CC BY
65
М.К. Нурбеков, О.А. Сперанская, М.И. Сусова,
Н.О. Минькова, Д.В. Ярыгин, М.М. Расулов
Экология человека в аспекте новых данных о механизмах обеспечения тканевого и клеточного гомеостаза и контроля развития распространенных патологий
Авторами статьи рассмотрено современное состояние исследований механизмов развития атеросклероза и путей терапии этой патологии, в том числе, на основе собственных исследований.
технологии
Актуальные вопросы антропоэкологических исследований
Ключевые слова: здоровье населения, гомеостаз, сердечно-сосудистые заболевания, механизмы развития атеросклероза, терапия атеросклероза.
В современных социально-экологических условиях число больных с кардиоваскулярной патологией неуклонно возрастает. При этом следует констатировать, что до последнего времени способов достаточно эффективной борьбы с различными заболеваниями этой группы не существовало. Необходимо подчеркнуть тесную связь этой группы заболеваний с образом жизни, питания, состоянием окружающей среды в широком смысле этого понятия. Пристальное внимание исследователей в последнее время привлекают молекулярно-генетические механизмы развития заболеваний и комплекс защитных реакций организма на различных уровнях.
Вместе с тем, в последние годы проясняются механизмы контроля атерогенеза, связанных с цитокинной активностью ряда белковых факторов. Выявлена ключевая роль ферментов класса аминоацил-тРНК-син-тетаз (АРСаз) для обмена веществ. В частности, тирозил-тРНК-синтетаза (ТирРСаза), будучи расщепленной, обладает цитокинной активностью и стимулирует ангиогенез, способствуя, тем самым, атерогенезу [2]. Гомолог ТирРСазы - триптофанил-тРНК синтетаза (ТРСаза) - в клетках существует в двух формах: 1) основная полноразмерная форма; 2) частично усеченная форма (миниТРСаза), которая лишается Ж-концевого фрагмента в процессе альтернативного сплайсинга при созревании пре-мРНК. Образование обеих форм фермента может быть резко ускорено у всех млекопитающих при воздействии ряда белковых факторов, в частности, у-интерферона. При этом ТРСаза, особенно в виде миниТРСазы, в отличие от ТирРСазы, обладает выраженным антиангиогенным и антиатеро-генным действием [3]. Естественно, что актуальность исследования ферментов внерибосомного этапа белкового синтеза связана, прежде всего, с важной ролью, которую ферменты играют в реализации генетической информации, обеспечивая нужную точность прочтения кода ДНК.
Интенсивность развития данного направления исследований столь высока, что некоторые ученые характеризуют это явление как ренессанс науки о структуре, функциях и роли в клетке и организме ферментов внерибосомного этапа белкового синтеза, что естественным образом накладывает определенные ограничения на «рамки» исследований для любого человека, решившего работать в этом актуальном направлении. Поэтому представляется целесообразным ограничиться исследованиями небольшой группы АРСаз (в частности, ТРСазы и ТирРСазы), в силу их наибольшей изученности, в том числе и с точки зрения дополнительных
функций. В этом плане заметим, что особенностью АРСаз является их ш чрезвычайная гетерогенность, несмотря на то, что они катализируют ески
однотипную реакцию - специфическое присоединение к той или иной гич
ог
транспортной РНК (тРНК) соответствующей гомологичной аминокисло- кол
ты. Другой особенностью является исходно большое их количество - как О минимум 20 (соответственно количеству аминокислот в клетке). При аль этом необходимо помнить, что некоторые аминокислоты кодируются и несколькими вариантами «трехбуквенного» кода ДНК, и для них существуют несколько видов тРНК, которые должны узнаваться соответствующей АРСазой. Еще одним своеобразием этих ферментов является их эволюционная древность, т. к. катализируемая ими реакция должна была появиться одновременно с зарождением протоклетки.
Последующие процессы отбора и эволюции в значительной степени затрагивали этот класс древних ферментов, возможно, наделяя их дополнительными функциями. Очевидная важность АРСаз для клетки, их несомненная ценность как объекта изучения эволюции белкового синтеза привлекали к себе пристальное внимание исследователей длительное время. Кроме того, каждый из представителей этого класса ферментов исследовался отдельными группами ученых. В нашей стране подробно изучались ТРСаза и фенилаланил-тРНК-синтетаза из высших организмов [1; 4].
Одним из основных факторов резко ускоривших исследования дополнительных функций АРСаз (как и других исследований по изучению роли в клетке различных белков, ферментов и их комплексов) была расшифровка генома человека и создание общедоступных банков данных нуклеотидных последовательностей. Это, в свою очередь, стимулировало работы по выделению нужных генов или/и их фрагментов для исследований их регуляции, а также работы по получению интересуемых белков и ферментов. Поэтому наш интерес к проблеме закономерен. АРСазы вообще, и ТРСаза - в частности, выполняя базовые для жизнедеятельности клетки функции, одновременно связаны с развитием целого спектра заболеваний человека.
Структурно-функциональный анализ ТРСазы с точки зрения ее неканонических функций привлекает пристальное внимание в аспекте мощной антиангиогенной функции ее модифицированных форм. Кроме того, ТРСаза - активный компонент каскада реакций природного иммунитета и комплекса факторов контроля ангиогенеза. Очевидно, что для достижения необходимого уровня компетенции в изучении структуры и функций ферментов данного класса необходимо рассмотреть как общие объединяющие их свойства, так и частные вопросы, отличающие их друг
технологии
110
Актуальные вопросы антропоэкологических исследований
от друга. Представленная информация отражает чрезвычайное разнообразие АРСаз и их функций, следовательно, задача экспериментального их изучения возможна лишь при концентрации на конкретных подгруппах ферментов или даже на одном ферменте этого класса. При этом, кроме уже упоминавшихся выше, можно отметить такие фундаментальные вопросы, как происхождение живых организмов, эволюция белков, механизм распознавания РНК, регуляция генов, механизмы созревания (сплайсинга) РНК, биосинтез аминокислот. Катализируемая АРСазами реакция специфического аминоацилирования является основой механизма обеспечения точности реализации генетического кода, и, следовательно, появление этого класса ферментов тесно связано с появлением генетического кода и его дальнейшей эволюции. Пристальное внимание к ферментам этой группы объясняется как сложной системой контроля их активностей, так и множественностью форм ферментов. Конкретизируя причину выбора данной пары АРСаз, можно указать, что они прямо или косвенно участвуют в большинстве указанных выше функций клетки и организма.
При рассмотрении проблемы мы старались обращать внимание на различные стороны исследований отмеченных синтетаз в историческом аспекте, иначе - как накопление данных о структуре и функциях АРСаз способствовало раскрытию все новых особенностей ферментов, разнообразию их форм, механизмы основных катализируемых реакций и дополнительных, так называемых неканонических функций, открываемых по мере накопления данных о ТРСазе и ТирРСазе. Для раскрытия молекулярных основ функционирования ТРСазы и ТирРСазы необходимо коснуться таких аспектов, как множественность форм фермента, выраженных в существовании нескольких различающихся по молекулярной массе ферментов с близкой активностью. Ранее полагалось, что они являются результатом частичного протеолиза эндогенными протеазами, однако впоследствии было показано, что это является следствием наличия различных путей созревания мРНК.
Важность этих данных и вызвала необходимость подробного рассмотрения явления в данном разделе. Нами подробно рассмотрены данные об особенностях функционирования фермента в связи с обнаружением в его составе существенного для активности иона цинка, что имеет большое значение для функционирования клетки и, возможно, целого органа - поджелудочной железы, продуцирующей в организме один из важнейших гормонов - инсулин. Имеются сведения о структуре гена ТРСазы и особенностях проявления активности гена этого фермента в связи с альтернативными путями созревания мРНК-продукта гена ТРСазы, при-
водящими к различным формам фермента, имеющим, по крайней мере, ш
одну дополнительную функцию по контролю процессов пролиферации S
опухолей [5]. |
Раскрываемая роль АРСаз в функционировании клетки, может пролить о
свет на молекулярные механизмы большого спектра распространенных о
болезней человека. Этим объясняется то пристальное внимание, которое |
уделяет мировое научное сообщество изучению АРСаз, особенно с точки ¡J
зрения выяснения их дополнительных «неканонических» функций. Все очевиднее становится перспектива раскрытия ранее неизвестных механизмов развития заболеваний и нарушения нормального течения обменных процессов живых организмов.
Далее хотелось бы подробнее коснуться механизмов атерогенеза и возможных путей терапевтического воздействия на этот процесс различными препаратами, включая оригинальный препарат из серии атранов - тре-крезан.
Стрессовые факторы стимулируют продукцию стероидных гормонов, следствием чего является вынос в кровь из жировой ткани неэсте-рифицированных жирных кислот, при контакте которых с кислородом в ходе окислительно-восстановительных реакций расщепления субстрата в митохондриях активируется их свободно-радикальное окисление. Гидроперекиси липидов разрушают мембраны клеток и становятся причиной тяжелейшего повреждения. При этом нарушается функционирование систем, регулирующих, например, мышечное сокращение.
В последние годы получены данные, послужившие базой для выделения основных принципов патогенетической терапии этого состояния: защита мембраны и коррекция энергетического обеспечения клетки, а также нормализация механизмов трансмембранного переноса и внутриклеточного распределения ионов и жидкости [6]. Это значит, что эффективность антиатеросклеротических препаратов определяется их способностью защищать сосудистую стенку. Следовательно, изучение клинической эффективности препаратов, способных влиять непосредственно на метаболические процессы, особенно актуально.
Современные представления о молекулярных механизмах атерогенеза. Метаболизм липопротеинов. Липопротеиды состоят из жирового ядра, включающего триглицериды, эфиры холестерина (холестерол в ядре связан с жирными кислотами), жирорастворимые витамины, мембранные фосфолипиды и небольшое количество свободного холестерина, и белковой части - апопротеина.
В плазме содержатся два основных типа липопротеинов - это липо-протеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины высокой плотности
технологии
112
Актуальные вопросы антропоэкологических исследований
(ЛПВП). Липопротеины в крови транспортируют липиды, включая холестерин, другие жирорастворимые питательные вещества, как витамины А, Б, Е и К, и кофермент Р10 , и их метаболизм тесно связан с инициацией и развитием атеросклероза.
Апопротеин взаимодействует со специфическими рецепторами на поверхности клеток, это и определяет маршруты липопротеинов в организме в ходе их перемещения по липопротеиновому циклу. В кишечнике холестерол, жиры и жирорастворимые компоненты пищи упаковываются в хиломикроны. Хиломикроны перемещаются по лимфатической системе до различных тканей, где подвергаются «перевариванию». Белковый компонент липопротеинов в ходе превращений связывается с аполипро-теином В с образованием форм апоВ-100 и апоВ-48. ЛПНП, не поглощенные клетками, подвергаются окислительным воздействиям свободно радикальными соединениями, которые последовательно затрагивают поверхностные белки, жирные кислоты и холестерол «ядерной» части. ЛПНП, будучи окисленными, могут вторгнуться в артериальные стенки в областях нарушенного кровотока, например, в точках изгибов и ветвления артерий. Эти области, особенно у людей, которые регулярно не занимаются физическими упражнениями, проницаемы для крупных молекул. Окисленные липиды ЛПНП привлекают лимфоциты и инициируют воспалительный каскад, который приводит к формированию артериальной бляшки.
Метаболизм ЛПНП. Как уже отмечалось, липопротеины, содержащие апоВ (ЛПНП), необходимы для развития атеросклеротических нарушений. Прогресс атеросклероза и частота его осложнений существенно снижаются (независимо от базовой концентрации ЛПНП) при применении ингибитора НМв-СоА редуктазы (3-гидрокси-3-метилглутарил коэнзим А редуктаза). Этот препарат, названный статином, ингибирует биосинтез холестерина и приводит к ускоренному выведению печенью ЛПНП (основного липидного компонента плазмы) из плазмы. Заметим, что разработка статинов - это большое достижение в области контроля и лечения атеросклероза, это яркий пример того, как исследования в области биохимии, клеточной биологии, физиологии и генетики человека могут приводить к разработке высокоэффективных методов лечения.
Известно, что количество функционирующих рецепторов ЛПНП на поверхности гепатоцитов является одним из важнейших факторов, влияющих на уровень ЛПНП в плазме, а регуляция активности и чувствительности ЛПНП-рецепторов - чрезвычайно сложный процесс. На концентрацию атерогенных липопротеинов, таких как ЛПНП, влияет также скорость продукции печенью липопротеинов очень низкой плотности
г
(ЛПОНП), представляющих собой метаболических предшественников ш ЛПНП. Вклад в понимание механизма регуляции продукции ЛПОНП ески
и ЛПНП внесли исследования среди лиц с низкой концентрацией ЛПНП. гич
Выявлено, что мутации гена апоВ - ключевого структурного белкового коло
компонента ЛПОНП и ЛПНП - могут частично приводить к снижению о
концентрации ЛПНП путем снижения продукции ЛПОНП. Пациенты с |
абеталипопротеинемией имеют мутацию типа «потери функции» в гене, и
кодирующем микросомальный белок переноса триглицеридов (БПТ), который необходим для «загрузки» триглицеридов на апоВ. Следовательно, эти мутации приводят к существенному повреждению процесса сборки и секреции ЛПОНП и к практическому отсутствию ЛПНП в плазме. Концентрации у человека ЛПНП были успешно снижены ингибированием продукции апоВ-100 (формы апоВ, продуцируемой печенью и входящей в состав ЛПНП) с помощью антисенс-олигонуклеотидов или ингибированием БПТ малыми молекулами, и эти стратегии лечения находятся на стадии клинических испытаний. Геномные исследования по ассоциации, скорее всего, приведут к обнаружению новых потенциальных мишеней для снижения концентрации ЛПНП.
Метаболизм ЛПВП. Как и в случае ЛПНП, основным липидным компонентом ЛПВП является холестерин. Однако, в отличие от ЛПНП холестерина, концентрация ЛПВП в плазме находится в обратной зависимости от атеросклеротической болезни. Метаболизм ЛПВП сложен и на него влияют множество факторов. ЛПВП считаются важным эндогенным защитным фактором от атеросклероза и поэтому являются одной из важных мишеней терапевтического воздействия. У животных суперпродукция или повторные введения основного белка в составе ЛПВП - апоА-1, снижает степень развития атеросклероза, а в двух предварительных клинических испытаниях показано, что апоА-1 имеет сходный эффект при применении у людей [7].
Однако «ЛПВП-гипотеза» о том, что подъем концентрации ЛПВП имеет положительный терапевтический эффект, была трудно доказуема в силу отсутствия клинических наблюдений среди лиц с существенным увеличением концентрации ЛПВП холестерина. Среди некоторых жителей Японии отмечена крайне высокая концентрацию ЛПВП в крови, и доказательство того, что это является результатом генетического дефекта белка, переносчика эфиров холестерина (БПЭФ), привело к разработке БПЭФ ингибиторов, которые увеличивают концентрацию ЛПВП у человека. Однако разработка первого БПЭФ ингибитора, доведенного до фазы III клинических испытаний, - торцетрапида, была приостановлена в силу его побочного эффекта - повышенной смертности и сердечно-
технологии
114
Актуальные вопросы антропоэкологических исследований
сосудистых осложнений. Представляет интерес также другой подход к увеличению концентрации ЛПВП - ингибирование эндотелиальной липазы (расщепляющей ЛПВП). Новые же мишени могут быть идентифицированы в ходе исследований молекулярной физиологии ЛПВП-метаболизма и функций этих структур.
Интересна гипотеза о том, что многие функции ЛПВП, возможно, эволюционировали от исходной функции обеспечения врожденного (неспецифического) иммунитета. Так, ЛПВП связываются с липополисахари-дами - компонентами клеточной стенки бактерий, и защищают мышь от индуцированной липополисахаридами смерти. Показано, что ЛПВП служат платформой для организации комплекса, содержащего апоЬ-1 и родственного гаптоглобину белка, который обладает высокой лити-ческой активностью против трипаносом. Выявлено, что большое число белков связаны ЛПВП человека, среди них белки, участвующие в воспалении, в регуляции комплемента и в формировании неспецифического иммунитета, а вариации в белковом составе ЛПВП, возможно, влияют на функции ЛПВП. Белковые компоненты ЛПВП использовались в качестве мишеней для лечения атеросклероза. Экспериментально показана возможность применения пептидов, полученных на основе последовательности апоА-1, способных мимикрировать стимулирующую выведение холестерола активность и/или противовоспалительные свойства ЛПВП.
Итак, можно сделать вывод о том, что отдельные стадии метаболизма различных форм липопротеинов являются важнейшими мишенями в современных методах профилактики и лечения атеросклеротических поражений сердечно-сосудистой системы.
Структурно-функциональный анализ ТРСазы и его неканонических антиангиогенных функций на различных уровнях. Уникальный набор дополнительных неканонических функций ТРСазы делает его особенно перспективным объектом структурно-функциональных исследований на различных уровнях - генном, экспрессии в форме специфических форм мРНК и белка. Как уже отмечалось, спектр регуляторных функций фермента достаточно широк - от участия в природном иннатном иммунитете, в реакциях защиты от аутоиммунных реакций и, наконец, в каскаде реакций контроля процессов роста и развития сосудов, особенно патологического. В пользу важной роли фермента свидетельствуют данные о его повышенном - 10-кратном увеличении содержания в ряде тканей у быков (селезенка, кора головного мозга, желудке) и почти 100-кратном превышении в поджелудочной железе - по сравнению с множеством тканей с обычным уровнем, сходным с другими ферментами даже этого же класса [8]. Критическим при этом было разработка оригинальных
подходов к выделению фермента, изучению его частично протеолизо- ш
ванных форм методами ферментативной кинетики и ограниченного про- S
теолиза. Большой раздел проведенных и проводимых в настоящее время |
исследований касался проблемы изучения полиморфизма регуляторных о
участков гена ТРСазы и его ассоциаций с неканоническими регуляторны- о
ми функциями и функциональный экспрессионный анализ гена с точки |
зрения выяснения возможности коррекции активности генов препарата- о
ми из ряда атранов (в частности, трекрезаном).
Большой блок проблем нацелен на исследования механизмов реализации цитокинной функции и контроля процессов ангиогенеза, т.к. ангиогенез прямо или косвенно вносит значительный вклад в развитие таких губительных патологий, как рак и сердечно-сосудистые заболевания. Здесь нами успешно осуществлен цикл структурно-функциональных исследований цитокинно активных форм ТРСазы и выявлен один из механизмов «переключения» основной ацилирующей функции ТРСазы в цитокинную. Нами были получены в опытах in vitro модифицированные формы ТРСазы и изучены их физико-химические и функциональные каталитические свойства. В частности, выявлено, что эндогенный протео-лиз нативной формы фермента, в условиях наличия субстратов ферментативной реакции, приводит к накапливанию цитокинно активной формы.
Это, в определенной степени, моделирует каскад реакций, запускаемых в ответ на гамма-интерферон по активации матриксных металлопротеи-наз и параллельной стимуляции ТРСазы на уровне РНК и белка, установленных в работе других авторов.
Подводя итог темам, затронутым в статье, хочется отметить, что мы находимся в начале очень увлекательного пути по раскрытию интимных, до сих пор полностью не изученных, механизмов контроля ключевых биологических процессов в клетке, тканях и организме, включая базовые процессы, приводящие к развитию широкого спектра распространенных заболеваний, контроля ключевых энергетических обменных процессов в мышцах, важных процессов дифференцировки тканей, механизмов развития и функционирования нервной ткани и формирования асимметрии функций мозга и различных органов.
Библиографический список
1. Киселев Л. Л. Аминоацил-тРНК-синтетазы (кодазы) и их неканонические функции // Молекулярная биология. 1990. Т. 24. С. 1445-1472.
2. A human aminoacyl-tRNA synthetase as a regulator of angiogenesis / Wakasugi K.,
Slike B.M., Hood J., Otani A., Ewalt K.L., Friedlander M., Cheresh D.A., Schimmel P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. 8. № 99 (1). S. 173-177.
технологии
Актуальные вопросы антропоэкологических исследований
3. Biologically active fragment of a human tRNA synthetase inhibits fluid shear stress-activated responses of endothelial cells / Tzima E., Reader J.S., Irani-Tehrani M., Ewalt K.L., Schwartz M.A., Schimmel P. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2003. № 100(25). S. 14903-14907.
4. Bovine tryptophanyl-tRNA synthetase. A zinc metalloenzyme / Engelhardt W.A., Kisselev L.L., Favorova O.O., Nurbekov M.K., Dmitriyenko S.G. // Eur. J. Biochem. 1981. 120. № 3. S. 511-517.
5. Ibba M., Soll D. The renaissance of aminoacyl-tRNA synthesis // EMBO Rep. 2001. № 2. S. 382-387.
6. Regulation of myocardial carbohydrate metabolism under normal and ischemic conditions. Potential for pharmacological intervention / Stanley W., Lopaschuk G.. Hall J., McComack J. // Cardiovasc. Res. 1997. № 33. S. 243-257.
7. Structural and functional consequences of the Milano mutation (R173C) in human apolipoprotein A-I / Alexander E.T., Tanaka M., Kono M., Saito H., Rader D.J., Phillips M.C. // J. Lipid Res. 2009. № 50 (7). S. 1409-1419.
8. Tryptophanyl-tRNA synthetase is a major soluble protein species in bovine pancreas / Sallafranque M.L., Garret M., Benedetto J.P., Fournier M., Labouesse B., Bonnet J. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. № 882 (2). S. 192-199.
