CC BY
20
Журнал фундаментальной медицины и биологии оригинальные статьи
УДК 617.713- 007.64 - 089.843 - 092.9
П.А. Хлопонин1, А.Н. Стеблюк2
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИЛИАРНОГО ТЕЛА ПОСЛЕ ЛОКАЛЬНОЙ
КРИОДЕСТРУКЦИИ
Ростовский государственный медицинский университет,
кафедра гистологии, эмбриологии и цитологии 2Кубанский государственный медицинский университет,
Краснодарский филиал ФГУ «<МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Фёдорова
Минздравсоцразвития России»
Цель: изучить ультраструктурные проявления посттравматического воздействия криоаппликатора из пористо-проницаемого никелида титана на ткани цилиарного тела в стенке глаза кролика.
Материалы и методы: в эксперименте на 25 взрослых кроликах через 3, 7, 14 и 30 суток после локального криовоздействия фрагменты стенки глаза от экспериментальных и контрольных животных проходили соответствующую обработку для электронной микроскопии.
Результаты и выводы: В специфике эффекта криовоздействия и структурного ремоделирования элементов стромы и цилиарного тела убеждает уже первичный просмотр полученных фактограмм. При этом прицельный морфологический анализ перинекротической и отдаленной зон криоаппликации склеры и цилиарного тела к концу первой недели наблюдений свидетельствует о более выраженной сохранности их структуры по сравнению с последствиями обычного механического повреждения. На второй-третьей неделях эксперимента в прираневой зоне раневого дефекта, наряду с признаками его рубцевания, констатируются ультраструктурные проявления внутриклеточной регенерации и реорганизации всех миоидных и фиброзных элементов цилиарного тела, трансдифференцировки фибробластов в миофибробласты.
Ключевые слова: криоаппликация, ультраструктура, цилиарное тело, гладкий миоцит, регенерация, фи-бробласт.
P.A. Khloponin1, A.N. Steblyuk2
CILIARY BODY EXPERIMENTAL AND MORPHOLOGICAL RESEARCH AFTER LOCAL CRYODESTRUCTION
1Rostov State Medical University, Histology, Embryology and Cytology Department 2Kuban State Medical University, Krasnodar Branch of S.N.Fyodorov Federal State Institution «<MNTK «Eye Microsurgery» of the Ministry of Health of Russian Federation»
Purpose: To investigate ultrastructural manifestations of cryoapplicator made from a porous and permeable titan nikelid post-traumatic influence on ciliary body tissues in a rabbit's eye wall.
Materials and Methods: During the experiment on 25 adult rabbits 3, 7, 14 and 30 days after local cryoinfluence eye wall fragments taken from experimental and control animals passed the corresponding procedures for electron microscopy.
Results and Summary: Already received factogrammes primary viewing convinces in specificity of cryoinfluence effect and structural stromal and a ciliary body elements' remodeling. Thus pinpoint morphological analysis of perinecrotic and remote zones of a stroma and ciliary body cryoapplication testifies more expressive their structural integrity, in comparison with usual mechanical damage consequences by the end of the first supervision week. In a peritraumatic wound zone ultrastructural manifestations of all the myoid and fibrous ciliary body elements intracellular regeneration and reorganization, fibroblasts to miofibroblasts transdifferentiation are stated along with signs of its scarring on the 2-nd and 3-rd weeks of experiment.
Keywords: cryoapplication, ultrastructure, ciliary body, smooth muscle cell, regeneration, fibroblast.
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
Введение
При лечении основных форм рефрактерной глаукомы выполняются операции [1, 2], направленные на ограничение продукции внутриглазной жидкости с целью снижения внутриглазного давления и устранения болевого синдрома. К особо значимому вмешательству в этом направлении относится интраокулярная циклолазеркоагуля-ция цилиарных отростков. При её выполнении весьма перспективно применение автономного криоаппликатора, изготовленного из пористо-проницаемого никелида титана, отличающегося весьма специфичными свойствами [3]. Последние при быстром достижении сверхнизкой температуры на поверхности объекта обусловливают отсутствие эффекта прилипания криоинструмента к тканям, а механизм репаративных процессов в области криоразрушения достаточно оптимизирован [4-6].
Цель исследования - изучить ультраструктурные морфологические проявления посттравматического воздействия криоаппликатора из пористо-проницаемого никелида титана на ткани склеры и цилиарного тела глаза кролика в различные сроки эксперимента.
Материал и методы
Для оценки процессов, происходящих в тканях цилиарного тела, поставлен эксперимент на 17 кроликах породы Шиншилла обоего пола в возрасте до 2-х лет. Контрольная группа представлена 8 здоровыми животными. Операции проводились под общим обезболиванием. Наркоз осуществлялся внутримышечным введением 0,4 мл раствора золетила 100 мг/кг массы животного, в инстилляциях — дикаин.
После отсепаровки конъюнктивы в сторону лимба с последующим гемостазом из поверхностных слоев склеры выкраивался прямоугольный лоскут размером 4 х 4 мм основанием к лимбу с обнажением цилиарного тела. Выполнив прямую криодеструкцию последнего продолжительностью в 40 сек., возвращали склеральный козырёк в исходное положение, а на конъюнктиву накладывали непрерывный шов проволокой из нике-лида титана сечением 45-50 мкм. Дополнительное количество транссклеральных аппликаций на один глаз в зоне проекции цилиарного тела составило 4-5 по окружности глазного яблока. Основу рабочего элемента в использованном инструменте составлял крионоситель в виде пористого никелид-титанового стержня с заданной сквозной пористостью, заполнявшейся жидким азотом. Рабочая часть криоаппликатора способ-
на в течение 1,5-2 минут сохранять температуру, близкую к температуре кипения азота, и обеспечивать высокий эффект криохирургических манипуляций.
В сроки через 3, 7, 14, 30 суток после операции часть животных (11 кроликов) была выведена из эксперимента воздушной эмболией. Исследованный материал: кусочки стенки глаза, содержащие склеру и цилиарное тело, фиксировали в жидкости Карнуа, в 10% растворе нейтрального формалина, в 1% растворе тетраокиси осмия на фосфатном буфере при рН = 7,2 с префиксацией в 2,5% растворе глутаральдегида. После стандартной проводки, заливки в парафин и аралдит, ми-кротомии и ультрамикротомии гистологические срезы окрашивали общегистологическими методами; полутонкие — толуидиновым синим-азуром П-метиленовой синью; ультратонкие (часть материала от 6 глаз животных) контрастировали в растворах уранилацетата и цитрата свинца.
Результаты и обсуждение
С применением метода электронной микроскопии, который следует считать одним из классических методов нанотехнологий в морфологических исследованиях, изучены проявления реактивности тканевых элементов цилиарного тела и тканей близ расположенных к очагу воздействия криоаппликатора. Закономерным последствием последнего и независимо от методического приема в пораженной области выделены три зоны: эпицентр (2,5-3,0 мм) с обнаруживаемыми в нем необратимо измененными биологическими структурами; зона наиболее демонстративных морфологических изменений, в которой идентифицируются перинекротический и прилегающие к нему участки; отдалённая зоны.
В течение первой недели после операции в эпицентре повреждения обычно обнаруживаются необратимо измененные клетки (гладкие миоци-ты, фиброциты, меланоциты, эндотелиоциты) и пучки коллагеновых фибрилл, среди которых иногда встречаются морфофункционально активные макрофаги; клеточные экстравазаты в виде эритроцитов и лейкоцитов, единичные фиброциты с пикнотизированным или гетерохроматизи-рованным ядром и вакуолизированной цитоплазмой. Межклеточное вещество гомогенизируется, а коллагеновые волокна в нём подвергаются распаду на мелкие короткие и более тонкие пучки фибрилл. Стенки мелких сосудов микроцирку-ляторного русла деструктивно изменены. В их эндотелиальных клетках пикнотизированы ядра. В просвете сосудов типичны явления гемостаза (Рис. 1 а-в).
Рис. 1 (а-г). Наличие ультраструктурных проявлений изменений тканевых элементов в зоне эпицентра раневого дефекта в стенке глаза (склере) кролика через 5 суток (а-в) после воздействия криоаппликатора. Прираневые реактивноизмененные гладкие миоциты и пигментоциты в цилиарном теле стенки глаза кролика через 7 суток после локальной криоаппликации (г). Электронные микрофотографии.
К концу первой недели эксперимента в эпицентре и в прилегающей зоне часто встречаются сегментоядерные лейкоциты и лимфоциты, макрофаги. В прираневой зоне реснитчатого тела менее выражены явления гибели клеток и межклеточного вещества, встречаются молодые клетки фи-бробластического ряда. Гладкая мышечная ткань представлена комплексами относительно дезинтегрированных гладких миоцитов, что объясняется наличием проявлений незначительного межклеточного отека. Очевидно разрыхление межклеточного вещества и гликокаликса сарколеммы гладкомы-шечных клеток. Ядра большинства их имеют фестончатую оболочку, под которой обнаруживается полоска маргинированного хроматина. Здесь же под ядерной оболочкой, как правило, локализованы ядрышки (характерно и для пигментоцитов) (Рис. 1 г).
Отчётливы ультраструктурные изменения ор-ганелл энергетического аппарата — митохондрий (набухание и отёк, деструкция крист). Относительно сохранена организация сократительного аппа-
рата. Поражает низкое содержание свободных рибосом и гранул гликогена в цитоплазме одного из идентифицируемых лейомиоцитов, что свидетельствует об отсутствии в них объективных признаков внутриклеточной репаративной регенерации.
Вторая неделя — период, в котором происходят изменения, характеризующие процесс развертывания структурного ремоделирования в цилиарном теле. Это проявляется в отчётливой гетероморфности структуры его гладкой мышечной ткани. Через 7 суток после криоповреждения уже очевидны признаки «омолаживающей» ультраструктурной адаптивной перестройки некоторых гладких миоцитов. Так, в легко идентифицируемых «светлых» гладкомышечных клетках, несомненно её претерпевших (Рис. 2а, б), заметно увеличено число свободных рибосом и полисом, очевидны проявления биосинтетической активности ядра и ядрышка, увеличения относительного объема неструктурированной саркоплазмы, наличия отдельных миофиламентов или их пучков, расположенных дезориентированно и пр.
Ш
Ш
}У
V/
£ К
йШ
а
Рис. 2 а,б. Проявления «омолаживающей раздифференцировки» пограничных с повреждением гладкомышечных клеток цилиарного тела в стенке глаза кролика; 10-е сутки эксперимента.
Электронные микрофотографии.
В основном в светлых гладкомышечных клетках развит внутриклеточный компартмент экстра-целлюлярного биосинтеза. Заметно, что в рабочей (сократительной) части цилиарного тела очень выражены межмиоцитарные пространства, заполненные преимущественно аморфным компонентом межклеточного вещества. Изредка между мембранами контактирующих миоцитов обнаруживаются плотные или «щелевые» контакты. Пигментные клетки в составе реснитчатого тела, округляются и содержат зёрна меланина различные по диаметру, форме и плотности содержимого.
В прираневых участках цилиарного тела, как и в прилежащей к ним склере, очевидно появление
биосинтетически активных фибробластоподобных клеток с очень развитой гранулярной эндоплазма-тической сетью и наличием пучков тонких сократительных миофиламентов, мелкими округлыми бедными кристами митохондриями, обилием мелкогранулярной саркоплазмы, проявлениями активации лизосомального аппарата и пр. (Рис. 3а,б). На второй неделе эксперимента в прираневой зоне можно констатировать признаки внутриклеточной регенерации и реорганизации всех миоидных элементов, наиболее выраженные в периферических отделах их цитоплазмы.
•гКЛ
гп^ДГI !Р
штж
ШМ
б
Гшг&ТФщ-* чпк* ¿ят
Рис. 3а,б. Миофибробластоподобные клетки в пограничных с очагом криоаппликации участках цилиарного тела кролика и характерными ультраструктурнымим признаками. 10-е сутки эксперимента.
Электронные микрофотографии.
б
а
Журнал фундаментальной медицины и биологии
к\/
оригинальные статьи
Дополнить морфологическую картину прира-невого участка реснитчатого тела может ультраструктура стенок сосудов микроциркуляции крови (эндотелиоцитов и межэндотелиальных контактов,
люменальной поверхности), а также гомогенного и фибриллярного компонентов межклеточного вещества, адвентициальных клеток (Рис.4 а,б).
Рис. 4 а, б. Электронные микрофотографии эндотелиоцитов микроциркуляторного русла в цилиарном теле кролика
на 20-е сутки эксперимента. Электронные микрофотографии.
В прираневых участках цилиарного тела у экспериментальных кроликов через 20 суток после локальной криоаппликации уже незначительны проявления отека тканей. Вполне очевидно появление молодых меланобластов и небольшого количества фибробластов соединительной ткани, а редукция сосудов микроциркуляторного русла сопряжена с появлением единичных щелевидных полостей.
Тем не менее в пределах очага криоаппликакции обнаруживаются скопления рыхло расположенных дезориентированных и ещё продолжающих ультраструктурную адаптивную перестройку гладких миоцитов (Рис. 5 а,б) с проявлениями реактивных изменений ядерного, сократительного, энергетического и биосинтетического компартментов; заполнением межклеточных пространств в цилиарной мышце межклеточным веществом новообразую-щейся соединительной ткани. Здесь же в окружении пучков коллагеновых фибрилл встречаются активные формы фибробластов или их фрагментов, вполне доказательно интерпретируемых миофи-бробластов с соответствующими ультраструктурными характеристиками. Для последних очевидны проявления структурно-функциональной активации ядра и ядрышек, наличие пучков микрофила-ментов, формирующих внутриклеточный сократительный аппарат, множество мелких округлых бедных кристами митохондрий, развитый цитоске-лет и умеренное содержание свободных рибосом в клетке; обычно один из полюсов миофибробластов изобилует элементами гранулярной эндоплазмати-ческой сети и пластинчатого комплекса Гольджи, здесь же возможна встреча с лизосомами и ауто-фагосомами. Обнаруживаемые рядом с миофибро-бластами активные формы фибробластов или их
фрагменты убеждают в возможности реактивной миогенной клеточной трансформации.
На 30-е сутки настоящего эксперимента в очаге криовоздействия видны характерные проявления его активного склерозирования. Рыхлая волокнистая соединительная ткань поврежденного цилиар-ного тела реорганизуется во многих участках эпицентра, изолируя участки репаративно измененной гладкой мышечной ткани; иногда обнаруживаются крупные макрофаги. Поэтому можно заключить, что претерпевающая структурно-функциональную реорганизацию гладкомышечная ткань цилиар-ного тела представлена отдельными клеточными комплексами в организующейся соединительной ткани с большим количеством тонкостенных кровеносных сосудов. Типична ультраструктура меж-миоцитарных контактов, несмотря на возможные процессы секвестрирования клеточных мышечных комплексов в связи с активацией соединительной ткани. Большинство клеток фибробластическо-го дифферона являются отростчатыми с уже небольшим внутриклеточным объемом элементов гранулярной эндоплазматической сети и аппарата Гольджи, большой массой свободных рибосом и полирибосом, наличием секреторных везикул. Обнаруживаемые эпителиоподобные клетки цилиар-ных отростков имеют гетероморфные по структуре ядра, бедны органеллами, характеризуются наличием в цитоплазме скоплений гранул пигмента внутри ограниченных мембраной цистерн или вакуолей с относительно аморфным содержимым. Структура обнаруживаемых между выявляемыми в цилиарном теле клеточными элементами составляющих межклеточного вещества соответствует контрольной.
Рис. 5 а, б. Ультраструктурные особенности различных компартментов лейомиоцитов (а) и миофибробласта (б) цилиарного тела кролика спустя 20 суток после очаговой криоаппликации. Электронные микрофотографии.
Заключение
В специфике эффекта криовоздействия на репарацию тканей в цилиарном теле стенки глазного яблока убеждает уже первичный просмотр фактограмм проведенного гистологического анализа содержания и динамики наблюдаемых ультраструктурных изменений; при этом очевидны признаки его гемостатического и бактерицидного действия; не столь демонстративный интерсти-циальный отек. Возникает мысль о том, что под воздействием криоаппликатора из пористо-проницаемого никелида титана возможно изменение темпов резорбции и восстановления тканей в связи со спецификой воздействия эффекта охлаждения и вероятными особенностями структурного ремоде-лирования элементов склеры и цилиарного тела.
Сравнительное изучение параметров и ультраструктуры клеточных компартментов в исследованных зонах криоаппликации к концу первой недели эксперимента свидетельствует о сохраняющейся формальной структуре их составляющих (как элементов межклеточного вещества так и клеток) в исследованном объекте. Как и при обычном механическом повреждении, для эпицентра крио-аппликации склеры и цилиарного тела характерно
присутствие форменных элементов крови, макрофагов, наличие разломов коллагеновых фибрилл, деструктивных клеток и клеточных структур, признаков отека и др. Но вблизи эпицентра очевидны менее выраженные по глубине и масштабам деструктивные изменения всех обнаруживаемых в цилиарном теле клеточных элементов (фибробла-стов и фиброцитов, меланоцитов, лейомиоцитов и эндотелиоцитов кровеносных сосудов).
На второй-третьей неделях эксперимента в раневом дефекте и в прираневой зоне активнее проявляются процессы рубцевания волокнистой соединительной ткани с характерными признаками структурно-функциональной активации клеток фибробластического дифферона. При этом констатируются проявления внутриклеточной регенерации и реорганизации всех миоидных элементов. Особенно это проявляется в изменениях ультраструктуры ядер, синтетического и сократительного аппаратов реактивно измененных миоцитов в цилиарном теле. Наиболее привлекают внимание периферические отделы их цитоплазмы, где очевидно наличие проявлений не только внутриклеточной регенерации гладкой мышечной ткани, но и признаков трансдифференцировки фибробластов и лейомиоцитов в миофибробласты.
ЛИТЕРАТУРА
1. Астахов С.Ю., Астахов Ю.С. Современные тенденции в хирургическом лечении глауком // Глаукома: проблемы и решения. Всероссийская научно-практическая конференция. -Москва, 2004. - С.257-261
2. Uram M. Endoscopic cyclophotocoaugulation in glaucoma managenoent. // Curr. Opin. Ophthalmol.- 1995. - Vol.6, № 11. -Р.19-29.
3. Запускалов И.В., Гюнтер В.Э., Стеблюк А.Н. и соавт. Медицинские материалы и имплантаты с памятью формы Им-плантаты с памятью формы в офтальмологии / Т. 14. - М, 2012. - 189с.
4. Егорова Э.В. Морфологическое обоснование применения
низких температур в офтальмологии: Автореф. дис. канд. мед. наук. - М., 1968. - 19 с.
5. Мельник Д.Д., Гюнтер В.Э., Дамбаев Г.Ц. и соавт. Медицинские материалы и имплантаты с памятью формы. Пористо-проницаемые криоаппликаторы из никелида титана в медицине / Т. 9. - Томск: Изд-во «НПП МИЦ», 2010. - 304с.
6. Ходжаева А.М., Корымасов Е.А., Шакиров М.Н. Криогенное лечение больных с гемангиомами покровов тела пористо-проницаемыми аппликаторами из никелида титана //Материалы с памятью формы и новые медицинские технологии. Международная конференция. - Томск, 2010. - С.228-230.
