CC BY
29
Оригинальные статьи
экспериментальная оценка токсических свойств таргетного препарата аимпила
Э.р. Переверзева1, в.А. Голибродо1, м.и. трещалин1, н.в. Еремкин1, С.А. Цуркан2, и.д. трещалин1
1ФГБНУ«Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе»; Россия, 119021 Москва, ул. Большая Пироговская, 11, стр. 1; 2ООО «Фармацевтический научный центр "ФармАксесс"»; Россия, 127322 Москва, ул. Милашенкова, 10, оф. 195
Контакты: Василиса Антоновна Голибродо [email protected]
Введение. В настоящее время активно проводится поиск лекарственных средств, направленно воздействующих на специфические молекулярные или клеточные мишени опухолей. Таргетный противоопухолевый препарат аимпила представляет собой нековалентный комплекс альфа-фетопротеина (АФП) с атрактилозидом. Основой для его разработки послужила способность АФП как транспортного белка доставлять цитотоксические агенты в клетки, имеющие рецепторы
Цель исследования — изучение токсичности препарата аимпила в хроническом эксперименте на кроликах. Материалы и методы. В исследовании использовано 60 кроликов породы «Советская шиншилла», самцов и самок. Препарат в виде готовой лекарственной формы — желатиновых капсул — вводили перорально в 1 и 10 терапевтических дозах (0,05 и 0,5мг/кг соответственно) ежедневно в течение 30 сут. В ходе исследования у животных определяли массу тела, проводили клинический и биохимический анализы крови, анализ мочи, снимали электрокардиограмму. На 1-е и 30-е сутки по окончании курса введений по 5 животных из каждой группы подвергали эвтаназии и затем проводили патоморфологическое исследование их внутренних органов.
Результаты. Исследование показало, что ежедневное пероральное применение аимпилы в течение 30 сут в дозе, эквивалентной 1 терапевтической, не оказывает влияния на клинико-лабораторные показатели и структуру органов и тканей кроликов. У животных, получавших высокую дозу препарата, были обнаружены признаки гепато-, нефро-, кардио- и гастроинтести-нальной токсичности. Повреждения структуры печени, найденные при микроскопическом анализе, клинически выражались в виде достоверного увеличения уровня аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови. Морфологические изменения почек сопровождались значимым повышением уровней уробилиногена и кетоновых тел в моче. Признаки кардио- и гастроинтести-нальной токсичности выявлялись только при патоморфологическом исследовании органов. Обнаруженные изменения были обратимы в течение 30 сут.
Выводы. Выявленные токсические свойства лекарственной формы аимпилы дозозависимы и обратимы. Препарат рекомендуется для дальнейшего изучения.
Ключевые слова: аимпила, альфа-фетопротеин, атрактилозид, хроническая токсичность, кролики
DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-4-61-66
experimental evaluation of toxic properties of target antitumor drug aimpila
E.R. Pereverzeva1, V.A. Golibrodo1, M.I. Treshchalin1, N. V Eremkin1, S.A. Tsurkan2, I.D. Treshchalin'
1Gause Institute of New Antibiotics; 11 Bldg. 1 Bol'shaya Pirogovskaya St., Moscow 119021, Russia; Pharmaceutical Scientific Center "PharmAccess" Ltd.; of. 195, 10 Milashenkova St., 127322 Moscow, Russia
Background. Currently, the drugs, acting directly on tumor molecular or cellular targets, are actively designed. Target antitumor drug aimpila is atractyloside alpha-fetoprotein noncovalent complex. The development of this formulation is based on the ability of alpha-fe-toprotein, as a transport protein, to deliver cytotoxic agents into the cells that have alpha-fetoprotein receptors. Objective: to investigate the toxicity of aimpila in chronic experiment on rabbits.
Materials and methods. The study was performed in male and female "Soviet chinchilla" rabbits. Final drug formulation (aimpila in gelatin capsules) was administrated per os at 1 and 10 therapeutic doses (0.05 and 0.5 mg/kg respectively) for 30 days with interval of 24 h. During the study dynamics of body weight, hematological parameters, blood biochemical parameters, electrocardiography and urinalysis were performed for all animals. Five animals in each group were sacrificed in days 1 and 30 post treatment, then their internal organs were subjected to histological evaluation.
Results. The study demonstrates that the treatment with aimpila for 30 days in single therapeutic dose of 0.05 mg/kg had no effect on the clinical and laboratory parameters or the morphological structure of the internal organs of rabbits. Signs of hepato-, nephro-, cardio-and gastrointestinal toxicity were found in group of rabbits, treated with high dose of drug. The structural damages in liver were clinically supported with a significant increase of aspartate aminotransferase level in serum. Pathological changes in the kidneys were accom-
к АФП.
62 Оригинальные статьи
panied by a significant increase of urobilinogen and ketone bodies levels in the urine. Signs of cardio- and gastrointestinal toxicity were documented only by microscopic pathology observation. These abnormalities were reversible within 30 days. Conclusions. Aimpila formulation displayed dose-dependent and reversible toxicity and can be recommended to further investigation. Key words: aimpila, alpha-fetoprotein, atractyloside, chronic toxicity, rabbits Введение кролика количеством капсульной массы. Состав Используемые в настоящее время противоопухо- капсульной массы был следующим: 0,001 г субстан-левые препараты обладают низкой избирательностью ции аимпилы; 0,02 г лактозы; 0,112 г микрокристал-действия, что приводит к развитию серьезных побоч- лической целлюлозы 102; 0,007 г кремния диоксида ных эффектов. Повышение избирательности дей- коллоидного. Разовые дозы, эквивалентные 1 и 10 ствия лекарственных средств может быть достигнуто терапевтическим дозам (ТД), составляли 0,05 введением в их состав векторных молекул, способ- и 0,5 мг/кг соответственно. Величина ТД для кроли-ных связываться со специфическими рецепторами, ков была получена при пересчете с эффективной ТД расположенными на поверхности клеток-мише- для мышей с использованием ^-фактора [8]. ней [1]. Векторами могут служить различные биомо- Клинико-лабораторные и патоморфологичес-лекулы, в частности онкофетальные белки. Так, для кие исследования проводили в соответствии с «Ру-этой цели активно используется альфа-фетопротеин ководством по проведению доклинических иссле-(АФП), рецепторы к которому были найдены в клет- дований лекарственных средств» [9]. Перед началом ках опухолей определенного гистогенеза. К тому же введения определяли фоновые показатели (массу АФП способен выполнять функцию транспортного тела животного, клиническую картину крови). белка и обладает свойством формировать конъюгаты На протяжении всего эксперимента наблюдали и комплексы с различными, в том числе противо- за состоянием и поведением животных, регистри-опухолевыми, агентами [2, 3]. ровали изменения массы тела, производили иссле-Препарат аимпила, разработанный в ООО «Фар- дование состава периферической крови, устанавли-мацевтический научный центр "ФармАксесс"», вая количество лейкоцитов, эритроцитов, представляет собой нековалентный комплекс АФП тромбоцитов, гемоглобина, лейкоцитарную форму-с атрактилозидом (АТР). АТР — гликозид природно- лу, величину гематокрита при помощи автоматичес-го происхождения, воздействующий на митохондри- кого гематологического анализатора Abacus Junior альную функцию клеток и вызывающий в дальней- Vet (Diatron, Австрия). Используя автоматический шем их апоптоз [4—6]. Аимпила проявила высокую биохимический анализатор ChemWell (Awareness противоопухолевую активность в эксперименталь- Technology Inc., США), на 1-е и 30-е сутки по оконных исследованиях. Для дальнейшего продвижения чании курса введений препарата в сыворотке крови препарата необходима оценка его побочного дей- животных определяли уровни аланинаминотранс-ствия при длительном пероральном введении. Опти- феразы, аспартатаминотрансферазы (АСТ), щелоч-мальной моделью, позволяющей провести изучение ной фосфатазы, креатинина, мочевины, билируби-токсических свойств лекарственной формы аимпи- на (прямого и общего), общего белка, альбумина, лы, рекомендуемой для клинического применения, глюкозы. В эти же сроки с использованием автома-являются кролики. тического анализатора мочи Laura Smart (Erba Lachema, Чехия) производили клинический анализ Материалы и методы мочи (рН, лейкоциты, эритроциты, кетоновые тела, Исследование выполнено в соответствии с эти- белок, уробилиноген, удельный вес, глюкоза, ни-ческими нормами обращения с животными, приня- траты) и регистрировали электрокардиограмму тыми Европейской конвенцией по защите позвоноч- во II стандартном отведении при помощи ных животных, используемых для исследовательских электрокардиографа ЭК1Т-07 («Аксион», Россия). и иных научных целей [7]. Половину животных из каждой группы подвер-В эксперименте использовали 60 кроликов поро- гали эвтаназии на 1-е сутки после окончания курса, ды «Советская шиншилла», самцов и самок с массой остальных — спустя 30 сут после окончания курса тела 1,8—2,0 кг, полученных из питомника «Белый введений препарата. На вскрытии проводили иссле-мох». После карантина в течение 2 нед были сформи- дование состояния органов грудной и брюшной по-рованы 6 групп (по 3 группы самцов и самок) лости. Сердце, печень, почки, селезенку и тимус по 10 животных. Кроликам экспериментальных групп взвешивали при помощи весов СЕ153-С («Сартогосм», перорально вводили желатиновые капсулы с индиви- Россия) и определяли их массовые коэффициенты. дуально рассчитанным на массу тела каждого Участки органов фиксировали в 10 % нейтральном
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ I RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 4'2017 том 16 I vol. 16
Оригинальные статьи
63
формалине, по стандартной методике заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином.
Полученные количественные данные подвергали статистической обработке при помощи компьютерных программ StatPlus 2006 и Microsoft Excel с использованием ^-критерия Фишера—Стьюдента. Различия считали достоверными приp <0,05.
Результаты
Ежедневное 30-кратное введение аимпилы в изученных дозах не вызывало гибели животных, не оказывало влияния на прирост массы тела и поведенческие реакции.
На протяжении всего эксперимента клинические показатели периферической крови колебались в пределах физиологической нормы и не отличались от показателей контрольной группы.
70
■Ц 60
m
О Ü О
и <
о >
50
40
30
1 30
Сутки после курса введений
■ Контроль ■ Аимпила 0,05 мг/кг
■ Аимпила 0,5 мг/кг
рис. 1. Активность АСТ в сыворотке крови самцов кроликов на 1-е и 30-е сутки после курса введений аимпилы
При биохимическом исследовании сыворотки крови на 1-е сутки после окончания курса введений аимпилы в разовой дозе, 10-кратно превышающей ТД, как у самцов, так и у самок было зарегистрировано достоверное увеличение активности АСТ по сравнению с контрольной группой (рис. 1). На этом же сроке наблюдения при пато-морфологическом исследовании были обнаружены изменения в ткани печени в виде микронекрозов вблизи портальных трактов и центральных вен, зернистой или вакуольной дистрофии гепато-цитов вокруг отдельных триад (рис. 2). К концу эксперимента уровень АСТ возвращался к нормальным значениям, структура печени восстанавливалась.
При исследовании состава мочи на 1-е и 30-е сутки после курса введений у кроликов, получавших препарат в обеих изученных дозах, было обнаружено достоверное по сравнению с контролем повышение уровня кетоновых тел, а у животных, получавших препарат в большей дозе (0,5 мг/кг), — повышение уровня уробилиногена. Десятикратное превышение ТД приводило к возникновению дистрофических изменений эпителия извитых канальцев корковой и юкстамедуллярной зон почек, интерстициального и периваскулярного отека в юкстамедуллярной зоне (рис. 3), появлению клеточного детрита в просвете прямых канальцев мозговой зоны.
К 30-м суткам после курса введений препарата у большинства животных структура почек восстанавливалась. У отдельных животных на месте поврежденных канальцев формировались кисты.
Анализ электрокардиограммы кроликов, получавших препарат в обеих изученных дозах, не выявил его кардиотоксических свойств. При патомор-фологическом исследовании было отмечено повреждающее действие препарата на структуру сердечной мышцы только у отдельных животных,
рис. 2. Печень (х 20): а — интактный контроль; б — аимпила 0,5 мг/кг х 30 сут, 1-е сутки после курса введений: очаг микронекроза вблизи триады
64 Оригинальные статьи
Рис. 4. Миокард (х 20): а — интактный контроль; б — аимпила 0,5мг/кг х 30 сут, 1-е сутки после курса введений: мелкие очаги токсической кардиомиопатии
получавших аимпилу в разовой дозе, 10-кратно превышающей ТД. Оно выражалось в появлении множественных мелких очагов токсической кардио-миопатии (рис. 4) и единичных крупных очагов отека интерстиция. К 30-м суткам после курса введений аимпилы происходило полное восстановление структуры миокарда.
Местно-тканевые реакции слизистой оболочки желудка на пероральное введение препарата в ТД были выражены слабо. При 10-кратном превышении ТД они выражались в изменении соотношения главных и обкладочных клеток в железах и умеренной очаговой атрофии эпителия желез и покровно-ямочного эпителия (рис. 5), которые проявлялись сразу после курса введений аимпилы. К 30-м суткам по окончании курса структура слизистой оболочки желудка полностью восстанавливалась.
Обсуждение
Одним из подходов к улучшению терапевтических свойств противоопухолевых препаратов является формирование таргетных конструкций с АФП, который специфически взаимодействует с АФП-рецеп-торами опухолевых клеток. Разработка векторных композиций такого рода может быть основана на создании конъюгатов, в которых АФП ковалентно связан с антибластомным агентом или же образует с ним нековалентный комплекс [2]. Так, были получены конъюгаты АФП с доксорубицином, блеоми-цетином, карминомицином, дауномицином, эспера-мицином, исследования которых подтвердили наличие выраженной противоопухолевой активности наряду со снижением токсичности по сравнению со свободным препаратом [2, 10, 11]. Нековалентные АФП-комплексы обладают рядом преимуществ, среди которых наиболее важным является доставка
Оригинальные статьи 65
высокотоксичных агентов непосредственно в опухолевую клетку [2].
Препарат аимпила представляет собой некова-лентный комплекс АФП с АТР — токсином, используемым в народной медицине стран Южной Африки. Токсические свойства АТР известны: у людей при отравлении им возникают массивные некрозы в печени и почках [4, 6, 12]. Поскольку АФП даже при длительном применении в высоких дозах не оказывает повреждающего действия на структуру и функцию органов и тканей экспериментальных животных [13], обнаруженные в настоящем исследовании гепато-и нефротоксические эффекты, по-видимому, связаны с влиянием АТР. Одним из механизмов действия АТР является ингибирование окислительного фос-форилирования в митохондриях [4, 6, 12, 14], что обусловливает выраженное влияние этого соединения на клетки, богатые митохондриями, в частности ге-патоциты и клетки проксимальных канальцев почек.
Гепато- и нефротоксические свойства АТР при парентеральном введении были изучены в экспериментах на лабораторных животных [4, 15—17]. Клинические и патоморфологические данные о его повреждающем действии на структуру и функцию печени, описанные в ряде работ [4, 16], совпадают с результатами настоящего исследования, что подтверждает предположение о том, что токсические свойства аимпилы определяются токсичностью АТР.
При изучении нефротоксичности АТР было показано, что даже однократное внутрибрюшинное введение этого соединения крысам и мышам
в переносимых дозах приводит к повреждению проксимальных канальцев. Влияние на ткань почек морских свинок и кроликов было обнаружено при введении летальных доз АТР [4, 15]. В настоящем исследовании, проведенном на кроликах, аимпила при длительном применении в высокой дозе, 10-кратно превышающей ТД, также проявила нефротоксические свойства, близкие по морфологическим и клиническим проявлениям к тем, которые были описаны для АТР.
Морфологическое проявление кардиотоксично-сти аимпилы, вероятно, объясняется изменением биодоступности АТР к клеткам миокарда, так как, по данным литературы, АТР не оказывает влияния на структуру и функцию сердца [6, 15, 18].
Таким образом, проведенное токсикологическое изучение лекарственной формы препарата аимпила позволяет сделать вывод о ее безвредности при применении в ТД.
Выводы
Курсовое применение пероральной лекарственной формы аимпилы в ТД не оказывает влияния на структуру и функции основных органов и систем кроликов. При значительных передозировках возможно проявление гепато-, нефро- и кардиотоксичес-ких свойств препарата. Выявленная зависимость повреждающего действия аимпилы от величины примененной дозы и обратимость токсических эффектов позволяют рекомендовать изученную лекарственную форму аимпилы для дальнейшего изучения.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Северин С.Е., Москалева Е.Ю., По-сыпанова Г.А. Таргетная терапия рака. Природа 2013;12:71-7.
2. Pak V. The use of a-fetoprotein for the delivery of cytotoxic payloads to cancer cells. Ther Deliv 2014;5(8):885-92.
DOI: 10.4155/tde.14.59. PMID: 25337646. 3. Posypanova G.A., Gorokhovets N.V., Makarov V.A. et al. Recombinant alpha-
66
Оригинальные статьи
fetoprotein C-terminal fragment: the new recombinant vector for targeted delivery. J Drug Target 2008;16(4): 321-8. PMID: 18446611.
4. Daniele C., Dahamna S., Firuzi O. et. al. Atractylis gummifera L. poisoning:
an ethnopharmacological review. J Ethnopharmacol 2005;97:175-81. DOI: 10.1016/j.jep.2004.11.025. PMID: 15707749.
5. Obatomi D.K., Bach P.H. Selective cytotoxicity associated with in vitro exposure of fresh rat renal fragments and continuous cell lines to atractyloside. Arch Toxicol 1996;71(1-2):93-8. PMID: 9010590.
6. Stewart M.J., Steenkamp V. The biochemistry and toxicity of atractyloside: a review. Ther Drug Monit 2000;22(6): 641-9. PMID: 11128230.
7. Council of Europe. European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. ETS 1986:123.
8. Freireich E.J., Gehan E.A., Rall D.P.
et al. Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, hamster, dog, monkey and man. Cancer
Chemother Rep 1966;50(4):219-44. PMID: 4957125.
9. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. А.Н. Миронова. Часть I. М.: Гриф и Ко, 2012. С. 13-24.
10. Feldman N.B., Kiselev S.M., Gukaso-va N.V. et al. Antitumor activity of alpha-fe-toprotein conjugate with doxorubicin
in vitro and in vivo. Biochemistry 2000;65(8):967-71. PMID: 11002192.
11. Nikolskaya E.D., Zhunina O.A., Yab-barov N.G. et al. Development of target delivery system based on actinomycin class drugs and recombinant alpha-feto-protein. Dokl Biochem Biophys 2017;473(1):148-50. DOI: 10.1134/ S1607672917020156. PMID: 28510139.
12. Barceloux D.G. Medical toxicology of natural substances. Foods, fungi, medicinal herbs, plants and venomous animal. California: John Wiley & Sons, 2008. Pp. 514-517.
13. Черешнев В.А., Родионов С.Ю., Черкасов В.А. и др. Альфа-фетопротеин. Екатеринбург: УрО РАН, 2004.
С. 104-129.
14. Obatomi D.K., Thanh N.T., Brant S., Bach P.H. The toxic mechanism and metabolic effects of atractyloside
in precision-cut pig kidney and liver slices. Arch Toxicol 1998;72(8):524-30. PMID: 9765068.
15. Carpenedo F., Luciani F., Scaravilli F. et al. Nephrotoxic effect of atractyloside in rats. Arch Toxicol 1974;32(3):169-80. PMID: 4479740.
16. Hedili A., Warnet J., Thevenin M., Martin C. et.al. Biochemical investigation of Atractylis gummifera L. hepatotoxicyty in the rat. Arch Toxicol Suppl 1989;13:312-5. PMID: 2774952.
17. Koechel D.A., Krejci M.E. Extrarenal and direct renal actions of atractyloside contribute to its acute nephrotoxicity in pentobarbital-anesthetized dogs. Toxicology 1993;79(1):45-66. PMID: 8475499.
18. Gilmour R.F.Jr., Williams E.S., Farmer B.B., Zipes D.P. Effects
of carnitine and atractyloside on canine cardiac electrical activity. Am J Physiol 1981;241(4):505-12. PMID: 7315975.
