CC BY
17Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология» Том 16 (55) №2 (2003) 215-222.
УДК 612,014.46:615.214:547
ЭФФЕКТЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ГЛИКОПЕПТИДОВ НА ЭЛЕКТРИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙРОНОВ МОЛЛЮСКА HELIX ALBESCENS ROSSM
Равиева М.Ю., Ко ре ню к И. И., Гамма Т.Н., Курьянов В.О., Чупахина Т.Л
Введение
В настоящее время синтезируется большое количество веществ, в состав которых входят аминокислоты, обладающие медиаторными свойствами, и естественно, что внимание исследователей направлено на изучение механизмов действия таких соединений на нервную систему [ 12]. 11оскольку на нейронах моллюсков разных видов показано наличие рецепторов глутаминовой кислоты [4], глицина и др. биологически активных веществ [14], то нейроны моллюска являются приемлемой моделью [10] для исследований нейротропного действия соединений, содержащих медиаторные аминокислоты. Целью настоящего исследования было изучение эффектов воздействия на электрическую активность идентифицированных нейронов новых синтезированных соединений класса гликопептидов, в состав которых входят такие аминокислоты как глицин и глутаминовая кислота.
Методика
Эксперименты были проведены по общепринятой методике внутриклеточного отведения биопотенциалов [15] на 35 нейронах ПГ1а1,47-ППа2 и 33 - ППа7. Анализу были подвергнуты следующие параметры потенциалов нейронов: уровень мембранного потенциала (МП), критический уровень деполяризации (КУД), частота генерации импульсов (ЧГИ), амплитуда потенциала действия (ПД), длительность его фаз деполяризации и реполяризации, амплитуда и длительность следовой гиперполяризации (СГ). Изучалось действие следующих производных: 1,2:3,4-ди-0-изопропилиден-аа-D-галактопиранозилуроновая кислота - 1 (молекулярная масса-274), N-(1,2:3,4-ди-0-изопропилиден-a-D-i алакгопирануроноил)-глицил-0,Ь-глутаминовая кислота - 2 (молекулярная масса - 461), N-[N-( 1,2:3,4-ди-0-изопропилиден-а-0-галактопирануроноил)-глицил-глицин - 3 {молекулярная масса 523) [9] на вышеуказанные параметры электрической активности нейронов. Эксперименты проводились по схеме: фон, аппликация и экспозиция соединения во внеклеточной среде в течение 10 мин, отмывание 20 мин. Полученные данные обработаны с помощью пакета "Statistica 5.0" (р<0,05).
Результаты
Эффекты воздействия 1,2:3,4-Ои-О-изопропилиден- а-О-галактопирапозилуроновой кислоты (1). В отдельной серии экспериментов мы исследовали влияние этого моносахарида, являющегося химической основой используемых в наших экспериментах гликопептидов. Пороговая концентрация 1 для нейрона ППа2 составляла 10 ''М, а для нейронов ППа1 и ППа7 - 10"5М.
В концентрации 105 М 1 у нейронов ППа2 вызывала незначительное увеличение ЧГИ и их амплитуды (на 4±1,3 мВ), а параметры МП, КУД, длительности ПД и СГ существенно не изменялись. При отмывании у 67 % этих нейронов происходило снижение ЧГИ в 3 -4 раза и амплитуды ПД на 10±2 мВ, а в 33 % случаев уже через 1 - 2 мин наблюдалось полное прекращение импульсации, однако в течение 10-15 мин отмывания у всех нейронов ППа2 исходные параметры ЧГИ и амплитуда ПД восстанавливались. У нейронов ППа1 и 1111а7 не наблюдалось существенных изменений исследуемых параметров, т.е. они оказались менее чувствительны к действию ? в концентрации 10'5.
При увеличении концентрации до 10'4 М у всех нейронов наблюдалось волнообразное изменение паттерна ЧГИ с периодическим снижением и повышением импульсации. После аппликации МП в течение 30 с смещался в сторону гиперполяризации на 4 5 мВ, что сопровождалось урежением импульсации в 1,5 -2 раза (рис. 1 А). Затем МП возвращался к фоновому уровню, и в 1,5 - 2 раза увеличивалась ЧГИ, При этом амплитуда ПД существенно не изменялась, а его продолжительность у всех исследованных нейронов увеличивалась незначительно.
т'
Рис. I. Влияние соединения I в концентрации 10"* на нейрон ППа2. А - фон и аппликация (стрелкой обозначен момент аппликации), Б - увеличенная во времени часть подчеркнутого фрагмента А, пунктирная линия - уровень амплитуды деполяризационных совигов.
Интересно отметить, что через 40 - 60 с экспозиции вещества у некоторых нейронов ПГ1а2 между ПД появлялись не встречаемые в фоне небольшой амплитуды (7-10 мВ) деполяризационные потенциалы (рис. 1 Б). Такие делоляризационные сдвиги с крутым передним фронтом предшествовали полноценным ПД на восходящей части. При этом наблюдались НС-СД (начального сегмента - соматодендритные) углубления, которые могут рассматриваться в качестве критерия его антидромной природы. Деполяризационные пики появлялись, когда ЧГИ достигала определенного максимума, после чего происходило снижение ЧГИ и незначительно деполяризовалась мембрана.
После 20 мин отмывания все вышеперечисленные изменения показателей потенциалов возвращались к фоновому уровню и появления деполяризационных сдвигов МП не наблюдалось.
Реакция всех типов исследованных нейронов на действие данного соединения в концентрации 10"5 М выражалась в том. что МП смещался на 2 - 3 мВ в сторону гиперполяризации, однако, как и при действии 1, это сопровождалось увеличением в 1,5-2 раза ЧГИ. Причем у нейронов ППа!. генерирующих в фоне пачечную активность, происходило увеличение числа ПД в пачке без существенного изменения межпачечного интервала (рис. 2 А), а у нейронов с нетипичной пачечной активностью происходило увеличение ЧГИ с тенденцией их ] руппирования в пачки и увеличением в них числа ПД (рис. 2 Б). Кроме того, спайк уширялся на 3 - 4 мс за счет увеличения в равной
А - нейрон, генерирующии пачечную активность, Б - мономодально работающий нейрон, пунктирная линия - фоновый уровень мембранного потенциала. Стрелкой показан момент
аппликации.
мере продолжительности как фазы деполяризации, так и реполяризации. При
отмывании ^ иейфоноъ \Л\\аЛ V.. 1ЛГ\а1 Ъ&фЭДЛеТфЫ \ЛОТе\А\5Л\Л5\С>Ъ
восстанавливались через 5-10 мин, а у большинства нейронов ППа2 к 10 мин отмывания наблюдалось полное прекращение ЧГИ, причем искусственная деполяризация мембраны не индуцировала генерацию импульсов.
Таким образом, мы можем констатировать, что для нейронов ППа2 данная доза является токсической и нейроны данной популяции обладают более низкой резистентностью по отношению к соединению 1, чем нейроны ППа1 и ППа7.
Эффекты влияния Ы-(!,2:3,4-ди-0-изопроиилиден-?-0-галактопирануроноил)-глицил-0,Ь-глугаминовой кислоты (соединение 2). Пороговая концентрация 2 для трех питое исследованных нейронов составила 10'5 М однако, выраженные эффекты наблюдались при концентрации 2 104 М При этом, у всех нейронов МП смещался на 2 - 3 мВ в сторону деполяризации, незначительно повышалась ЧГИ\ снижались КУД и амплитуда ПД на 3±1,1 и 6±1.9 мВ соответственно. Длительность фаз деполяризации и реполяризации ПД и амплитуда следовой гиперполяризации увеличивались незначительно. При отмывании по сравнению с фоном амплитуда ПД снижалась на 10±2 мВ, а ЧГИ, длительность ПД и амплитуда СГ к 10 мин отмывания приближались к фоновому уровню.
При аппликации 2 в концентрации ] 0"3М по направленности реакции нейроны были разделены на 2 группы. В первую группу были отнесены 9 % исследованных нейронов, типичный пример развития реакции которых приведен на рис. 3. Как видно из рисунка, на первых 2 с экспозиции происходило резкое смещение МП в сторону деполяризации, сопровождающееся пропорциональным снижением амплитуды ПД и увеличением ЧГИ. 11ри снижении МП на 35 45 мВ полностью прекращалась генерация ПД, после чего падение МП до нуля продолжалось 16-20 с, После 10-20 мин отмывания исходный уровень М11 и активность у этих нейронов восстанавливались.
У 91 % нейронов развитие реакции было иным. При аппликации 2 на фоне деполяризации мембраны на 4 - 6 мВ наблюдалось увеличение ЧГИ в 2 - 3 раза, снижение КУД и амплитуды ПД на 4± 1 и 8±2 мВ соответственно. По мере увеличения
Рис. 3. Эффект воздействия соединения 2 в концентрации 10~3 М на электрическую
активность нейрона ПГ7а2. Момент аппликации показан стрелкой
времени экспозиции соединения во внеклеточной среде наблюдалось постепенное уменьшение МП (в целом на 7 - 10-мВ) и амплитуды ПД (в целом на 15-40 мВ). Длительность ПД у всех исследованных нейронов увеличивалась на 3-4 мс за счет увеличения в равной мере времени развития фаз как де- так и реполяризации. После отмывания у 27 % нервных клеток разных типов данной выборки происходило снижение частоты и амплитуды ПД, а также регистрировались дендритные ПД. В 64 % препаратов отмечалась гибель нейронов, свидетельством чему служило то, что на толчки входящего тока, подаваемые через 20 мин отмывания, не наблюдалось индуцирования в них генерации ПД.
Эффекты влияния 1,2:3.4-ди~0-изопропилиден-?-0-галактопирануроноил)~ глицил-глицина (соединение 3). Пороговая концентрация этого вещества для нейронов ППа1 и ППа7 составляла ¡(У* М, а для нейрона ППа2 - 10* М.
Соединение 3 в концентрации 10' у нейронов ППа2 вызывало незначительное снижение ЧГИ к 10 мин экспозиции, а остальные показатели значительно не изменялись. При отмывании в течение 20 мин ЧГИ практически возвращалась к фоновым значениям. V нейронов ППа! и ППа7 наблюдалась только тенденция к увеличению ЧГИ в первые секунды после аппликации. В концентрации Ю"4 и Ю*3 у всех исследованных нейронов на первых, секундах аппликации 3 наблюдался сдвиг МП в сторону гиперноляризации, причем его игубина и продолжительность у разных типов нейронов варьировала. Так, у нейронов ППа2 происходило увеличение МП на 4± I мВ (рис. 4), которое продолжалось в течение ¡0 с, затем МП восстанавливался до исходного уровня. У нейронов ППа! и ППа7 гиперполяризационный сдвиг был немного глубже - на 6 - 8 мВ, однако через 10 с МП начал постепенно восстанавливаться и к 5 мин экспозиции соединения возврат ился к фоновому уровню. Вышеперечисленные изменения МП сопровождались у всех нейронов увеличением ЧГИ в 1,5 - 2,5 раза, а у нейронов ППа1. генерирующих пачечную активность, увеличивалось количество ПД в пачке в 1,5-2 раза, а межпачечные интервалы не изменялись. В течение всего времени экспозиции (10мин) изменения ЧГИ. описанные выше, сохранялись, амплитуда ПД у нейронов ППа1 и Г1Па7 снижалась на 6 -2 мВ. а у нейронов ППа2 - достоверно не изменялась. Длительность фаз де- и реполяризации ПД увеличивалась незначительно (на 2=Н.2 мс). а остальные параметры Г1Д не изменялись.
Рис. 4. Влияние соединения 3 а концентрации }&} на нейрон ППа2г Стрелкой показан момент аппликации. Калибровка -50 мВ. Юс
При включения протока раствора Рингера у 55 % нейронов наблюдалось необратимое прекращение им пульсации, у остальных нейронов наблюдалась только тенденция к восстановлению импульсной активности, и так же, как у соединения 2, появлялись аксодендритные ПД.
Обсуждение
Полученные в ходе экспер и ментов данные показали, что соединение 1 оказывало на все исследованные нейроны активирующее влияние, выражающееся в увеличении частоты ич1.ульсации, без значительного изменения амплитуды ПД. Одним из возможных механизмов данного стимулирующего эффекта может являться активация работы Na+-i<+- насоса. Известно (13], что в нервных клетках брюхоногих моллюсков для энергаобеспечения работы Na+-K+-Hacoca в первую очередь используется энергия гликолиза, и, поскольку данное соединение является моносахаридом, вероятно, что вышеуказанный эффект является результатом увеличения энергетических обменных процессов в ¿слетке.
Относительно влияния соединения 2 можно сказать следующее. Так как данное вещество получено путем введения в структуру диацетонгалактуроновой кислоты 1 дипептиднот фрагмента (лицил-0,Ь-глутаминовой кислоты, то можно предположить, что возникающий деполяризационный эффект во многом обусловлен биологической ролью его пептидной части, которая содержит глутаминовую кислоту, относящуюся, как известно [12j. к сильным возбуждающим кислотам. Наблюдаемое в ходе эксперименте в смещение мембранного потенциала в сторону деполяризации и последующее за этим снижение амплитуды ПД, по-видимому, обусловлено увеличением входа ионов Na+.! 1одтверждением нашему предположению могут быть исследования Г4) деполяризующего действия глутамата на нейроны Helix, объясняя его увеличением входящего трансмембранного ионного тока.
Действие соединения 3 на активность нейронов было не однозначным. Так, гиперполярнзация мембраньк сопровождалась увеличением ЧГИ и снижением амплитуды ПД. что. вероятно, обусловлено действием 3 па различные ионные механизмы. Возможно, что данный эффект определен суммарным действием диацетонгалактуроновой кислоты и действием глицил-глицинового фрагмента. Известно f 12], что глицин является тормозным нейромедиатором, и полученный эффект обусловлен ".ем, что активным фактором действия этого соединения является данный дипептидныи. (Ьрагмент. Так как известно, что нейроны моллюска имеют рецепторы к ГАМК. то возможны, по-крайней мере, два механизма действия глицина: с одной стороьы - воздействие на ГАМК-epi ические рецепторы, а с другой - усиление ингибиторных процессов в нервной системе за счет снижения обмена - метаболической деградацией ГАМК или усилением ее высвобождения [12],
Неодинаковые пороговые концентрации соединений для нейронов, а также различная реакция нейронов ГТПа 1 и ППа7 по сравнению с нейронами ППа2 на действие
и последействие (отмь.ззние) соединений указывают на индивидуальную хемочувствительность мембран разных типов нейронов. Различия ответных реакций нейронов моллюска на действие соединений, содержащих пептиды, связывают [6] с наличием белого секрета з клетке который характерен для пептидергических клеток, Из используемых нами в экспериментах 3-х типов клеток, нервная клетка ГШа2 всегда лишена белого материала, что, вероятно, и обусловливает разнонаправленность ответов нейронов ППа! и ППа /от ответов клетки МПа2. Так же, не исключено, что у нейрона ППа2 больше, чем у нейронов ППа! и ППа7. чувствительных к соединениям 1 и 3 рецепторов на мембране сомы.
Невосстановление фоновых показателей после отмывания соединений в высоких концентрациях и высокий уровень нейрональнсй летал ьноети указывают на токсическое действие данных соединений. Вероятно, что данные вещества, проникая в мембрану или образуя комплексы с ее компонентами, влияют на структуру мембраны, что в свою очередь изменяет её проницаемость. Такое дейст вие характерно практически для всех препаратов в высоких концентрациях, обладающих нейротропными свойствами [II].
Увеличение продолжительности фаз деполяризации и реполяризации ПД у всех типов нейронов под действием 1,2 и 3 в концентрациях ! О4 и 10 \ вероятно, обусловлено активацией входящею кальциевого тока. Входящий кальциевый ток приводит к уширению спайка и к увеличению рефрактерного периода за счет гиперполяризации клетки, вызванной активам ей Са-стимулируемой калиевой проводимости вошедшими в клетку ионами кальция •'"].
Появление аксодепдрлтпух потенциалов у нейронов ППа2 при действии 1 можно объяснить тем. что дан«-.ос соединение эффективно облегчает антидромное распространение ПД из акесдендриткого локуса его генерации на мембрану сомы. Предположение о присут;/зии локуса пейсмекерной активности в аксодендритном древе высказывалось и ранге [-3]. Появление аксодендритных ПД после отмывания 2 и 3 может говорить с том то мембрана локуса возникновения ПД оказалась менее чувствительной к действию данных гликопептидов, чем мембрана сомы [16]. Кроме того, при изменении ьозб\ди мости клетки не каждый импульс НС возбуждает локус генерации, равно как затрудняется проникновение НС-спайка в сому нейрона и запуск СД-генератора [3].
Таким образом, исследованные в нашей работе производные оказывают разнонаправленное деист V с, которое завис ит от типа нейронов, химической структу ры соединений и их концентраций.
Список литературы
1. Баев К.В., Русин К И . Сафэонов Б.В. Ь-глутамат акт ивируемая проводимость мембраны нервных клеток спинного г*.озга в раннем эмбриогенезе лягушки Н Нейрофизиология, -1987.-Т. 19,-Ш. С. 251 258.
2. Балабан П.М., Норекль Т.П., Сторожу к В.К, Внутриклеточная регуляция пластических перестроек в иервн г1>ь ес ?! ка\ при обучения "' Внутриклеточная сигнализация. - М.,1988. -С. 16-21.
222
та М.Ю*, Корениук Л.Я., Гамма Т. В., Курьянов В.О., Чу п ахи на Т.Л
3. Безериьг' Ю.Л., Воронова Н.В., Чумаченко А.А. Значение множественности электрое ^будимых докусоь мембраны одиночной нервной клетки в обеспечении ее функци».!! Тезисы докладов XV Съезда всесоюзного физиологического общества им. И.П. Павлова. Кишинев - !987.-■ Ленинград: Издательство "Наука", 1987.-С. 189.
4. Герасимов 3. Д, Ионные механизмы деполяризационных ответов, вызываемых аппликацией
а нервных клетках виноградной улитки // Нейрофизиология, - 1982. -Т.14,-№ 6. -С 572-577.
5. Гомазков О.А. Функциональная биохимия регуляторных пептидов. - М: "Наука", 1992. -160с.
6. Дятлов НА. Модуляция се ротон и ном глииин-индуцируемых ионных токов в нейронах моллюска// Нейрофизиология. 1989. -T.2i.-№3. -С. 413-416.
7. Коааль Л.М., Кононенко Н.И Новые идентифицируемые клетки винофадной улитки Helix pomatia, связанные с генерацией ритмоводящей активности // Журнал высшей нервной деятельное.-1992.-Т.42. Вып.6. С. Н24 1131.
8. Калинина И.И., Курчавый Г.Г. Свойства ответов мотонейронов лягушки на аппликацию глутамата//Нейрофизиология.- 1988. -Т.20. -№6. - С, 776- 785.
9. Кур 'я ной ¡3.0., Чулахша Т.О., Чирва В.Я. Синтез М-уроноыамшоациламшв // 36. Тез. 19 Укргшсысм кокфере|Щнзopraw'moVxiMii.-Льв5в, 10- И вересня2001.С.239.
10. Магура И.С. Проблемы электрической возбудимости нейрональной мембраны. - Киев: *'Науко2а думка \ -1981. - 208с.
11. Пирузян Л А., Ковалев В.И.. Лавреикая ГХФ,, Ландау М.А. и др. Действие физиологически активных соединений на биологические мембраны.-М.: Наука, 1974.-389с,
12. Раевский К С. Возбуждающие аминокислоты, глутаматные рецепторы и патология ЦНС // Пагол физиология и эксперим. терапия. - 1990. - №1. - С. 3 - 9.
13. Скудьсзспй И. Д., Пивоваров Н.Б. Влияние ингибиторов энергетического метаболизма на накс i калия з кейронах моллюска P. conieus //Журн.эволюц. биохимии и физиологии.
• 1Ш. Т. 24. - №6. С.817 821.
14. Boy j P.;. Walker R.J. Actior. of the molluscan neuropeptide FMRF-amide on neurons in the suhcesop.:: ^eat gangiia of sra i Heii\ aspersa// Сотр. biochem. and phisioi. - 3 985. - V.81. -Nq2. - P. 37S-? so.
15. KonjnenKo N J, Modulation of endogenous electrical activity of the bursting neuron in the snail Helix poim.itta.'/Neurcsci.-1979.- V.4. -№32. - P. 2047-2054.
16. Копопеякс M.L Role of the axodendritic tree in the functioning of Helix bursting neurons: generation of pacemaker activity and propagation of action potentials along the axon И Neurosci. - 2000. - V.%. - № 2. - P.399 - 406.
Поступила в редакцию
