CC BY
56
УДК 639.09:615.2
ЭФФЕКТЫ ДЕЗИНФЕКТАНТА
ХЛОРАМИНА Т НА ПРОЦЕССЫ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ РАДУЖНОЙ ФОРЕЛИ (ONCORHYNCHUS MYKISS) Г.М. Ткаченко1, кандидат биол. наук; И. Грудневская2, кандидат биол. наук; А.В. Андрийчук3, аспирант; Н.Н. Кургалюк1, доктор биол. наук
1 Кафедра зоологии и физиологии животных, Институт биологии и охраны среды, Поморская Академия в Слупске, Польша
о
2 Отдел исследований лососевых рыб, Института пресноводного рыбного хозяйства, Рутки, 83-330 Жуково, Польша
о
3Институт животноводства,
Национальная Академия Аграрных Наук Украины, г. Харьков, Украина
UDC 639.09:615.2
DISINFECTANT CHLORAMINE T EFFECTS ON OXIDATIVE STRESS IN MUSCLE TISSUE OF RAINBOW TROUT {ONCORHYNCHUS MYKISS)
Tkachenko H.1, Cand. Biol. Sci. Grudniewska J.2, Cand. Biol. Sci. Andriichuk A.3
Kurhaluk N.1 , Cand. Biol. Sci.
A
'Department of Zoology and Animal
Physiology, Institute of Biology and
Environmental Protection, Pomeranian
University, Slupsk, Poland
2Department of Salmonid Research, Inland
Fisheries Institute, Rutki, 83-330 Zukowo,
Poland
o
3Institute of Animal Husbandry, National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
[email protected], [email protected]
Целью настоящего исследования было изучение дезинфицирующего влияния хлорамина Т (конечная концентрация 9 мг/л воды, по 20 минут аппликации трижды в течение 3 дней) на содержание маркеров окислительного стресса и активность системы антиоксидантной защиты в мышечной ткани радужной форели (ОпсогЬупсЬиэ туМээ) после профилактических дезинфицирующих мероприятий. Наши данные показывают, что мышечная ткань дезинфицированных рыб способна поддерживать про- и антиокислительное равновесие
(постоянный уровень маркеров оксидантного стресса) за счет увеличения активности
супероксиддисмутазы и каталазы после воздействия дезинфектанта. Хлорамин Т в конечной концентрации 9 мг/л воды можно использовать как
профилактическое дезинфицирующее средство без негативных последствий для мышечной ткани форели. Ключевые слова: дезинфекция, хлорамин Т, радужная форель, оксидационный стресс, антиоксидантная защита
The aim of this study was to examine the influence of a disinfectant chloramine T after prophylactic disinfected bathing (final concentration 9 mg per L of bath water, exposure during 20 min, three times per day, within 3 days) on oxidative stress biomarkers and antioxidant defense system in muscle tissue of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Our study showed that muscle tissue of disinfected fishes is capable to supporting pro- and antioxidant balance (unchanged level of oxidative stress markers) by increasing of the activity of superoxide dismutase and catalase after prophylactic chloramine T treatment. Chloramine T at a final concentration of 9 mg per L can be used as a preventive disinfectant without adversely affecting for the muscle tissue of trout.
Key words: disinfection, chloramine T, rainbow trout, oxidative stress, antioxidant defense
Профилактические мероприятия в рыбных хозяйствах включают соблюдение комплекса ветеринарно-санитарных правил, направленных на предотвращение внесения в систему специфических патогенов, в т.ч. профилактическая антипаразитарная обработка рыбы различными дезинфицирующими средствами [1]. Среди высокоэффективных универсальных дезинфицирующих средств, используюмых в аквакультуре, с выраженными бактерицидными, вирулицидными, фунгицидными свойствами лидирует хлорамин Т. Реагируя с водой, хлорамин образует хлор и хлорноватистую кислоту НС10, которая разлагается и выделяет активный кислород. Окисление ферментов и белковых молекул микроорганизмов вызывает их денатурацию (коагуляцию), что и приводит к гибели клетки. Хлорноватистая кислота может реагировать с сульфгидрильными (-ЭН) группами белков, оказывая таким образом дополнительный антимикробный эффект [2].
Целью настоящего исследования было изучение дезинфицирующего влияния хлорамина Т на содержание маркеров окислительного стресса (малоновый диальдегид, альдегидные и кетоновые производные окислительной модификации белков) и активность системы антиоксидантной защиты (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионредуктаза, глутатионпероксидаза, общая антиоксидационная активность) в мышечной ткани радужной форели (Опсо^упсМив туШвв) после профилактических дезинфицирующих мероприятий.
Эксперимент проводили в Отделе исследований лососевых рыб Института пресноводного рыбного хозяйства (Zukowo, Польша). Все биохимические анализы проводились на кафедре зоологии и физиологии животных Института биологии и охраны окружающей среды Поморского университета (Слупск, Польша). Радужная форель была разделена на две группы (контрольную и опытную). В опытной группе форель (п=11) была подвержена профилактическому купанию в растворе хлорамина (конечная концентрация 9 мг/л воды, по 20 минут аппликации трижды в течение 3 дней). Контрольную группу обработали подобным образом с использованием той же воды, в которой рыба находилась в бассейнах. Два дня после последнего купания рыбу отбирали из бассейнов для дальнейших исследований. Мышечная ткань была выделена из рыб после декапитации. Буфер изоляции содержал 100 мМ Трис^^ (рН 7,2). Гомогенаты центрифугировали 15 мин при 3000 об./мин. Белок в пробах определяли методом Брэдфорда (1976) [3]. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА) [4]. Оксидационную модификацию белков (ОМБ) определяли по содержанию кетоновых и альдегидных производных [5]. Активность системы антиоксидационной защиты (АОЗ) определяли за активностью супероксиддисмутазы (СОД, [6]), каталазы (КАТ, [7]), глутатионредуктазы
(ГР, [8]), глутатионпероксидазы (ГПО, [9]). Общую антиоксидационную активность (ОАА) оценивали в реакции с твином-80 [10]. Полученные результаты анализировали с помощью пакета программы STATISTICA 10,0 (StatSoft, Poland). Статистически достоверные разницы параметров между контрольной и опытной группами рыб оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни (р<0,05) [11].
Интенсификация процессов ПОЛ играет существенную роль в патогенезе многих заболеваний рыб, вызванных экзогенным загрязнением водоемов ксенобиотиками и разнообразными химическими соединениями, а также эндогенной активацией систем организма [12]. Поэтому развитие окислительного стресса может быть показателем первичного метаболического ответа организма на различные экстремальные факторы, в том числе и на действие дезинфицирующих средств. Как показали результаты наших исследований, дезинфекция рыб хлорамином Т существенно не влияет на интенсивность липопероксидации и оксидационной модификации белков в мышечной ткани радужной форели (табл. 1).
Кетоновые производные ОМБ, нмоль/мг белка 12,64±1,81 14,40±1,62
Таблица 1 — Влияние хлорамина Т на изменения маркеров оксидационного стресса в мышечной ткани радужной форели (ОпсогИупсИив тук1вв)._
Маркеры оксидационного стресса Контрольная группа рыб Вплияние хлорамина Т
МДА, нмоль/мг белка 540,98±64,58 527,63±62,73
Альдегидные производные ОМБ, нмоль/мг белка 18,13±2,67 19,20±1,89
Окислительный стресс любой этиологии обусловливает быструю реакцию системы АОЗ. Из литературных источников известно, что в механизмах регуляции свободнорадикальных и перекисных процессов ключевую роль играют ферменты АОЗ, такие как СОД, КАТ, ГР, ГПО и т.д. [13]. Повышение эффективности функционирования системы АОЗ предотвращает возникновения негативных последствий, вызванных интенсификацией свободнорадикальных процессов. В связи с этим следующим этапом наших исследований было определение активности ферментов системы АОЗ в мышечной ткани дезинфицированных хлорамином Т рыб (табл. 2).
Дезинфекция рыб вызвала разнонаправленные изменения в активности ферментов АОЗ. Как показали наши исследования, активность СОД и КАТ в мышечной ткани форели под влиянием хлорамина Т существенно увеличилась на 20% (р=0,000) и 35% (р=0,020) (табл. 2).
Таблица 2. Вплияние хлорамина Т на изменения активности ферментов антиоксидационной защиты в печени радужной форели (ОпсогИупсИив тук1вв).
Активность ферментов антиоксидационной Контрольная группа Влияние
защиты рыб хлорамина Т
СОД, ед. акт./мг белка 728,77±14,30 874,73±16,22*
КАТ, мкмоль/минмг белка 17,43±1,81 23,53±1,79*
ГР, мкмоль НАДФН2/минмг белка 11,40±1, 19 4,96±0,58*
ГПО, мкмоль GSH/мин•мг белка 252,09±22,97 163,65±11,08*
ОАА, % 85,17±1,72 64,67±1,81*
Примечание — изменения статистически достоверные (р<0,05) между показателями, полученными в контрольной и опытной группах рыб.
Существенная активация СОД и КАТ указывает на усиленное участие этих ферментов антиоксидационной защиты в элиминации супероксидного анион-радикала и пероксида водорода в мышечной ткани рыб под воздействием дезинфекции.
Клеточные механизмы АОЗ связаны также с функционированием мощного глутатионового звена, которое включает ряд ферментов: ГР, глутатион^-трансферазу, ГПО и кофакторы (глутатион, НАДФН) [14]. В наших исследованиях активности ГПО и ГР в мышечной ткани дезинфицированных рыб были существенно ниже по сравнению с рыбами контрольной группы, что может указывать на истощение глутатионового звена системы АОЗ в элиминации активных форм кислорода, генерируемых в результате действия хлорамина Т. Снижение активности ферментов АОЗ вызывает и существенное снижение общей антиокислительной активности на 24% (р=0,000) по сравнению с контрольной группой рыб.
Таким образом, дезинфекция рыб хлорамином Т не вызывает изменений в содержании маркеров оксидационного стресса в мышечной ткани радужной форели (О. mykiss). Хлорамин Т вызвал увеличение активности СОД и КАТ на фоне уменьшения активности глутатионового звена антиоксидантной защиты и общей антиокислительной активности. Наши данные также показывают, что мышечная ткань дезинфицированных рыб способна поддерживать про- и антиокислительное равновесие (постоянный уровень маркеров оксидационного стресса) за счет увеличения активности супероксиддисмутазы и каталазы после профилактического воздействия хлорамина Т. Наши исследования показывают, что хлорамин Т в конечной концентрации 9 мг/л воды можно исспользовать как профилактическое дезинфицирующее средство без негативных последствий для мышечной ткани форели.
This study was supported by grant of the Pomeranian University for Young Scientists.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Галактионова, Л.П. Состояние перекисного окисления больных с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки / Л.П. Галактионова, А.В. Молчанов, С.А. Ельчанинова, Б.Я. Варшавский // Клин. лаб. диагностика. - 1998. - №6. - С.10-14.
2. Камышников, В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике / В.С. Камышников. - М.: Медпрессинформ, 2004. - 589 с.
3. Королюк, М.А. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк, Л.И. Иванова, И.Г. Майорова, В.Е. Токарев // Лаб. дело. - 1988. - №1. - С. 16-19.
4. Костюк, В.А. Простой и чувствительный метод определения супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина / В.А. Костюк, А.И. Попович, Ж.И. Ковалева // Вопр. мед. химии. - 1990.
- №2. - С. 78-91.
5. Моин, В.М. Простой и специфический метод определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах / В.М. Моин // Лаб. дело. - 1986. - №8. - С. 724-727.
6. Fraise, A. Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization, 5th Ed. / A. Fraise,Maillard J.-Y., Sattar S. - Wiley-Blackwell, 2013. - 618 p.
7. Bradford M.M. A dye binding assay for protein / M.M. Bradford // Analytical Biochemistry - 1976. - №72.
- P. 248-254.
8. Glatzle, D. Glutathione reductase test with whole blood, a convenient procedure for the assessment of the riboflavin status in human / D. Glatzle, J.P. Vuilleumier, F. Weber, K. Decker // Experientia. - 1974. -№30. - P. 665-667.
9. Halliwell, B. Free radicals, antioxidants and human disease: Curiosity, cause or consequence / B. Halliwell // Lancet. - 1994. - №344. - P. 721-724.
10. Levine, R.L. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins / R.L. Levine, D. Garland, C.N. Oliver, A. Amici, I. Climent, A.-G. Lenz, B.-W. Ahn, S. Shaltiel, E.R. Stadtman // Methods in Enzymolology. - 1990. - №186. - P. 465-478.
11. Stacey M.M. Protein thiol oxidation and formation of S-glutathionylated cyclophilin A in cells exposed to chloramines and hypochlorous acid / M.M. Stacey, S.L. Cuddihy, M.B. Hampton, C.C. Winterbourn // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 2012. - №527. - P. 45-54.
12. Valavanidis, A. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants / A. Valavanidis, T. Vlahogianni, M. Dassenakis, M. Scoullos // Ecotoxicology and Environmental Safety. - 2006. - №64. - P. 178-189.
13. Yagi, K. Active oxygens, lipid peroxides, and antioxidants / Ed. by K. Yagi. - Japan Scientific Societies Press, Japan. - 1993. - 372 p.
14. Zar, J.H. Biostatistical Analysis. 4th ed. / J.H. Zar. - New Jersey: Prentice-Hall Inc., Englewood Cliffs. -1999. - 663 p.
