CC BY
85
32
Аграрный вестник Урала
№ 12 (79), 2010 г.
Ветеринария
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ОСТРОГО ПИЕЛОНЕФРИТА У ЖИВОТНЫХ РАЗЛИЧНЫМИ СПОСОБАМИ
Е. И. САМОДЕЛКИН (фото), доктор медицинских наук, профессор кафедры внутренних незаразных болезней,
Н. А. ТАТАРНИКОВА (фото), доктор ветеринарных наук, профессор, зав. кафедрой инфекционных болезней,
Пермская ГСХА,
П. В. КОСАРЕВА, кандидат медицинских наук, заведующая патоморфологическим отделом, Пермская ГМА,
Л. А. ЧЕТВЕРТНЫХ, кандидат медицинских наук, доцент, Пермская ГМА,
Т. В. КОЧИНОВА, кандидат фармалогических наук, доцент кафедры внутренних незаразных болезней, Пермская ГСХА, Л. Ю. МАЛЫХ, аспирант кафедры внутренних незаразных болезней, Пермская ГСХА,
Ю. Н. ЛЫХИНА, аспирант кафедры внутренних незаразных болезней, Пермская ГСХА
614045, г. Пермь, ул. Кирова, д. 124, кв. 11; тел. 8 912 888 40 57;
(342) 236-41-31; e-mail: [email protected]
Ключевые слова: экспериментальный пиелонефрит, модель, кровь, патоморфологические изменения внутренних органов.
Введение.
В современных условиях методологические подходы к моделированию на животных различной патологии человека определяются необходимостью обеспечить в
экспериментальных условиях максимально точное воспроизведение патологического процесса, лишенное каких-либо побочных реакций, искажающих результаты эксперимента. В многообразии экспериментальных моделей пиелонефрита на сегодняшний день существует несколько принципиально различающихся методических подходов.
Так, моделирование "восходящего" пиелонефрита путем введения иноку-лума в мочевой пузырь через катетер рекомендовано многими авторами [9,
4, 7]. Достаточно широко распространено и моделирование пиелонефрита путем прямого введения бактериальной культуры в почечную паренхиму [8, 5, 10]. Моделирование гематогенного пиелонефрита путем введения возбудителя непосредственно в кровь животного также рекомендовано несколькими авторами [6, 2, 1].
Недостатками существующих способов моделирования пиелонефрита путем применения оперативного доступа к органам мочевой системы являются, помимо развития у лабораторных крыс инфекционного процесса, являющегося конечной целью эксперимента, нанесение животному операци-
Experimental pyelonephritis, model, blood, pathomorphologicac change internal organs.
оннои травмы, что искажает регистрируемые в эксперименте показатели и тем самым уменьшает чистоту эксперимента и достоверность полученных результатов. К тому же при данных способах нередко развитие острого гноИного пиелонефрита, что нетипично для рядовоИ клиническоИ ситуации. Способы гематогенного заражения подразумевают использование в качестве инфекционного агента непатогенные, музеИные штаммы, не имеющие тропности к уроэпителию, применение которых также не позволяет создать у животного типичноИ клиники острого пиелонефрита. Кроме того, гистологические признаки воспалительного процесса регистрируются в интерстиции и почечных канальцах
и не выявляются в слизистои и строме лоханок и чашечек. В связи с этим разработка оптимальной модели пиелонефрита, лишенной нанесения животному операционной травмы и вместе с тем максимально приближенной к реальным клиническим условиям, остается на сегодняшний день актуальной задачей практической патофизиологии.
Материалы и методы.
Исследования проведены на 40 животных - нелинейных белых крысах, самцах и самках, четырехмесячного возраста массой тела 150-200 г., содержащихся в стандартных условиях вивария. Все эксперименты выполнены в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экс-
Таблица 1
Результаты морфометрических исследований ткани почек
экспериментальных животных
Показатель Интактные животные, n=10 Заражение St. saprophyticus 108 КОЕ/мл, n=10 Заражение E соїі 109 КОЕ/мл, n=10
Толщина ГБМ, мкм 10,37±0,864 19,01 ±1,641* 22,52±2,212*
Толщина БМ проксимальных извитых канальцев, мкм 34,68±7,038 47,5±3,501* 51,79±6,32*
Площадь мочевого пространства в почечном тельце, мкм2 1582,9±386,4 1090,034±394,4* 1122±235,5*
Площадь поперечного сечения капилляров в почечном тельце, мкм2 16,24±2,85 49,71±10,05* 48,96±9,242*
Площадь сечения в препарате, занимаемая воспалительной инфильтрацией % 0 32,94±1,14* 26,27±4,71
*p<0,05 по сравнению с интактными животными
№ 12 (79), 2010 г.
Аграрный вестник Урала
33
периментальных животных" (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755) и "Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях" от 18 марта 1986 г. на базе ЦНИЛ ГОУ ВПО "Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е. А. Вагнера Росздрава".
Моделирование острого пиелонефрита осуществляли двумя способами. В первой серии экспериментов пиелонефрит воспроизводили путем интра-перитонеального введения микробной суспензии. Лабораторным животным интраперитонеально однократно вводили суточную бульонную урокульту-ру St. saprophyticus (штамм № 1256) или лактозонегативной E. coli (штамм № 2899) в концентрации 108 и 109 КОЕ/мл соответственно, определяемой нефелометрическим методом, в количестве 400 мкл.
Во второй серии опытов пиелонефрит моделировали путем ректального введения урокультуры лактозонегативной E. coli с последующим острым стрессовым воздействием. Лабораторным животным ректально однократно вводили суточную бульонную урокультуру лактозонегативной Escherichia coli № 2899 в концентрации 109 КОЕ/мл в количестве 400 мкл. В последующие за заражением сутки животное подвергали острому холодовому стрессу при следующих условиях: t° = 0 + 2°С, экспозиция - 2 часа.
Были сформированы следующие экспериментальные группы: 1 - интак-тные животные, находящиеся в стандартных условиях вивария; 2 - интра-перитонеальное введение St. saprophyticus (108 КОЕ/мл); 3 - интра-перитонеальное введение E. coli (109 КОЕ/мл); 4 - ректальное введение E. coli (109 КОЕ/мл) - острый холодовой стресс.
Ежедневное наблюдение за животными включало регистрацию поведения, внешнего вида, физиологических функций. Через 14 дней после заражения животных выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии.
Сразу после наступления биологической смерти животного в асептических условиях забирали для проведения бактериологического исследования органы: почки, печень, селезенку, -а у животных с ректальным заражением и брыжеечные лимфатические узлы. Бактериологические исследования проводили по стандартным методикам [3]. Одновременно для гистологического исследования забирали почки, печень, тимус, селезенку, подвздошную кишку с пейеровыми бляшками и у животных с ректальным заражением - стенку толстой кишки. Кусочки тканей, толщиной 5-7 мм, фиксировали в 10 % ном забуференном по Лилли формалине (pH-7,2), гистологи-
Ветеринария
Таблица 2
Результаты морфометрических исследований органов иммунной системы экспериментальных животных
Показатель (M±m) И нта ктн ые животные, n=10 Заражение St. s aprophyticus 108 КОЕ/мл, n=10 Заражение E. coli 109 КОЕ/мл, n=10
Относительный объем коркового вещества в дольках тимуса, % 65,1 9±7,71 34,05±2,38* 36,22±2,71*
Относительный объем белой пульпы в селезенке, % 30,1 8±2,69 41,66±4,91* 42,71±4,82*
Относительный объем ПАЛМ в селезенке, % 12,72±2,45 33,33±2,98* 31,51±3,94*
Относительный объем светлых центров в белой пульпе, % 8,9±1,25 3,99±0,52* 5,18±2,68*
Количество крипт с дегранулирующими клетками Панета в гистологических срезах подвздошной кишки, n 0,8±0,051 3,9±0,982* 3,5±0,763*
Относительный объем светлых центров в лимфатических узелках пейеровых бляшек тонкой кишки, % 20,01±2,52 37,24±2,49* 35,17±3,97*
*p<0,05 по сравнению с интактными животными
Таблица 3
Характер патогистологических изменений в ткани почек экспериментальных животных, зараженных per rectum урокультурой E. coli, % животных в группе
Выявленные патологические изменения % животных, которым вводили культуру E. coli в концентрации 109 КОЕ/мл (I, n=10), %
Полнокровие сосудов почек 100
Краевое стояние лейкоцитов в венулах 60
Наличие участков зернистой дистрофии проксимальных извитых канальцев 90
Воспалительная инфильтрация межуточной ткани почки и стенки лоханки 100
Периваскулярно расположенные воспалительные инфильтраты 80
Воспалительная инфильтрация стенки мочеточника 60
Таблица 4
Характер патогистологических изменений в органах иммунной системы и ткани печени экспериментальных животных, зараженных per rectum урокультурой E. Coli концентрации 109 КОЕ/мл (n=10)
Выявленные патологические изменения, % животных
Отек коркового вещества тимуса 80
Набухание и десквамация эндотелиоцитов в корковом веществе 90
Краевое стояние лейкоцитов в венулах с высоким эндотелием 60
Отек ткани селезенки 80
Набухание эндотелия капилляров красной пульпы и маргинальной зоны 90
Наличие светлых центров в лимфатических узелках селезенки 100
Краевое стояние лейкоцитов в венулах 70
Утолщение ретикулярных волокон в строме селезенки 50
Воспалительная инфильтрация слизистой оболочки тонкой кишки 90
Набухание и десквамация эндотелия сосудов собственной пластинки слизистой оболочки 50
Выявление дегранулирующих клеток Панета в дне крипт 90
Выявление пролиферативных процессов в лимфатических узел ках пейеровых бляшек 100
Полнокровие центральных вен 80
Воспалительная инфильтрация паренхимы печени 90
Вакуольная дистрофия гепатоцитов 100
Полнокровие синусоидных капилляров 70
Воспалительная инфильтрация междольковой соединительной ткани 60
34
ческие препараты готовили по стандартным методикам с заливкой в гис-тамикс. Срезы, полученные на ротационном микротоме, депарафинировали и подвергали окрашиванию гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону. Морфометрические исследования гистологических структур выполнены при помощи программного пакета BioVision, version 4,0; Австрия.
При проведении статистической обработки результатов экспериментальных исследований при помощи программного пакета Biostat вычисляли среднее арифметическое и стандартное отклонение, сравнение между собой двух выборок проводили при помощи критерия Стьюдента и критерия Манна-Уитни (для выборок с характером распределения, отличным от нормального). Для оценки различий между несколькими случайными выборками использовали метод однофакторного дисперсионного анализа. Анализируя результаты повторных измерений, пользовались парным критерием Стьюдента.
Результаты и обсуждение.
При обследовании животных контрольной группы бактериологических или гистологических признаков развития пиелонефрита не выявлено.
У животных экспериментальных групп как гематогенное, так и ректальное заражение уропатогенными культурами Staphylococcus saprophyticus и Escherichia coli с последующим холодовым стрессом вызывало развитие пиелонефрита.
Установлено, что образцы биоматериала, полученные от интактных животных, были стерильны. Из ткани почек, селезенки и печени животных, которым уропатогенные штаммы вводили интраперитонеально, в 100 % случаев были изолированы культуры St.
Аграрный вестник Урала
saprophyticus и E. coli, по свойствам идентичные использованным для заражения штаммам, в концентрациях, превышающих 105 КОЕ/мл. При моделировании пиелонефрита путем ректального введения E. coli с последующим острым стрессом положительные результаты бактериологического исследования аутопсийного материала также были получены в 100 % случаев, культуры были выделены в концентрации 107-109 КОЕ/мл.
Гистологическое исследование органов экспериментальных животных, зараженных урокультурами бактерий интраперитонеально, выявило наличие микробного воспаления в ткани почек, выражающееся в полнокровии дуговых, междольковых сосудов и капилляров, воспалительной инфильтрации межуточной ткани почек и стенок лоханок без формирования абсцессов, наличии дистрофических изменений в эпителиоцитах проксимальных извитых канальцев нефрона, появлении белковых цилиндров в их просветах, а также в воспалительных изменениях стенок мочеточников. Более выраженные изменения получены в экспериментальных группах, зараженных урокультурами бактерий в высоких концентрациях (109 КОЕ/мл и
108 КОЕ/мл). Патогистологические изменения документированы
результатами морфометрических исследований (табл. 1).
Гистологическое исследование ткани тимуса выявило отек и разрежение коркового вещества, нечеткость границ между корковым и мозговым веществом, набухание и десквамацию эндотелиоцитов в сосудах коркового вещества. В периферических органах иммунной системы (селезенка, пейе-ровы бляшки тонкой кишки) выявлялись пролиферативные процессы в Т-
№ 12 (79), 2010 г.
_____________Ветеринария
и В-зависимых зонах. В слизистой оболочке подвздошной кишки обнаружено большое количество дегранулирующих клеток Панета. В ткани печени в дольках (вокруг центральных вен) и в меж-дольковой соединительной ткани наблюдалась умеренно выраженная воспалительная инфильтрация.
Результаты исследования подтверждены данными морфометрических исследований (табл. 2).
Гистологическое исследование аутопсийного материала, полученного от животных, у которых моделирование острого пиелонефрита осуществляли путем ректального введения культуры с последующим стрессовым воздействием, выявило в ткани почек изменения микробно-воспалительного характера, типичные для острого пиелонефрита (табл. 3).
В центральных и периферических органах иммунной системы животных выявлены пролиферативные процессы, сопровождающиеся увеличением количества клеток лимфоидного ряда в Т- и В- зависимых зонах и формированием светлых центров в лимфоидных узелках селезенки и пейеровых бляшек. В ткани печени наблюдались умеренно выраженные изменения воспалительного характера (табл. 4).
Заключение.
Интраперитонеальное или ректальное (с дополнительным холодовым воздействием) заражение экспериментальных животных взвесью уро-патогенных штаммов лактозонегативной Escherichia coli и Staphylococcus saprophyticus вызывает развитие острого пиелонефрита. Предложенные экспериментальные модели могут быть использованы для разработки патогенетической терапии острой инфекции мочевых путей.
Литература
1. Пармон Э. М., Камышников В. С., Зубовская Е. Т. и др. Изменение активности ферментов и спектра белков мочи при моделировании острого пиелонефрита / Достижения медицинской науки Беларуси. Минск, 2004. С. 68-71.
2. Лукьянов А. В., Долгих В. Т., Потиевский Э. Г. и др. Моделирование острого пиелонефрита у животных различных видов // Бюл. Сибир. Медицины. 2004. № 6. С. 42-46.
3. Приказ МЗ СССР "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений". М., 1985. 126 с.
4. Chromlek M., Tullus K., Hertting O. et al. Matrix Metalloproteinase 9 and Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 1 in Acute Pyelonephritis and Renal Scarring // Pediatric Research. 2003. Vol. 53. P. 698-705.
5. Fallahzadehi M. H., Noorafshan A., Tanideh N. et al. Effects of Betamethasone and Gentamicin on Renal Scarring Induced by Mannose-Sensitive E Coli Pyelonephritis in Rat // Iran. J. Med. Sci. 2004. Vol. 29. № 3. P. 130-133.
6. Griffith D. C., Harford L., Williams R. et al. In Vivo Antibacterial Activity of RWJ-54428, a New Cephalosporin with Activity
against Gram-Positive Bacteria // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2003. Vol. 47. № 1. P. 43-47.
7. Kadurugamuwa J. L., Modi K., Yu J. et al. Noninvasive Biophotonic Imaging for Monitoring of Catheter-Associated Urinary
Tract Infections and Therapy in Mice // Infection and Immunity. 2005. Vol. 73. № 7. P. 3878-3887.
8. Matsumoto T., Takahashi K. Prevention of Renal Scarring Following Bacterial Pyelonephritis // Infect. Urol. 2000. Vol. 13. № 5a. P. 19-21.
9. Russo Th. A., McFadden C. D., Carlino-MacDonald U. B. et al. The Siderophore Receptor IroN of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli Is a Potential Vaccine Candidate // Infection and Immunity. 2003. Vol. 71, № 12. P. 7164-7169.
10. Singal A. K., Bajpai M., Dinda A. K. Blockade of Rennin-Angiotensin system blunts the fibrotic response in experimental acute pyelonephritis // Journal of Indian Association of Pediatric Surgeons. 2005. Vol. 10. № 1. P. 20-24.
