой в течение 1 ч и обрабатывали 1% раствором лимонной кислоты в течение 1 ч; обрабатывали фосфатным буфером с рН 7,0-7,5 в течение 4 ч и промывали водой 4 ч.
Контроль децеллюляризации осуществляли морфологически. Промытые сосуды промокали салфетками для удаления избыточной влаги и упаковывали в двойной полимерный пакет: первый из полиэтилена, второй из дублированной пленки полиэтилен-фольга. Проводили радиационную стерилизацию (доза 2,5 Мрад).
Для оценки биосовместимости и биодеградации образцы ДМТАС размером 0,8^0,8 см (которые были предварительно разрезаны вдоль длинной оси сосуда, т.е. детубуляризи-рованы) имплантировали подкожно в межлопаточную область белым лабораторным крысам (средняя масса тела 350 г).
Имплантацию осуществляли под внутримышечным наркозом комбинацией следующих препаратов: золетил 100 (10 мг/кг) + ксилазин 2% (0,1 мл/кг) + атропин 0,1% (0,05 мг/кг). Использовали три типа ДМТАС: 1) на основе полнослойной стенки артерии; 2) с удаленной intima и внутренней третью media; 3) с удаленной адвентициальной оболочкой. Животных выводили из эксперимента на 7, 30, 60 и 90-е сутки после имплантации (по 3 животных на каждый срок). Область имплантации иссекали, а полученные образцы подвергались гистологическому исследованию.
Образцы тканей, предназначенные для морфологического исследования, фиксировали
в 10% растворе нейтрального формалина в течение 3 суток, проводили через серию спиртов возрастающей концентрации, заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикро-фуксином по Ван-Гизону для выявления колла-геновых волокон, орсеином для выявления эластических волокон, комбинированной окраской коллагеновых и эластических волокон по методам Ван-Гизон и Унна, толуидиновым синим для выявления кислых гликозаминогликанов. Полученные микропрепараты изучали с использованием светового микроскопа Olympus BX51(«Olympus», Япония), оснащенного цифровой видеокамерой SDU-252 («Спецтелетех-ника», Россия) при увеличениях 40,100,200,400.
Оценку эффективности реконструкции дефекта уретры с использованием трубчатой децеллюляризированной артериальной стенки проводили на самцах кроликов 2-3-летнего возраста, средняя масса которых составила 3,5 кг. Оперативное вмешательство осуществляли под внутримышечным наркозом по описанной выше методике. Проводили полную мобилизацию луковичной и проксимальной частей пенильной уретры кролика на протяжении 2,2-2,5 см (рис. 1а). После иссечения фрагмента уретры длиной 1,8 см (рис. 1б), проводили замещение последней трубчатой ДМТАС (рис. 1в). Операцию проводили под увеличением ><4,0. Анастомозы между культями уретры и концами трубчатой ДМТАС формировали путем наложения узловых швов из монофиламентного нерассасывающегося шовного материала пролен 5-0. (рис. 1 г).
Дренирование мочевого пузыря осуществлялось уретральным катетером Фолея № 6Ch в течение 7-10 дней после операции. В качестве антибактериальной терапии применялся энрофлоксацин-50 по 5 мг/кг 1 раз в день (за 30 мин до операции и на период дренирования мочевого пузыря уретральным катетером). Животных выводили из эксперимента на 7, 14, 30, 90, 180-е сутки после операции (по 3 кролика на каждый срок) путем создания двустороннего пневмоторакса под внутримышечным наркозом с использованием представленных выше препаратов. Ретроградную уретроцистографию выполняли в срок 30, 90 и 180 дней после операции под внутримышечным наркозом. Морфологическое исследование проводили по описанной выше методике.
Этап создания тканеинженерной конструкции на основе децеллюляризированной сосудистой матрицы и клеток слизистой оболочки щеки человека выполнен после подписания письменного согласия пациентом и по-
лучения разрешения локального этического комитета. В качестве матрицы была использована ДМТАС, полученная методом, описанным выше. Фрагмент слизистой оболочки щеки размерами 5*5 мм иссекали под местной анестезией 2% раствором лидокаина.
Рис. 1. Этапы уретропластики у кролика с помощью ДМТАС: а - полностью мобилизованная часть уретры (фигурные скобки); б - сформированный дефект уретры (фигурные скобки); в - в дефект уретры помещена ДМТАС (фигурные скобки); г - дистальный анастомоз (верхняя стрелка), проксимальный анастомоз (нижняя стрелка)
Клетки выделяли из данного фрагмента с использованием 0,2% раствора диспазы. Выделенные клетки культивировали в полной куль-туральной среде, состоящей из бессывороточной среды Кегайпосуе^М ^Ьсо®) с добавлением инсулина в концентрации 5 мкг/мл, гидрокортизона 5 мкг/мл, эпидермального фактора роста 10 нг/мл, холерного токсина 10"1и М, трансферрина 5 мг/мл, аденина 1,8 х 10-4 М, лио-тиронина 2х10-11М в увлажненной среде при температуре 37°С в СО2-инкубаторе при содержании СО2 5%. Смена питательной среды осуществлялась каждые 48 часов. При высевании на подготовленную матрицу размером 17х43 мм был использован третий пассаж эпителио-цитов из расчета 3*106 кл/см2, после чего культивирование продолжалось в течение 5 суток до имплантации конструкции. Длительность культивирования клеток перед высеванием на матрицу составила 5 недель.
Результаты и обсуждение
Непосредственно после децеллюляри-зации стенка артерии макроскопически выглядела разрыхленной. При микроскопии
ДМТАС представляла собой местами разрыхленный, местами плотный (рис. 2а.) коллаге-новый каркас стенки артерии. Артериальная стенка представлена бесклеточной структурой с частично сохраненными элементами эластической сети, в частности, с внутренней и наружной эластическими мембранами артерии и отдельными слабоокрашенными эластическими волокнами медии, средней оболочки (рис. 2б).
На 7-е сутки после имплантации в ДМТАС отмечалось разрыхление коллагеновых пучков вследствие отека ткани, а также определялись мелкие очаги воспалительной инфильтрации (рис. 2в.). В окружающей ткани отмечалась слабая лимфомакрофагальная реакция с небольшой примесью нейтрофильных лейкоцитов, в то время как соединительнотканная капсула вокруг ДМТАС к этому сроку еще не сформировывалась. На 30-е сутки образовывалась соединительнотканная капсула вокруг ДМТАС, выявлялись признаки частичной биодеградации наружных слоев имплантата (рис. 2г. ), что проявлялось в виде макрофагальной резорбции наружных слоев имплантата (бывшей адвентициальной оболочки сосуда).
К 60-м суткам продолжалась деструкция ДМТАС. При этом оставался лишь тонкий фрагмент имплантата, инфильтрированного макрофагами и лимфоцитами (рис. 2д.), тогда как большая часть имплантата к этому времени была резорбирована. На 90-е сутки почти во всех случаях наблюдалась полная резорбция имплантатов (рис. 2е).
Полученные данные свидетельствуют об очень слабой биоактивности ДМТАС вследствие низкой иммуногенности материала. Сроки резорбции составляют от 60 до 90 суток.
Для оценки эффективности реконструкции дефекта уретры с использованием трубчатой децеллюляризированной артериальной стенки в эксперименте на кроликах сравнивали до и послеоперационные уретрограммы (рис. 3а). На уретрограммах через 1 месяц после операции хорошо видна зона имплантации ДМТАС, затеков контрастного вещества нет, что свидетельствует о полном приживлении матрицы, просвет уретры сохранен (рис. 3б). Отличия уретрограмм в сроки 1 и 3 месяца незначительны. Через 6 месяцев после операции просвет уретры сохранен, однако отмечалось формирование дивертикула в зоне имплантации ДМТАС (рис. 3в).
Мочеиспускание восстановилось у всех животных после удаления катетера и сохранялось до конца наблюдения. Признаков облитерации просвета уретры не обнаружено.
Рис. 2. Гистологические характеристики ДМТАС: а - полностью децеллюризированный коллагеновый каркас артериальной стенки; эластические волокна также отсутствуют. Комбинированная окраска по Ван-Гизону и по Унну х200; б - сохранившиеся эластические мембраны (черная стрелка) и бледно окрашенные эластические волокна (красная стрелка.). Окраска орсеином. х 200; в - 7-е сутки после имплантации ДТМАС. Разрыхление коллагеновых пучков и очаги воспалительной инфильтрации. Комбинированная окраска по Ван-Гизону-Унну х 200; г - 30-е сутки после имплантации. Матрица (1), окруженная соединительнотканной капсулой (2), между ними зона деструкции матрицы макрофагами (3). д - 60-е сутки после имплантации. Большая часть матрикса (толстые стрелки) резорбиро-вана и замещена грануляционной тканью (тонкие стрелки). Окраска гематоксилином и эозином х 200; е - полное отсутствие матрицы через 90 суток после имплантации. Нерассасывающиеся швы над областью фиксации матриц. Макрофото
Рис. 3. Ретроградные уретрограммы кролика. а - до операции, уретра выделена фигурной скобкой; б - через 1 месяц после операции, зоны анастомозов указаны стрелками; в - через 6 месяцев после операции, дивертикул (указан стрелкой)
При морфологическом исследовании ДМТАС представляет собой бесклеточный коллагеновый каркас артерии. К 7-м суткам после операции отмечалась незначительная деградация по краям протеза (рис. 4а.). К 30-м суткам отмечалось формирование соединительнотканной капсулы вокруг имплантата, чаще всего отделенной небольшой щелью от его наружной поверхности. Начиная с 10-х суток после операции со стороны резидент-
ных тканей уретры наблюдался постепенный рост эпителиального пласта, который носит характер уроэпителия (рис. 4а.). Рост уроэпи-телия продолжался до 60-х суток до полной эпителизации внутренней поверхности капсулы (рис. 4б.). К 60-м суткам ДМТАС подвергалась деструкции и клеточной инфильтрации, а капсула протеза приобрела морфологические черты слизистой оболочки уретры (рис. 4б.).
Л
Рис. 4. Динамика резорбции ДМТАС в эксперименте на кролике: а - 7-е сутки после пластики уретры с использованием ДМТАС. Резорбция матрицы на торцах. Видна регенерация уроэпителия на поверхности соединительнотканной капсулы (стрелки). Окраска гематоксилином и эозином х 200; б - выстланная эпителием (стрелки) соединительнотканная капсула (1), деструкция матрицы (2).
Окраска гематоксилином и эозином х 400
Изучение децеллюляризированной сосудистой матрицы после 7 суток культивирования на ней клеток слизистой оболочки щеки свидетельствует о том, что клетки эпители-
ального и фибробластоподобного строения формируют слой на наружной (адвентициаль-ной) поверхности матрицы (рис 5.).
Рис 5. Тканеинженерная конструкция (микроскопическая картина).
Срез матрицы с эпителиальными (стрелка) и фибробластоподоб-ными (стрелка) клетками на адвентициальной поверхности. Окраска гематоксилином и эозином, х 400
Выводы
1. Коллагеновая матрица на основе децеллюляризированной трупной артерии человека обладает низкой биологической активностью и безопасна в качестве материала для заместительной уретропластики.
2. В эксперименте на кры-сах,биодеградация сосудистой матрицы (ДМТАС) наступает в течение 60-90 суток.
3. В эксперименте на кроликах при пластике уретры сосудистой матрицей (ДМТАС) выявлена медленная деструкция матрицы и прогрессирующая эпителизация соединительнотканной капсулы.
4. Использование ДМТАС в качестве материала для заместительной уретропластики в эксперименте на кроликах показало хороший
структурный и функциональный результат.
5. Культивированные эпителиоциты щеки формируют с матрицей стабильную тканеинженерную конструкцию.
Тканевая инженерия, являющаяся частью регенеративной медицины, интенсивно развивается. Различные матрицы и тканеинженерные конструкции уже используются для заместительной уретропластики как в эксперименте на животных, так и в клинических исследованиях. Разработанная нами децеллюляризированная матрица из трупной артериальной стенки проявила свойства, которые позволяют рассматривать ее в качестве материала для заместительной уретропластики. Кроме того, данная матрица может быть использована для создания тканеинженерной конструкции вместе с клетками слизистой оболочки щеки человека.
Авторы благодарят за помощь в работе над проектом зав. виварием А.В. Лузина, зав. каф. оперативной хирургии и топографической анатомии проф. С.С. Дыдыкина, зав. каф. иностранных языков И.Ю. Марковину, начальника отдела клинических исследований И.И. Ермолаеву, председателя независимого этического комитета проф. Д.А. Балалыкина, независимого эксперта проф. Н.А. Григорьева. Исследования выполнены при поддержке грантов РФФИ № 13-02-01363 и 13-04-12075.
Сведения об авторах статьи: Глыбочко Петр Витальевич - д.м.н., профессор, член-корр. РАН, ректор ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, директор НИИ Уронефрологии и репродуктивного здоровья человека. Адрес: 119435, г. Москва, ул. Б. Пироговская, 2, стр.1.
Аляев Юрий Геннадьевич - д.м.н., член.-корр. РАН, профессор, зав. кафедрой урологии лечебного факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Адрес: 119435, г. Москва, ул. Б. Пироговская, 2, стр.1. Николенко Владимир Николаевич - д.м.н., профессор, проректор по научной работе ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Адрес: 119435, г. Москва, ул. Б. Пироговская, 2, стр.1.
Безруков Евгений Алексеевич - д.м.н, профессор кафедры урологии лечебного факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Адрес: 119435, г. Москва, ул. Б. Пироговская, 2, стр.1. E-mail: [email protected]. Кантимеров Дамир Фанилевич - аспирант 1-го года кафедры урологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Адрес: 119435, г. Москва, ул. Б. Пироговская, 2, стр.1. E-mail: [email protected]. Машин Георгий Андреевич - ординатор 1-го года кафедры урологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Адрес: 119435, г. Москва, ул. Б. Пироговская, 2, стр.1. E-mail: [email protected]. Титов Александр Сергевич - студент 6-го курса лечебного факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Адрес: 119435, г. Москва, ул. Б. Пироговская, 2, стр.1. E-mail: [email protected] Проскура Александра Владимировна - ординатор 1-го года кафедры урологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Адрес: 119435, г. Москва, ул. Б. Пироговская, 2, стр.1. E-mail: [email protected]. Кудричевская Кристина Владимировна - студент 6-го курса лечебного факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Адрес: 119435, г. Москва, ул. Б. Пироговская, 2, стр.1.
ЛИТЕРАТУРА
1. Santucci, R.A. Male urethral stricture disease / R.A. Santucci, G.F. Joyce, M. Wise // J Urol. - 2007. - Vol. 177(5). - P. 1667-1674.
2. Pansadoro V. Iatrogenic prostatic urethral strictures: classification and endoscopic treatment / V. Pansadoro, P. Emiliozzi // Urology. -1999. - Vol. 53(4). - P. 784-789.
3. Леменев В.Л. Опыт клинического применения биопротеза кровеносного сосуда «Гомографт». Клинический опыт и проблемы коллагенопластики / В.Л. Леменев, В.С. Алябьев // Материалы научно-практической конференции ММА им. И.М. Сеченова. -М.,1999. - С. 143.
4. Авторское свидетельство № 1543599 от 15.10.1998.
