CC BY
12
УДК 612.841.1
Л.А. МУСИНА, Р.Ф. ШАКИРОВ, Р.З. КАДЫРОВ, О.Р. ШАНГИНА
Всероссийский центр глазной и пластической хирургии МЗ РФ, 450075, г.Уфа, ул. Р. Зорге, д. 67/1
Экспeримeнтaлüно-моpôoлoгическoе исслeдовaние влияния диспepгиpoванного аллогенного биoматeриaла на peгенeрацию poгoвицы
Мусина Ляля Ахияровна — доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела морфологии, тел. (347) 293-42-35, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0003-1237-9284
Шакиров Рустэм Франсович — врач-офтальмохирург, тел. (347) 293-42-28, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0002-6751-7800 Кадыров Радик Завилович — доктор медицинских наук, ученый секретарь, врач-офтальмохирург, и.о. директора, тел. (347) 293-42-35, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0002-6353-9084
Шангина Ольга Ратмировна — доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, заведующий лабораторией консервации тканей, тел. (347) 293-42-35, е-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0002-0343-1792, ORCID ID: 0000-0003-1686-1254
Гистологическими, иммуногистохимическими и электронно-микроскопическими методами исследованы энуклеированные глазные яблоки экспериментальных кроликов после химического ожога щелочью (2,5% р-р гидроксида натрия) и перилимбального введения аллогенного биоматериала. Для операций использовали диспергированную форму биоматериала "Стимулятор регенерации" (производится в ФГБУ ВЦГПХ МЗ России под маркой АЛЛОПЛАНТ®). Цель исследования — выявление влияния перилимбально введенного аллогенного биоматериала на регенерацию роговицы глаза кроликов после химического ожога. Морфологические исследования роговицы и лимбальной зоны глаза проводили на 7, 14, 30, 90 и 180 сутки после операции. Установлено, что перилимбальное введение биоматериала стимулирует регенеративные процессы в патологически измененной роговице. За счет низкой степени экспрессии клетками цитокина трансформирующий фактор роста TGF-ß1(фaктора фиброза) происходит ингибирование процесса грубого рубцевания тканей, что способствует полноценному восстановлению структурных элементов роговицы.
Ключевые слова: аллогенный биоматериал, перилимбальное введение, регенерация роговицы, трансформирующий фактор роста TGF-ß1.
DOI: 1032000/2072-1757-2018-16-4-133-139
(Для цитирования: Мусина Л.А., Шакиров Р.Ф., Кадыров Р.З., Шангина О.Р. Экспeримeнтaльно-моpфoлoгическoе исслeдовaние влияния диспepгиpoванного аллогенного биoматeриaла на peгенeрацию poгoвицы. Практическая медицина. 2018, том 16, № 4, C. 133-139)
LA МUSINA, R.F. SHАКIRОV, R.Z. MDIROV, ОБ. SHАNGINA
All-Russian Center for Eye and Plastic Surgery of the Ministry of Health of the Russian Federation, 67/1 R. Zorge Str., Ufa, Russian Federation, 450075
Experimental and morphological investigation of the dispersed allogeneic biomaterial effect on corneal regeneration
Musina L.A. — Doc. Biol. Sc., Leading Researcher of the Morphology Department, tel. (347) 293-42-35, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0003-1237-9284
Shakirov R.F. — physician-ophthalmosurgeon, tel. (347) 293-42-28, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0002-6751-7800 Kadyrov R.Z. — D. Sc. (medicine), Academic secretary, Acting Director General, tel. (347) 293-42-35, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0002-6353-9084
Shangina O.R. — Doc. Biol. Sc., Leading Researcher, Head of the Tssue Conservation Laboratory, tel. (347) 293-42-35, e-mail: [email protected], ORCID ID: 0000-0002-0343-1792, ORCID ID: 0000-0003-1686-1254
The histological, immunohistochemical and electron-microscopic methods were used to investigate the enucleated eyeballs of the experimental rabbits following the chemical burn by the alkali (2.5% of sodium hydroxide solution) and perilimbal insertion of the allogeneic biomaterial. The dispersed form of«regeneration stimulator» biomaterial was used for the operation. This type of the biomaterial is produced in the All-Russian Eye and Plastic Surgery Centre under the brand name "Alloplant". The aim of the investigation was to reveal the impact of the perilimbal inserted allogeneic biomaterial upon the damaged cornea of the rabbit eyes following the chemical burn. The morphological investigations of the cornea and zone of the eye limus were carried out on the 7th, 14th, 30th, 90th and 180th days after the operation. It was established that the perilimbal biomaterial insertion had stimulated regenerative processes in the pathologically changed cornea. Due to the low degree of the expression by the cytokine cells which was transforming the growth factor TGF-p1 (fibrous factor), the inhibition of the rough tissue scarring process was taking place, which contributed to the full restoration of the corneal structural elements.
Key words: allogeneic biomaterial, perilimbal insertion, corneal regeneration, transforming growth factor TGF-p.
(For citation: Musina L.A., Shakirov R.F., Kadyrov R.Z., Shangina O.R. Experimental and morphological investigation of the dispersed allogeneic biomaterial effect on corneal regeneration. Practical Medicine. 2018, Vol. 16, no. 4 , P. 133-139)
Введение
В ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии Минздрава России» (г. Уфа) разработан и внедрен в практику метод лечения кератоконуса с использованием трансплантационной технологии в виде перилимбального введения диспергированного аллогенного биоматериала «Стимулятор регенерации» (производится в ФГБУ ВЦГПХ МЗ России под маркой АЛЛОПЛАНТ®) [1]. Предложенный безопасный, малоинвазивный метод лечения благотворно влияет на состояние роговицы при различных стадиях кератоконуса. Результаты лечения биоматериалом зависят от стадии заболевания и проявляются при проведении повторных операций через 6 месяцев, 1 год. Существенный и статистически значимый рост остроты зрения и ее корригируемости особенно имеет место при второй стадии кератоконуса, а при прочих наблюдается стабилизация исходного состояния, что не менее важно для пациентов, имеющих заболевание с прогрессивным истончением роговицы, приводящим к ухудшению состояния роговицы и зрительных функций [2]. Известно, что кератоконус — это дегенеративное заболевание глаза, при котором потеря зрения происходит первоначально из-за неправильного астигматизма и близорукости, и вторично из-за рубцевания роговицы [3]. При заболевании изменяются все слои роговицы [4]. Определяется истончение роговицы, разрывы в боуменовой мембране, складки в строме роговицы. Иногда выявляются разрывы десцеметовой мембраны, заканчивающиеся острым отеком, а также нарушение контактов эпителия и стромы роговицы. В истонченной строме отмечено изменение тинкториальных свойств коллагеновых волокон вследствие их отека и разрушения, нарушение ортогонального расположения пластинок. Роговица вследствие структурных изменений истончается и принимает коническую форму. Экспериментальную модель кератоконуса
на животных воспроизвести очень сложно. Многие из перечисленных патоморфологических признаков заболевания встречаются при химическом ожоге роговицы. Поэтому мы посчитали корректным использовать экспериментальную модель с химическим ожогом для определения механизма влияния диспергированного аллогенного биоматериала на восстановление роговицы глаза. Цель нашего исследования — выявление влияния перилимбально введенного аллогенного биоматериала на регенерацию роговицы глаза кроликов после химического ожога.
Материал и методы исследования
В качестве экспериментальной модели щелочного ожога рогови-цы у кроликов применяли метод ОЬепЬегдег X [5]. Щелочной ожог роговицы вызывали аппликацией диска фильтровальной бумаги, смоченной 2,5% раствором гидроксида натрия (экспозиция-5 секунд) под местной анестезией (0,4% инокаином). В опытной группе животных (15 кроликов) через 24 часа после ожога делали перилимбальное обкалывание мелко диспергированным биоматериалом Алло-плант «Стимулятор регенерации», который готовили разведением 50 мг биоматериала в 5 мл физиологического раствора. Контрольную группу составили 6 кроликов с ожогами роговицы, но без обкалывания биоматериалом. Глазные яблоки у кроликов энуклеировали на 7, 14, 30, 90 и 180 сутки после операции, фиксировали в 10% забуференном формалине по Лилли. Вырезали роговицу вместе с прилежащей склерой, заливали в парафин. Эксперименты проводили в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приложение к Приказу МЗ СССР № 775 от 12.08.77, приказ Минвуза от 13 ноября 1984 г. №724), «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. и Федерального закона РФ
нн
«О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по методам Ван-Гизона и Маллори. Для фотографирования использовали микроскоп Leica108MD со встроенной камерой (Leica, Германия). Электронно-микроскопические исследования проводили стандартными методами на просвечивающем электронном микроскопе JEM 1011 (JEOL, Япония) со встроенной камерой. Иммуногистохимические исследования проводили с помощью иммуногистостейнера Leica Microsystems Вопй™ (Германия) с использованием поликлональных антител к TGF-b 1 -трансформирующему фактору роста (фактор фиброза), к PCNA - ядерному белку пролиферирующих клеток, к СД68 (маркер фагоцитарных макрофагов), к Thy-1 - маркеру стволовых мезенхимальных клеток костномозгового происхождения (Santa Cruz В^ес1ппо1оду, США). Для демаскировки использовали непрямую стрептавидин-биотиновую систему детекции Leica BOND (Novocastra™, Германия). Оценку спeцифичнoсти реакции проводили при окрашивании срезов без первичных антитeл.
Результаты исследования и обсуждение
Воздействие щелочи на роговицу кроликов вызывало отек роговичной стромы с дезорганизацией и гомогенизацией коллaгеновых волокон, деструкцией стромaльных клеток, а также полным paзрушением переднего эпителиального слоя. У кроликов контрольной группы в зоне лимба, начиная с 4-х суток, опpедeлялиcь признаки выраженной вocпалитeльнoй реакции в виде обширных пeривacкуляpных клеточных инфильтратов, которые сохранялись и в дaльнейшем. На больших увеличениях микроскопа диффepeнциpoвались самые разнообразные клетки: сегментоядерные нейтрофильные лейкоциты, эозинофильные гpaнулоциты, лимфоциты, плазмaтичeские клетки, макрофаги, малoдиффepeнцировaнные клетки. Вслeдствие ослaбления пpoлифepaтивной активности эпитeлиaльных клeток со стороны уцeлeвших т^ней (белок PCNA+ экспрeccировали единичные клетки) процесс эпитeлизaции роговицы
по срокам затягивался. К 7 суткам замедленная регенерация переднего эпителия приводила к появлению в центральной части поверхностных слоев роговой оболочки зоны некроза (рис.1). В глубоких слоях строма оставалась отечной и бесклеточной. В сроки 14 и 21 день в строме роговицы на фоне отека продолжали отмечаться признаки воспалительной реакции в виде миграции со стороны расширенных сосудов лимба в область ожога большого количества нейтрофильных клеток, лимфоцитов и фибробластов (рис.2).
Через месяц в зоне репарации преобладали крупные фибробласты с расширенными каналами гранулярного эндоплазматического ретикулума в цитоплазме, свидетельствующими об интенсивном синтезе ими коллагена (рис. 3). Рядом с фибробластами выявлялись новообразованные коллагеновые фибриллы, беспорядочно и разнонаправленно располагающиеся, что характерно для формирующейся грубой рубцовой ткани.
На 90 сутки опыта на месте ожога роговицы под передним эпителием выявлялись участки грубой рубцовой ткани. Низкая пролиферативная активность эпителиальных клеток роговицы со стороны здоровых тканей в ранние сроки, в силу этого затянутая по срокам эпителизация передней поверхности приводила к формированию неравномерного по толщине эпителиального слоя. Через 180 суток конечным результатом воспалительных процессов в строме и поздней эпителизации поверхности роговицы в зоне химического ожога являлось формирование под эпителием грубой рубцовой ткани. Рубцевание обожженных участков роговицы приводило к ее помутнению. Характерное для нормы параллельное расположение роговичных пластинок не определялось. В зоне репарации выявлялась плотная грубая неоформленная соединительная ткань (рис. 4). На ультраструктурном уровне она состояла из разнонаправленных плотно и беспорядочно упакованных коллагеновых волокон и фибрилл, что является типичным для структуры рубца.
Известно, что бурная воспалительная реакция при тяжелых повреждениях роговицы приводит
Рисунок 1.
Некроз поверхностных слоев (|) роговицы кролика на 7 сутки после ожога 2,5% раствором гидроксида натрия (контрольная группа). СР -строма роговицы. Окраска по Маллори. Увел. Х100 (Цветная иллюстрация на стр. 204)
Рисунок 2.
Клеточные инфильтраты (|) в роговице кролика на 21 сутки после ожога 2,5% раствором гидроксида натрия (контрольная группа). Окраска гематоксилином и эозином. Увел. Х200 (Цветная иллюстрация на стр. 204)
ITREMP0RARY ISSUES Of OPHTHALMOLOGE
Рисунок 3.
Активные фибробласты (Ф) и новообразованные коллагеновые фибриллы (КФ) на 30 сутки после ожога роговицы 2,5% раствором гидрок-сида натрия (контрольная группа). Электронная микрофотография. Увел.Х3000.
Рисунок 4.
Грубая рубцовая ткань под эпителием (Э) в зоне ожога роговицы у кролика на 180 сутки после воздействия 2,5% раствором гидроксида натрия (контрольная группа). Окраска по Ван-Гизону. Увел.200.
Рисунок 5.
Выход СД68+ фагоцитарных макрофагов из кровеносных сосудов лимба (СЛ) на 7 сутки после перилимбального введения биоматериала у кролика с ожогом роговицы 2,5% раствором гидроксида натрия (опытная группа). Иммуногистохимическая реакция. Докраска
гематоксилином. Увел.Х400.
п. ь - -
Ч * ^ * *
Рисунок 6.
Стволовые мезенхимальные клетки, экспрес-сирующие белок Thy-1 ( вокруг сосудов лимба и пролиферирующие PCNA+ клетки эпителия (Э) с темными ядрами, на 7 сутки после перилимбального введения биоматериала у кролика с ожогом роговицы 2,5% раствором гидроксида натрия. Двойная иммуногистохимическая реакция. Докраска гематоксилином. Увел.Х400.
* Ч
^ у *
к миграции в эту зону многочисленных «зрелых» соединительнотканных клеток из склеры, эпискле-ры, других источников и к формированию плотного, грубого рубца [6]. Кроме того, большое значение для восстановления структуры стромы роговицы имеет ранняя эпителизация пораженной зоны, то есть фибропластическая трансформация в строме не может достигнуть максимума до тех пор, пока эпителий не покроет рану [7]. В контрольной группе кроликов после щелочного ожога роговицы ранней эпителизации стромы мы также не наблюдали.
В опытной группе кроликов воспалительный процесс в зоне ожога после перилимбального введения диспергированного аллогенного биоматериала нивелировался и по степени проявления был менее выраженным. Темпы эпителизации раны и
восстановления стромальной пластинки роговицы под эпителием в сравнении с контрольной группой ускорялись. На 4-7 сутки выявлялись признаки лизиса и резорбции введенных частиц биоматериала многочисленными макрофагами, выходящими в ткани из расширенных сосудов в зоне лимба (рис. 5). Иммуногистохимически макрофаги метились как фагоцитарные СД68+клетки (цитоплазма окрашивалась в желто-коричневый цвет). При использовании поликлональных антител на выявление в клетках белка Т1пу-1 (маркера стволовых мезенхимальных клеток костномозгового
происхождения, являющихся предшественниками фибробластов) белок экспрессировался в виде розового окрашивания в цитоплазме и клеточной мембране крупных фибробластоподобных кле-
нн
Рисунок 7.
Наползающий на строму роговицы однослойный и двуслойный эпителий (Э) и миграция макрофагов и юных фибробластов (|) в строме на 7 сутки после перилимбального введения биоматериала у кролика с ожогом роговицы 2,5% раствором гидроксида натрия (опытная группа). Окраска гематоксилином и эозином. Увел.Х400.
Рисунок 8.
Активный фибробласт (Ф) и упорядоченно расположенные новообразованные колла-геновые фибриллы (КФ) на 7 сутки после перилимбального введения биоматериала у кролика с ожогом роговицы 2,5% раствором гидроксида натрия (опытная группа). Электронная микрофотография. Увел.Х3000.
Рисунок 9.
Тонкие новообразованные фибриллы ( ) между старыми коллагеновыми волокнами на 14 сутки после перилимбального введения аллогенного биоматериала у кролика с ожогом роговицы 2,5% раствором гидроксида натрия (опытная группа). Электронная микрофотография. Увел.Х 15000.
Рисунок 10.
Небольшие скопления клеток под восстановленным эпителием (Э) в зоне регенерации роговицы на месте ожога 2,5% раствором гидроксида натрия через 30 суток после перилимбального введения биоматериала (опытная группа). Окраска гематоксилином и эозином. Увел.Х200.
ток, которые выявлялись вокруг лимбальных сосудов. Одновременно мы проводили реакцию на выявление РСЫА+ клеток. Интенсивное коричневое окрашивание ядер, свидетельствующее о пролиферации клеток, определялось в базаль-ных клетках эпителия, покрывающего лимбальную область, в клетках врастающего на рану эпителия и в ядрах фибробластоподобных клеток, экспрессирующих одновременно и белок Т1пу-1 (рис. 6).
Уже на 7 сутки по периферии поврежденной зоны роговицы выявлялся наползающий на рану однорядный или двурядный уплощенный эпителий, клетки которого активно пролиферировали со сто-
роны лимба (рис. 7). В поверхностных слоях стромы роговицы под регенерирующим эпителиальным слоем в центр раневой зоны мигрировали крупные макрофаги, юные фибробластические клетки с крупными ядрами и светлой цитоплазмой веретеновидной формы. В цитоплазме фибробластов выявлялись многочисленные канальца гранулярного эндоплазматического ретикулума, свидетельствующие об активном синтезе ими коллагена (рис. 8). При этом рядом с ними выявлялись признаки относительно упорядоченной укладки новообразованных коллагеновых фибрилл между клетками, что характерно для роговицы в норме. Умеренная сте-
ITREMPORARY ISSUES Of OPHTHALMOLOGE
m
Рисунок 11.
Строение роговицы в зоне ожога 2,5% раствором гидроксида натрия на 90 сутки после пе-рилимбального введения аллогенного биоматериала у кролика опытной группы. Окраска по Ван-Гизону. Увел.Х100.
Рисунок 12.
Ультраструктура стромы роговицы в зоне ожога 2,5% раствором гидроксида натрия на 180 сутки после перилимбального введения аллогенного биоматериала у кролика опытной группы. Электронная микрофотография. Увел. Х10000.
пень пролиферации фибробластов способствовала восстановлению структуры стромы роговицы. Отек волокнистых пучков в строме уменьшался, и резко уменьшалась за счет этого толщина роговицы. На 14 сутки в строме роговицы продолжали проявляться признаки активной внутриклеточной деятельности фибробластических клеток. Местами даже между «старых» коллагеновых волокон выявлялись очень тонкие новообразованные коллагеновые фибриллы, имеющие параллельную ориентацию, что также способствовало восстановлению структуры стромальной пластинки роговицы (рис.9).
На 30 сутки роговица кроликов опытной группы выглядела почти интактной, лишь отличаясь в отдельных участках неравномерной толщиной эпителия. Местами под слоем переднего эпителия продолжали выявляться небольшие участки с признаками продолжающихся репаративных процессов в виде небольших скоплений фибробластических клеток и единичных макрофагов (рис.10). Роговичные пластинки состояли из плотно прилежащих друг к другу ровных соединительнотканных пучков, лежащих параллельными рядами. Между ними лежали удлиненные фибробласты с веретеновидными ядрами с признаками повышенной функциональной активности.
На 90 сутки опыта на гистологических препаратах роговицы кроликов представляло сложность определить место ожога (рис. 11). На поверхности роговицы определялся ровный по толщине многослойный неороговевающий эпителий, состоящий из 5-6 слоев клеток. Строма роговицы была образована многочисленными слоями коллагеновых пучков, образующих роговичные пластины. Через 180 суток роговица опытных кроликов имела нормальную структуру. Многослойный неороговевающий эпителий, покрывающий стро-му роговицы, состоял из нескольких слоев клеток. Под наружными уплощенными клетками выявлялись ниже лежащие более крупные эпителиальные клетки полигональной формы. Кубической формы базальные клетки эпителиального слоя лежали на не четко выраженной передней пограничной мембране (Боуменовой мембране). Строма
роговицы состояла из параллельных роговичных пластинок, состоящих из плотно уложенных пучков коллагеновых волокон (рис. 12). Между ними лежали уплощенные стромальные клетки — кератоциты. Хорошо визуализировалась толстая однородная задняя пограничная мембрана, покрытая одним слоем плоских эноотелиальных клеток. Клеточных скоплений воспалительного типа в роговице не обнаружено.
Результаты иммуногистохимических исследований на выявление фактора фиброза -трансформирующего фактора роста ТGF-b 1 показали, что интенсивная экспрессия цитокина клетками почти во все сроки эксперимента определяется в контрольной группе, где репаративная регенерация роговицы после выраженной воспалительной реакции идет с формированием грубого рубца. После перилимбального введения аллогенного биоматериала у кроликов опытной группы цитокин ТGF-b 1 экспрессировался значительно меньшим количеством клеток. Известно, что ТGF-b 1 — один из основных цитокинов, стимулирующий пролиферацию фибробластических клеток и интенсивный синтез ими коллагена. Данный белок в основном экспрессируют макрофаги. Вместе с тем могут его выделять эндотелиальные клетки, перициты сосудов, а также отдельные фибробластические клетки.
Таким образом, перилимбальное введение диспергированного аллогенного биоматериала способствует быстрой эпителизации патологически измененной роговицы, снижению воспалительных процессов в строме и регенерации роговичных пластинок без грубого рубцевания тканей. Полученные нами результаты и данные ранее проведенных многочисленных исследований по изучению механизма действия аллогенных биоматериалов позволяют нам полагать, что перилимбально введенный биоматериал опосредованно через макрофаги при помощи клеточных ростовых факторов не только активирует стволовые клетки зоны лимба (палисад Вогта), участвующие в восстановлении эпителиального покрова [8, 9, 10], но и привлекает из кровотока через лимбальные сосуды стволовые
пп
мезенхимальные клетки костномозгового происхождения, которые дифференцируются в фибробласты, синтезирующие коллаген для восстановления стромы роговицы. Макрофаги, в зависимости от их зрелости и функциональной активности, секретирующие разный уровень про-и противовоспалительных цитокинов, регулируют направление дифференциации стволовых мезенхимальных клеток, а от нее, в свою очередь, зависит исход регенерации соединительной ткани [11, 12]. Использование аллогенного биоматериала для регенерации роговицы позволяет снизить уровень экспрессии клетками ТGF-b 1, известного как фактор фиброза, тем самым способствуя эффективному предупреждению рубцово-фиброзных изменений тканей в зоне репарации роговицы.
Заключение
Перилимбальное введение аллогенного биоматериала стимулирует регенеративные процессы в патологически измененной роговице. За счет низкой степени экспрессии клетками цитоки-на трансформирующий фактор роста TGF-b 1(фак-тора фиброза) происходит ингибирование процесса грубого рубцевания тканей, что способствует полноценному восстановлению структурных элементов роговицы. Полученные экспериментальные данные можно экстраполировать на пациентов с кератоко-нусом, так как наряду с истончением роговицы одним из основных проявлений заболевания является вторичное рубцевание пораженной зоны.
ЛИТЕРАТУРА
1. Галимова В.У., Шакиров Р.Ф. Опыт лечения кератоконуса с использованием трансплантационной технологии Аллоплант // Катарактальная и рефракционная хирургия: научно-практический журнал. - 2012. - Том 12, №1. - С. 27-30.
2. Галимова В.У., Шакиров Р.Ф., Гареев Е.М. Результаты лечения больных кератоконусом диспергированным в различной степени биоматериалом «аллоплант» // Офтальмологические ведомости. - 2013. Т. VII, №1. - C. 26-28
3. Севостьянов Е.Н., Горскова Е.Н., Экгардт В.Ф. Кератоконус (этиология, патогенез, медикаментозное лечение): Учебное пособие. - Челябинск: УГМАДО, 2005. - 32 с.
4. БотосН S., Hahnel C., Stowic C. et al. ^n^ca! in v^ microscopy and ^nfocal laser-scanning florescence microscopy in kerato^nus. // Ger. J. ор!^!^^!. - 1996. -tol.5. - №6 - Р. 518-525
5. Obenberger J. Paper st^s and rings as simple ^Is for standartizat^n of experimental eye injuries // ОрР^^ок Res. -1975. - vdi. 7. - P. 363-366.
6. Багров С.Н. Источники регенерации роговой оболочки глаза // Офтальмол. журн.-1980. - №1. - С. 231-233
7. Гундорова Р.А., Хорошилова-Маслова И.П., Ченцова Е.В., Илатовская Л.В., Ямскова В.П., Романова И.Ю. Применение адге-лона в лечении проникающих ранений роговицы в эксперименте // Вест. офтальмол. - 1997. - Т.113, № 2. - С.12-16.
8. Попандопуло А.Г., Кавелина А.С., Иванова О.Н., Дрожжина Г.И. Роль лимбальных клеток в регенерации роговицы // Таврический медико-биологический вестник. -2013. - Т. 16, №1. -Ч.2. - С. 158-160.
9. Dua H.S., Azuara-Blan^ A. Limbal stem cells of the ^rneal epithelium // Surv. Ор!^!^^!. - 2000 - № 44 (5) - P. 415-425.
10. Дубовиков А.С., Безушко А.В., Куликов А.Н., Чурашов С.В., Черныш В.Ф., Блинова М.И., Александрова О.И., Суетов А.А., Гав-рилюк И.О. О применении культвированных на амниотической мембране стволовых клеток роговичного эпителия для устранения лимбальной недостаточности в эксперименте // Практическая медицина. - 1917. - Т.2, №9 (110). - С.67-71.
11. Muldashev E.R., Muslime S.A., Musina L.A., Nigmatullin R.T., Lebedeva A.I., Shangina O.R., Khasanov R.A.. The role of macrophages in the tissues regenerate stimulated by the b^im^teria^ // Cell Tissue Bank. - 2005. - tol.6, №2. - P. 99-107.
12. Лебедева А.И., Муслимов С.А., Мусина Л.А. Экспериментальное моделирование процесса хронического воспаления и фиброза // Биомедицина. - 2013. - № 4. - С. 114-123.
