CC BY
102УДК 57.085:634.73:547-314
ЭФФЕКТЫ 24-ЭПИБРАССИНОЛИДА НА ЭТАПЕ ВВЕДЕНИЯ СОРТОВОЙ ГОЛУБИКИ ВЫСОКОЙ VACCINIUM CORYMBOSUML. В КУЛЬТУРУ IN VITRO
Е.П. ГЛЕБ, Е.С. ГУК, О.А. КУДРЯШОВА, А.А. ВОЛОТОВИЧ
Полесский государственный университет, г. Пинск, Республика Беларусь
Введение. Брассиностероиды являются перспективной группой гормонов растений. По химической природе - это производные оксистероидов с лактонной группой в кольце В. Внутриклеточный путь передачи сигнала и регуляция экспрессии генов начинается со связывания молекул брассиностероида с цитоплазматическим рецептором растительных клеток, представляющим собой BRIl-BAKl-киназный комплекс. В цитоплазме запускается каскад реакций фосфорилирова-ния, в результате которого происходит ингибирование активности ВШ2-киназы, с одной стороны, и накопление активных, находящихся в дефосфорилированном состоянии, факторов транскрипции BES1 и BZR1, с другой. В ядре растительных клеток факторы транскрипции распознают нуклео-тидные ДНК-последовательности промоторной области генов-мишеней, и после связывания с ними запускают экспрессию этих генов. Брассиностероиды стимулируют различные физиологические изменения в растительных клетках, включающие изменение мембранного потенциала, фотосинтетической и ферментной активности, баланса эндогенных фитогормонов. В действии брасси-ностероидов на рост и развитие растений отмечены также эффекты синергизма с другими фито-гормонами, в частности, с ауксинами. Регуляция роста и дифференцировки растительных клеток, опосредованная брассиностероидами, приводит к усилению реакции геотропизма, удлинению стебля, ускорению развития листа и роста пыльцевой трубки, дифференциации ксилемы, повышению жизнеспособности пыльцы, задерживанию старения листьев, и к повышению устойчивости растений к стрессу [1].
Голубика высокая (Vaccinium corymbosum L.) - перспективный, экономически значимый вид для промышленного культивирования в условиях нашей страны, особенно в южной агроклиматической зоне Беларуси [2].
Клональное микроразмножение видов рода Vaccinium является экономически выгодным [3, 4], и рассматривается как один из основных промежуточных этапов комплексной, современной технологии ускоренного производства качественного посадочного материала в промышленных объемах [5]. В настоящее время на базе НИЛ клеточных технологий в растениеводстве УО «Полесский государственный университет» разработан проект технологического регламента комплексного производства посадочного материала сортовой голубики высокой Vaccinium corymbosum L. в промышленных объемах по ускоренной технологии, с использованием метода клонального микроразмножения растений in vitro на начальном этапе производства [5]. Результаты научных исследований, проведенных на базе НИЛ клеточных технологий в растениеводстве ПолесГУ в 20092011гг., позволили существенно изменить традиционные [3, 4] в Республике Беларусь подходы к клональному микроразмножению растений рода Vaccinium L., в частности, усовершенствовать составы питательных сред, и сделать процесс производства посадочного материала более технологичным (заявка № А20110076 от 20.01.2011 года о выдаче патента Республики Беларусь на изобретение) [6].
В нашей статье впервые приведены результаты исследований регенерационной активности эксплантов голубики высокой V. corymbosum L. на модифицированной по составу агаризованной, питательной среде на макро- и микро- солевой основе WPM, дополненной 24-эпибрассинолидом, а также проведен сравнительный анализ результатов исследований регенерационной активности эксплантов сортовой голубики высокой на модифицированных питательных, агаризованных средах с органическими соединениями и на макро-, микро- солевой основе WPM и Андерсона, дополнительно содержащие гормоны 24- эпибрассинолид (ЭБ), зеатин и 6-у,у-диметилаллиламино-пурин (2iP).
Методика и объекты исследования. Исследования проводили на базе биотехнологической лаборатории НИЛ клеточных технологий в растениеводстве УО «Полесский государственный университет» в 2010-2011гг. В качестве объекта исследований использовали перспективные сорта голубики высокой V. corymbosum L. - Нортланд, Патриот, Блюкроп и Цукер Траубе.
В качестве первичных эксплантов для стерилизации и введения в культуру in vitro использовали неодревесневшие, верхушечные фрагменты стебля длиной 15 мм с 1-2 почками. Общее количество фрагментов составило 872 экспланта. В качестве стерилизующего агента по модифицированной методике введения растений V. corymbosum L. в культуру in vitro использовали 7,5% раствор гипохлорита натрия, при продолжительности экспозиции эксплантов 25 минут. После стерилизации и отмывки экспланты сортов Нортланд, Патриот, Блюкроп высаживали в пробирки диаметром 22 мм на питательные агаризованные среды на макро- и микро- солевой основе WPM, различающиеся по содержанию 24-эпибрассинолида (0,00 мг/л - контроль; 0,25 мг/л; 0,50 мг/л; 0,75 мг/л).
Экспланты сорта Цукер Траубе после стерилизации и отмывки в дистиллированной воде высаживали в пробирки диаметром 22 мм на 4 различающихся по составу типа питательных агаризо-ванных сред: тип 1 - макро-, микро- солевая основа WPM c 15 мг/л 2iP и 0,75 мг/л ЭБ; тип 2 -макро-, микро- солевая основа WPM c 1 мг/л зеатина и 0,75 мг/л ЭБ; тип 3 - макро-, микросолевая основа Андерсона c 15 мг/л 2iP и 0,75 мг/л ЭБ; тип 4 - макро-, микро- солевая основа Андерсона c 1 мг/л зеатина и 0,75 мг/л ЭБ.
Учет количества стерильных эксплантов, и стерильных активно регенерирующих эксплантов проводили через каждые 7 дней в течение двух месяцев культивирования на стеллажах световой установки культурального помещения биотехнологической лаборатории при температуре +25°С, фотопериоде день/ночь - 16ч/8ч, освещенности 4000 лк, относительной влажности воздуха 70%.
Общий математический анализ данных проводили по стандартным методам вариационной статистики [7], с использованием программы статистического анализа данных STATISTICA 6.0 [8].
Результаты и их обсуждение. Выход стерильных эксплантов голубики высокой in vitro после стерилизации и высадки на питательные среды сортов Патриот, Нортланд, Блюкроп представлены в таблице 1.
В соответствии с полученными данными, присутствие в составе модифицированной, агаризо-ванной, питательной среды 24-эпибрассинолида в концентрации 0,50 мг/л позволяет увеличить количество активно регенерирующих стерильных эксплантов исследуемых сортов на 3,8-65,0% (в 1,2-4,8 раза), в зависимости от генотипа (сорта).
В дальнейшем представляло интерес изучить возможные эффекты разных концентраций 24-эпибрассинолида на регенерантах in vitro. Так, в экспериментах с эксплантами сорта Блюкроп установлено повышение количества активно регенерирующих стерильных эксплантов с увеличением концентрации 24-эпибрассинолида в составе агаризованной питательной среды (таблица 1).
Таблица 1 - Выход стерильных эксплантов голубики высокой in vitro через 8 недель после стерилизации и высадки на питательные среды
Сорт Вариант опыта Общее количество ПЭ, шт Количество стерильных ПЭ, % Количество активно регенерирующих стерильных ПЭ, %
Патриот 1(контроль) 161 58,0±16,0 13,5±4,5
2 (0,50 мг/л 24-ЭБ) 132 74,7±18,2 25,8±0,1
Нортланд 1(контроль) 48 68,0 17,0
2 (0,50 мг/л 24-ЭБ) 28 100,0 82,0
Блюкроп (от 23.09.10) 1(контроль) 88 37,7 22,4
2 (0,50 мг/л 24-ЭБ) 91 64,8 26,2
Блюкроп (от 14.10.10) 1(контроль) 57 33,4 15,7
2 (0,25 мг/л 24-ЭБ) 43 25,0 16,3
3 (0,50 мг/л 24-ЭБ) 44 25,6 20,5
4 (0,75 мг/л 24-ЭБ) 58 46,6 34,5
Примечание - Данные для сорта Патриот представлены как среднее арифметическое ± стандартная ошибка. ПЭ - первичные экспланты. ЭБ - 24-эпибрассинолид
При этом присутствие 24-эпибрассинолида в концентрациях 0,25, 0,50 и 0,75 мг/л увеличивало выход активно регенерирующих стерильных эксплантов сорта Блюкроп на 0,6 % (в 1,1 раза), 4,8% (в 1,3 раза) и 18,8% (в 2,2 раза) соответственно. Известно, что брассиностероиды ускоряют синтез этилена на этапе между S-аденозилметионином и 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислотой [1]. Этилен стимулирует синтез АБК, которая ускоряет старение клеток, тормозит биохимические
11
процессы, являясь антагонистом ауксинов, цитокининов и гиббереллинов. При стрессах повышение концентрации этилена играет защитную роль. Стрессовый этилен индуцирует синтез защитных фитоалексинов и фермента хитиназы, разрушающего клеточные стенки грибов (в том числе, патогенных). Возможно, именно с подобным сложным, опосредованным эффектом брассиносте-роидов, связана эффективность применения ЭБ на этапе инициации побегообразования у регене-рантов сортовой голубики высокой при асептическом введении в культуру in vitro, выражающаяся в достоверном увеличении количества стерильных, активно регенерирующих эксплантов.
В дальнейшем был поставлен эксперимент с применением максимальной (0,75 мг/л) из изученных концентраций 24-эпибрассинолида в разных по микро-макро- солевому составу агаризован-ных, питательных сред для инициации побегообразования у эксплантов сорта Цукер Траубе при их введении в культуру in vitro. Кроме того среды различались по составу цитокининов.
Результаты исследований регенерационной активности эксплантов сорта Цукер Траубе in vitro на 4 типах модифицированных, агаризованных, питательных сред приведены в таблице 2.
Таблица 2 - Выход стерильных активно регенерирующих in vitro эксплантов сорта Цукер траубе на модифицированных питательных средах
Тип среды Общее количество первичных эксплантов шт. Количество стерильных эксплантов, % Количество стерильных, активно регенерирующих эксплантов, %
WPM+Имг/л 2iP+0,75 мг/л ЭБ 13 76,9 7,65
WPM+1,0 мг/л зеатина + 0,75 мг/л ЭБ 44 77,3 6,87
Андерсона+15мг/л 2iP+0,75 мг/л ЭБ 34 64,7 5,8
Андерсона+1,0 мг/л зеатина+0,75 мг/л ЭБ 31 70,96 25,8
Установлено повышение в 3,4-4,5 раза выхода стерильных эксплантов на макро-, микро- солевой основе среды Андерсона c 1 мг/л зеатина и 0,75 мг/л ЭБ, по сравнению с другими анализируемыми составами сред.
Следует также отметить, что во всех изученных вариантах с применением 24-эпибрассинолида, после пассажа регенеранты сохраняли не только стерильность, но и способность к активному побегообразованию in vitro. Некоторый спад активности побегообразования начинал проявляться только после 4-5 пассажей. В данном случае 24-эпибрассинолид можно рекомендовать и для стабилизации растений сортовой голубики высокой в культуре in vitro.
Таким образом, присутствие в составе агаризованной, питательной среды 24-эпибрассинолида приводит к увеличению количества активно регенерирующих стерильных эксплантов всех исследуемых сортов, что существенно снижает расход дорогостоящих компонентов питательной агари-зованной среды и себестоимость размножаемого in vitro посадочного материала сортовой голубики высокой. Кроме того, сокращаются сроки введения (теоретически, любого) сорта голубики высокой в культуру in vitro.
Выводы. В присутствии 0,5 мг/л 24-эпибрассинолида в составе агаризованной, питательной среды достоверно в 1,2-4,8 раза увеличивается количество активно регенерирующих стерильных эксплантов сортов Патриот, Нортланд, Блюкроп.
Установлено увеличение в 1,1-2,2 раза количества активно регенерирующих стерильных экс-плантов сорта Блюкроп, с ростом концентрации 24-эпибрассинолида в пределах 0,25-0,75 мг/л соответственно.
Применение 0,75 мг/л 24-эпибрассинолида в сочетании с 1 мг/л зеатина в составе среды Андерсона привело к увеличению выхода стерильных, активно регенерирующих эксплантов сорта Цукер Траубе в 3,4-4,5 раз, по сравнению с другими исследуемыми типами агаризованных, питательных сред, различающихся по компонентному составу.
В целом, результаты исследований указывают на то, что относительно высокие концентрации 24-эпибрассинолида, находящиеся в диапазоне 0,50-0,75 мг/л, рекомендуется использовать в составе агаризованных, питательных сред для индукции побегообразования при введении сортовой голубики высокой в культуру in vitro. При этом существенно увеличивается количество стериль-
ных, активно регенерирующих эксплантов сортовой голубики, сохраняющих регенерационную активность после пассажа.
Авторы выражают благодарность заведующему лаборатории химии стероидов Института биоорганической химии НАН Беларуси, член-корреспонденту НАН Беларуси, д.х.н., профессору Владимиру Александровичу Хрипачу за предоставленный 24-эпибрассинолид.
ЛИТЕРАТУРА
1. Hayat, S. Brassinosteroids: A Class of Plant Hormone / S. Hayat, A. Ahmad. - 2010. - 462 p.
2. Рупасова, Ж.А. Голубика высокорослая: оценка адаптационного потенциала при интродукции в условиях Беларуси / Ж.А. Рупасова [и др.]. - Мн., 2007. - 442 с.
3. Сидорович, Е.А. Клональное микроразмножение новых плодово-ягодных растений / Е.А. Сидорович, Е.Н. Кутас. - Мн., 1996. - 246 с.
4. Решетников, В.Н. Некоторые аспекты микроклонального размножения голубики высокой и брусники обыкновенной / В.Н. Решетников [и др.] // Плодоводство. - 2007. - Т. 19. - C. 209-216.
5. Волотович, А.А. Результаты деятельности НИЛ клеточных технологий в растениеводстве УО «Полесский государственный университет» как модель развития прикладной биотехнологии на базе ВУЗа // Материалы V междунар. науч.-практ. конф. «Устойчивое развитие экономики: состояние, проблемы, перспективы», Пинск, 28-29 апреля 2011 г. Пинск: ПолесГУ, 2011. Ч. I. С. 286-288.
6. Глеб, Е.П. Усиление регенерационной активности голубики высокой Vaccinium corymbosum L. In vitro в присутствии 24-эпибрассинолида / Е.П. Глеб [и др.] // Научный потенциал молодежи - будущему Беларуси : материалы V международной молодежной науч.-практ. конференции. - Пинск, 2011. - Ч. III. - С. 227229.
7. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта / Б.А. Доспехов. - М., 1985. - 351 с.
8. Боровиков, В.П. STATISTICA: Искусство анализа данных на компьютере / В.П. Боровиков. - СПб, 2001. - 650 с.
24-EPIBRASSINOLIDE EFFECTS AT THE STAGE OF IN VITRO INTRODUCTION OF THE HIGH-BUSH BLUEBERRY VACCINIUM CORYMBOSUM L.
H.P. HLEB, E.S. GUK, O.A. KUDRYASHOVA, A.A. VOLOTOVICH
Summary
The results of the comparative analysis of high-bush blueberry explants regenerative activity on WPM and Anderson modified nutrient mediums are resulted at in vitro introduction. The method of in vitro introduction and stabilization of almost any cultivar of high-bush blueberry V. corymbosum L. is offered in the presence of 24-epibrassinolide of 0.25-0.75 mg/l concentration.
© Глеб Е.П., Гук Е.С., Кудряшова О.А., Волотович А.А.
Поступила в редакцию 21 сентября 2012г.
