CC BY
13
DOI: https://doi.org/10.17650/1726-9784-2022-21-3-72-81
Cct0
Эффективность стерилизации пучком ускоренных электронов гидрогеля для 3D-культивирования мезенхимальных мультипотентных клеток
П.А. Быстров1, К.М. Новрузов2, М.П. Потапнев3, С.М. Космачева3, Н.Ю. Анисимова2, 4, М.В. Киселевский2, 4, П.С. Мышелова4, И.Н. Булыгина4, Ф.С. Сенатов4
ФГБУНИнститут физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН; Россия, 119071 Москва, Ленинский пр-т, 31, корп. 4;
2ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115522 Москва, Каширское шоссе, 24;
3ГУ«Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий»; Беларусь, 220053 Минск, Долгиновский тракт, 160;
ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС»; Россия, 119049 Москва, Ленинский пр-т, 4
Контакты: Керям Мурсали оглы Новрузов [email protected]
Введение. Гидрогели перспективны для использования в тканевой инженерии для восстановления и регенерации различных тканей, поскольку способны выполнять функции объемных скаффолдов, обеспечивая формирование 3D клеточных структур. Заселение таких скаффолдов аутологичными или гетерогенными мезенхи-мальными мультипотентными стромальными клетками in vitro дает возможность локализовать эти клетки в области тканей-мишеней после имплантации пациенту. Одной из сложных задач является выбор способа и режима стерилизации гидрогеля, не изменяющих его свойства.
Цель исследования - изучение эффективности стерилизации гидрогеля пучком ускоренных электронов в различных режимах, изменения структуры и биосовместимости скаффолда для оценки перспектив его использования в медицинских целях, в том числе в качестве платформы для мезенхимальных стромальных клеток.
Материалы и методы. В работе использовали гидрогель на основе полисахаридов (4 % растворы альгината натрия и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы), сшитых хлоридом кальция, который был разработан, получен и предоставлен для наших исследований коллективом Научно-образовательного центра биомедицинской инженерии ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС». Образцы гидрогеля, нагруженные Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Saccharomyces cerevisiae, были подвергнуты обработке пучком электронов в диапазоне 5-100 кГр. После электронно-лучевой обработки гидрогеля оценивали наличие живых микроорганизмов и изменение его структуры методом инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье, а также фенотип мезенхимальных мультипотентных клеток и формирование ими 3D-структур.
Результаты. Было установлено, что режим обработки гидрогелей пучком электронов в режиме 25 кГр обеспечивает гибель микроорганизмов, не разрушая структуру гидрогеля, и не ингибирует способность формировать капилляроподобные структуры мезенхимальными мультипотентными клетками.
Заключение. Обработка пучком ускоренных электронов в режиме 25 кГр может быть использована с целью стерилизации гидрогелей для получения объемных скаффолдов клеточно-инженерных имплантатов.
Ключевые слова: гидрогель, мезенхимальные мультипотентные стромальные клетки, стерилизация, пучок ускоренных электронов, скаффолд
Для цитирования: Быстров П.А., Новрузов К.М., Потапнев М.П. и др. Эффективность стерилизации пучком ускоренных электронов гидрогеля для 3D-культивирования мезенхимальных мультипотентных клеток. Российский биотерапевтический журнал 2022;21(3):72-81. DOI: 10.17650/1726-9784-2022-21-3-72-81
Efficiency of accelerated electron beam sterilization of a hydrogel for 3D cultivation of mesenchymal multipotent cells
Peter A. Bystrov1, Keryam M. Novruzov2, Mikhail P. Potapnev3, Svetlana M. Kosmacheva3, Natalia Yu. Anisimova2,4, Mikhail V. Kiselevskiy2,4, Polina S. Myshelova4, Inna N. Bulygina4, Fedor S. Senatov4
'A.N. Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry, Russian Academy of Sciences; Bld. 4, 31 Leninsky Ave., Moscow 119071, Russia;
2N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115522, Russia; 3Republican Scientific and Practical Center for Transfusiology and Medical Biotechnologies; 160 Dawhinawskiy Trakt, Minsk 220053, Belarus;
4National University of Science and Technology "MISIS"; 4 Leninsky Ave., Moscow 119049, Russia
Contacts: Keryam Mursali ogly Novruzov [email protected]
Background. Hydrogels are promising for use in tissue engineering for the restoration and regeneration of various tissues, since they are able to perform the functions of bulk scaffolds, providing the formation of 3D cell structures. Population of such scaffolds with autologous or heterogeneous mesenchymal multipotent stromal cells in vitro makes it possible to localize these cells in the area of target tissues after implantation in a patient. One of the difficult tasks is the choice of the method and mode of sterilization of the hydrogel, which does not change its properties.
Aim. Study of the effectiveness of hydrogel sterilization by an accelerated electron beam in various modes, changes in the structure and biocompatibility of the scaffold, to assess the prospects for its use for medical purposes, including as a platform for mesenchymal stromal cells.
Materials and methods. We used a hydrogel based on 4 % solutions of sodium alginate and sodium salt of car-boxymethyl cellulose, cross-linked with calcium chloride, which was developed, obtained and provided for our research by the team of the Research and Educational Center for Biomedical Engineering of the National University of Science and Technology "MISIS". Hydrogel samples loaded with Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Saccha-romyces cerevisiae were subjected to electron beam treatment in the range of 5-100 kGy. After electron beam treatment of hydrogel, the presence of living microorganisms and its structure were evaluated by IR-Fourier spectroscopy, as well as the phenotype and formation of 3D structures by mesenchymal multipotent cells. Results. It was found that the treatment of hydrogels with an electron beam at a mode of 25 kGy ensures the death of microorganisms, but does not destroy the structure of the hydrogel and does not inhibit the ability to form capillary-like structures by mesenchymal multipotent cells.
Conclusion. Treatment with an accelerated electron beam at a 25 kGy can be used to sterilize hydrogels to obtain bulk scaffolds for cell engineering implants.
Keywords: hydrogel, mesenchymal multipotent stromal cells, sterilization, accelerated electron beam, scaffold
For citation: Bystrov P.A., Novruzov K.M., Potapnev M.P. et al. Efficiency of accelerated electron beam sterilization of a hydrogel for 3D cultivation of mesenchymal multipotent cells. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2022;21(3):72-81. (In Russ.). DOI: 10.17650/1726-9784-2022-21-3-72-81
Введение
Гидрогель (ГГ) является разновидностью полимерного полутвердого материала, который обладает хорошей биосовместимостью и способен впитывать большое количество воды. Из-за физического сходства ГГ с тканью человека они используются в качестве субстратов для клеточных культур и раневых повязок. С появлением и развитием тканевой инженерии ГГ стали использовать для восстановления и регенерации различных тканей и органов [1]. Ме-зенхимальные мультипотентные (стволовые) стро-мальные клетки (ММСК) применяют для регенерации тканей, лечения и профилактики цитокинового шторма при СОУГО-19 и реакции «трансплантат против хозяина», а также для стимуляции гемопоэза при аллогенной трансплантации стволовых гемопо-этических клеток [2—5]. В отличие от рутинного
культивирования использование ГГ позволяет создавать 3D-скаффолды, заселенные ММСК, что дает возможность локализовать эти клетки в области тканей-мишеней [6]. Более того, ГГ, дополненный ростовыми факторами, может значительно улучшить пролиферацию клеток в системе 3D-культивирования и обеспечить управляемую миграцию ММСК в целевую область [7]. 3D-культивирование ММСК способствует структурообразованию клеточной культуры и улучшает локальную перфузию тканей, что подтверждает перспективность использования ГГ в качестве скаффолда для локальной доставки ММСК и стимуляции ангиогенеза [8].
В настоящее время используется большое количество синтетических и природных полимеров, а также конструкций из них в качестве скаффолдов для клеточных культур. К перспективным направлениям
относятся создание клеточных сфероидов ММСК, инкапсулированных в ГГ для локального введения, а также внесение в ГГ различных факторов, стимулирующих пролиферацию и хемотаксис стволовых клеток. В частности, одним из перспективных направлений является насыщение синтетических ГГ плазмой, обогащенной лизатом тромбоцитов (platelet reach plasma, PRP) — PRP-продуктом [9]. PRP-про-дукты содержат биоактивные компоненты, способствующие регенерации тканей [10]. Недавние работы описывают подходы к использованию PRP и гелей на ее основе для культивирования ММСК [11]. Полимерные системы доставки предназначены также для улучшения низкой растворимости некоторых биологически активных соединений, продления времени их циркуляции в крови и улучшения их биораспределения [12, 13]. Однако, несмотря на перспективы использования ГГ в медицине, для их широкого клинического применения еще предстоит решить ряд проблем.
Помимо эффективности и биосовместимости важным требованием к любому биоматериалу, предназначенному для внесения в организм, является микробиологическая безопасность, или стерильность. Эффективная стерилизация материалов имеет решающее значение для сведения к минимуму инфекционных осложнений, связанных с имплантируемыми медицинскими устройствами. Методы стерилизации имеют особо важное значение для комбинированных медицинских устройств, таких как системы доставки клеточных культур и лекарств, в которых необходимо уделять внимание целостности имплантата и таким факторам, как деградация/стабильность лекарства и жизнеспособность клеток, внесенных в него. Рутинные методы стерилизации, применяемые в медицинской практике, связанные с термическим или химическим воздействием, могут существенно изменить структуру и свойства ГГ, поэтому для их стерилизации чаще всего используют электронно-лучевые установки. R. Galante и соавт. [14] исследовали эффективность обработки ГГ гамма- и бета-излучением в диапазоне доз 2—100 кГр, при этом стерилизующий эффект отмечался при достижении дозы не ниже 25 к1р. Однако электронно-лучевая обработка может изменять свойства ГГ, такие как масса, форма, растворимость и структура, ухудшая его биологические свойства [15]. Несмотря на важность этой проблемы, из большого числа работ, посвященных изучению ГГ и перспектив их клинического использования, лишь менее 1 % публикаций освещают вопросы стерилизации этих полимерных материалов. Поэтому целью исследования стало изучение эффективности стерилизации ГГ пучком ускоренных электронов и влияния различных режимов облучения на его массу, структуру и биосовместимость для оценки перспектив
его использования в медицинских целях, в том числе в качестве платформы для ММСК.
Материалы и методы
Характеристика образцов. В работе использовали 50 образцов ГГ сферической формы диаметром 7 ± 2 мм на основе 4 % растворов альгината натрия и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, сшитых хлоридом кальция, которые были предоставлены для наших исследований коллективом Научно-образовательного центра биомедицинской инженерии ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС». В литературе описаны получение, структура и свойства ГГ медицинского назначения на основе альгината натрия и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы [16, 17].
Определение активности живых микроорганизмов и их способности к делению после облучения пучком ускоренных электронов. В качестве модельных микроорганизмов использовали 20-48-часовые культуры грамотрицательных бактерий Escherichia coli (E. coli), грамположительных неспорообразующих бактерий Lactobacillus acidophilus (L. acidophilus) и дрожжевых грибов Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) (коллекция ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России). Инокуляты модельных культур микроорганизмов ресуспендировали в жидкой питательной среде: S. cerevisiae в бульоне Сабуро (концентрация 3,6 х 106 клеток/мл), E. coli и L. acidophilus в триптозно-соевом бульоне (все среды: Pronadisa, Испания). С целью подготовки для исследования образцы ГГ промывали в стерильном растворе Хенкса («ПанЭко», Россия), а затем на каждый образец наносили по 50 мкл суспензии микроорганизмов (СМ). Для оценки исходного уровня жизнеспособности микроорганизмов 50 мкл СМ вносили в 500 мкл мясо-пептонного бульона (МПБ) (Pronadisa, Испания).
Подготовленные образцы ГГ с нанесенными микроорганизмами (СМ + ГГ) помещали по одному в пластиковые центрифужные пробирки объемом 2 мл. В отдельных сериях в пробирки помещали образцы промытого ГГ без микроорганизмов (только ГГ) или только СМ в объеме 50 мкл. Затем во все пробирки вносили по 500 мкл МПБ. Не позднее чем через 3 ч после приготовления дублированные образцы ГГ, СМ, СМ + ГГ были подвергнуты облучению в компактной радиационно-технологической установке при различных режимах обработки (5, 10, 25, 50, 100 кГр), как было описано нами ранее [18]. После обработки образцов для оценки бактерицидного эффекта тестировали наличие живых микроорганизмов в каждом образце, а также определяли их способность к росту (делению клеток) в тестах на бактериостатическую активность. В качестве контроля использовали образцы,
Оригинальные статьи | Original reports 75
не подвергавшиеся воздействию электронного пучка гичных условиях. Результат исследований рассчиты-(режим 0 кГр). вали как отношение измеренной величины гемолиза Для оценки воздействия изучаемых физических или цитотоксичности в конце периода инкубации факторов на жизнеспособность дрожжей использо- к исходным уровням указанных параметров. ГГ рас-вали клеточный анализатор Luna (Logos Biosystems, сматривали как биосовместимый в случае отсутствия Корея). Для определения жизнеспособности бакте- достоверных отличий клеточной реактивности в лун-рий использовали метод культивирования в присутст- ках с ГГ и в контроле. вии красителя AlamarBlue (Invitrogen, США) с после- Изучение 3D-кулы'ивирования ММСК в ГГ. Гене-дующей оценкой флуоресценции при 530 Ex/590 Em рацию культуры ММСК из костного мозга здоровых в триплетах на планшетном ридере Spark (Tecan, собак породы бигль для изучения 3D-культиви-Швейцария). Результат воздействия обработки пуч- рования на модели объемного скаффолда проводили ком электронов на жизнеспособность дрожжей рас- в соответствии с методикой, изложенной ранее [19]. считывали как процентное отношение величин флу- С этой целью охлажденный до +4 °С матригель (Ma-оресценции в пробах ГГ, СМ, СМ + ГГ к исходному trigel Basement Membrane Matrix, Corning, США) сме-уровню. шивали с полной питательной средой в соотношении Для оценки воздействия изучаемых физических 1:1 на льду и разливали по 1 мл в лунки охлажден-факторов на способность микроорганизмов к деле- ного 24-луночного планшета (Nunc, ThermoFisher нию тестируемые образцы после обработки пучком Scientific, США). ММСК были деадгезированы трип-электронов помещали в 500 мкл МПБ и инкубиро- сином, затем отмыты RPMI-1640, ресуспендированы вали в течение 1 сут при 20 °С (S. cerevisiae) или 37 °С в полной питательной среде и внесены в лунки с ма-(E. coli и L. acidophilus) в атмосфере 5 % СО2. Для уче- тригелем в концентрации 3,2—4,4 х 104 клеток/мл. та результата проводили оценку абсорбции в трипле- Инкубацию клеток осуществляли при 37 °С и 5 % СО2 тах при 540 нм против 690 нм на приборе Spark (Tecan, в течение 12 сут. Для оценки особенностей структу-Швейцария). Отдельно учитывали абсорбцию в лунках, рообразования ММСК были изучены морфологи-содержащих только 500 мкл МПБ. Результат рассчи- ческие особенности роста культуры по результатам тывали по формуле: световой микроскопии после окрашивания клеток гематоксилином и эозином («ПанЭко», Россия). Для А _ а определения концентрации делящихся клеток оце-Рост культуры, % = — МПБ х 100, нивали уровень ММСК, маркированных Ki-67, с по-Ак - Ампб мощью набора Muse® Ki67 Proliferation Kit (EMD Mil- lipore Corp., Германия) и клеточного анализатора Muse где Ао — абсорбция в образце, Ак — абсорбция в кон- (EMD Millipore Corp., Германия). Для оценки фено-троле, АМПБ — абсорбция в МПБ. типа использовали антитела против CD11c, CD11b, Инфракрасная (ИК) спектроскопия с преобразова- CD62 (BD Bioscience, США). Уровень экспрессии нием Фурье (ИК-Фурье-спектроскопия). Для изучения клетками данных молекул определяли на проточном влияния различных режимов стерилизации на изме- цитометре ACEA Novocyte (Bioscience Inc., США). нение химических связей ГГ был выполнен анализ Статистический анализ данных. Для описания ре-образцов методом нарушенного полного внутренне- зультатов измерений в отдельных группах рассчиты-го отражения в ИК-области. Исследование проводи- вали среднее значение и стандартную девиацию. ли на ИК-спектрометре Nicolet 380 (Thermo Scientific, Для проведения сравнительного анализа воздействия США) в диапазоне от 4000 до 750 см-1 при комнатной различных режимов физических факторов относи-температуре. Данный метод позволяет судить о дегра- тельно контроля использовали тесты х2. Отличия дации ГГ c помощью мониторинга изменений по ре- между группами считали достоверными прир <0,05. зультирующим пикам, которые соответствуют определенным функциональным группам. Результаты Биосовместимость. Для оценки биосовместимости Определение активности живых микроорганизмов изучали уровень индуцированного гемолиза и цито- после облучения пучком ускоренных электронов. На 1-м токсичности в соответствии с методиками, изложен- этапе работы были оценены антибактериальная и ан-ными ранее [15]. C этой целью образцы ГГ по одному тифунгицидная активность облучения в диапазоне инкубировали с суспензией эритроцитов и лейкоци- воздействующих доз от 5 до 100 кГр (рис. 1). тов крови здорового донора, предварительно оценив Как видно из рис. 1, а, наблюдалось достоверное базовый уровень жизнеспособности и гемолиза в кле- снижение концентрации живых дрожжевых клеток точных суспензиях. Длительность инкубации соста- в СМ под воздействием обработки пучком ускорен-вила 2 и 24 ч. В качестве контроля использовали клетки, ных электронов при всех режимах (от 5 до 100 кГр) которые инкубировали при отсутствии ГГ в анало- в сравнении с контролем. Максимальный эффект (44 %)
3'2022 том 21 1 vol. 21 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
s-s
150
100
50
0 5 10 25 50 100 Режим обработки, кГр / Processing mode, kGy
о S
CP и
80 60 40 20
0 5 10 25 50 100 Режим обработки, кГр / Processing mode, kGy
8 £
100 ± 0,05
50
± 0,33* ± 0,10* ± 0,71* ± 0,11* ± 0,15*
0 5 10 25 50 100 Режим обработки, кГр / Processing mode, kGy
m
100
± 2,4
e
о 2 с
t 8
8 £ " о
50
± 0,86*
± 0,51* ± 0,36* ± 0,55* ± 0,93*
0 5 10 25 50 100 Режим обработки, кГр / Processing mode, kGy
100
± 8
m
e
о _
d <u
о *
2 .c о -g
Л w
50
± 1*
± 0*
± 1*
0 25 35 50
Режим обработки, кГр / Processing mode, kGy
Рис. 1. Результаты оценки выживаемости дрожжей S. cerevisiae в суспензии (а) и на образцах гидрогеля (б); грамотрицательных бактерий E. coli в суспензии (в) и на образцах гидрогеля (г); грамположительныа неспорообразующих бактерий L. acidophilus (д) после обработки пучком ускоренных электронов в различных режимах относительно исходного уровня жизнеспособности. Контроль — режим обработки 0 кГр. *Достоверное отличие от контроля (p <0,05)
Fig. 1. Results of evaluating the survival rate of yeast S. cerevisiae in suspension (а) and on hydrogel samples (б); gram-negative bacteria E. coli in suspension (в) and on hydrogel samples (г); gram-positive non-spore-forming bacteria L. acidophilus (д) after treatment with an electron beam in various modes relative to the initial level of viability. Control — processing mode 0 kGy. *Differences from the control are significant (p <0.05)
б
а
0
0
в
г
0
0
д
0
отмечен после применения режимов 50—100 кГр. Эффект обработки пучком ускоренных электронов образцов ГГ с нанесенными дрожжами (СМ + ГГ) был сходным (см. рис. 1, б). Достоверный фунгицидный эффект (46—51 % относительно исходного уровня) наблюдали только в результате применения режимов 50—100 кГр. Использование режима 25 кГр обеспечивало гибель в среднем 41 % дрожжей. Значительно более выраженный антимикробный эффект изучаемого метода обработки был обнаружен на модели E. coli (см. рис. 1 в, г). Так, было установлено, что применение всех использованных режимов приводило к достоверному угнетению жизнеспособности бактерий как в суспензии, так и на образцах ГГ (гибель 95— 100 % относительно исходного уровня). На модели
грамположительных бактерий L. аcidophilus было показано, что полная гибель этих микроорганизмов на ГГ происходила при использовании режимов 25— 50 кГр (см. рис. 1, д).
Исследование способности микроорганизмов к делению после облучения. Согласно приведенным выше результатам, воздействие пучка ускоренных электронов не обеспечивало немедленной гибели дрожжей. Для проверки гипотезы о том, что изучаемый метод все же перспективен для стерилизации ГГ, в специальной серии экспериментов исследовали его способность подавлять деление микроорганизмов, предотвращая рост культуры (т. е. фунгио-/бактериостатический эффект оказанного воздействия). А именно оценили подавление роста культуры микроорганизмов,
100
50
± 11,3*
± 0,3* ± 1,5* ± 1,2*
0 5 10 25 50 100 Режим обработки, кГр / Processing mode, kGy
£ s ^ p
100
50
± 14,5
0 5 10 25 50 100 Режим обработки, кГр / Processing mode, kGy
100 ± 0,05
50
± 0,33* ± 0,10* ± 0,71*
± 0,11*
± 0,15*
0 5 10 25 50 100 Режим обработки, кГр / Processing mode, kGy
£ s ^ p
100 ± 2,4
80
60
40
20
± 0,51* ± 0,36* ± 0,55* ± 0,93* ± 0,86*
0 5 10 25 50 100 Режим обработки, кГр / Processing mode, kGy
Рис. 2. Оценка подавления роста культуры микроорганизмов через 1 сут после электронно-лучевой обработки пучком ускоренных электронов в режимах 5—100 кГр: дрожжей S. cerevisiae в суспензии (а) и на образцах гидрогеля (б); бактерий E. coli в суспензии (в) и на образцах гидрогеля (г). Контроль — режим обработки 0кГр. *Достоверное отличие от контроля (p <0,05)
Fig. 2. Evaluation of inhibition/suppression of the microorganisms division 1 day after electron beam treatment with accelerated electrons in modes 5—100 kGy: of yeasts S. cerevisiae in suspension (а) and on hydrogel samples (б), as well as E. coli bacteria in suspension (в) and on hydrogel samples (г). Control — processing mode 0kGy. *Differences from the control are significant (p <0.05)
б
а
0
0
в
г
0
0
опосредованного их способностью к делению, через 1 сут после обработки пучком ускоренных электронов (рис. 2).
Представленные данные показывают, что обработка пучком ускоренных электронов во всех использованных режимах приводила к достоверному угнетению жизнеспособности микроорганизмов. При использовании режимов 25, 50 и 100 кГр стерилизующий эффект достигал 99 %.
ИК-Фурье-спектроскопия образцов ГГ при облучении пучком ускоренных электронов. Приведенные выше результаты позволили выявить эффективные режимы обработки ГГ для его стерилизации. Однако данный подход представляет интерес для практического использования только в том случае, если результатом воздействия на ГГ не становится изменение его физических свойств, влияющих на эксплуатационные характеристики материала. В связи с этим в специальной серии экспериментов было исследовано влияние электронно-лучевой обработки в режимах в диапазоне от 25 до 50 кГр: изучено изменение химических связей в образцах с помощью ИК-Фурье-спектроскопии методом нарушенного полного внутреннего отражения.
Полученные данные свидетельствуют о том, что применение режимов обработки 25 кГр и менее не из-
меняло структуру ГГ (рис. 3). Однако после стерилизации исследуемых образцов в режиме 35 кГр наблюдали снижение интенсивности пиков в диапазоне от 1500 до 1000 см-1, которые почти полностью исчезали после обработки 50 кГр, что свидетельствует о разрушении структуры ГГ.
На основании анализа полученных результатов был сделан вывод, что наиболее предпочтительным режимом для стерилизации ГГ методом электронно-лучевой обработки пучком ускоренных электронов является 25 кГр.
Биосовместимость гидрогелей. Представленные выше результаты позволили определить эффективный режим стерилизации ГГ пучком электронов, не приводящий к достоверным изменениям его свойств. Это обеспечило возможность использования ГГ данного типа в медицинских целях при условии его биосовместимости. Примером такой цели может быть получение объемного скаффолда, предназначенного для локального внесения клеток, колонизировавших его ex vivo. Для оценки перспективности применения тестируемого ГГ в качестве объемного скаффолда для целевой имплантации клеток мы исследовали индукцию гемолиза изучаемыми образцами ГГ, а также цитотоксичность в отношении лейкоцитов крови после 2 и 24 ч инкубации. С этой целью
78 Оригинальные статьи | Original reports
100
80
60
о :р с
4000 3500 3000 2500 2000 1500
Волновое число, см - 1 / Wavenumber, cm- '
1000
Валентное колебание
С-О-С / C-O-C-stretch
500
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 Волновое число, см - 1 / Wavenumber, cm-'
Рис. 3. Инфракрасный спектр образцов гидрогеля до (а) и после (б) электронно-лучевой обработки пучком ускоренных электронов Fig. 3. Infrared spectrum of hydrogel samples before (а) and after (б) electron beam processing with an accelerated electron beam
ГГ обрабатывали пучком электронов в режиме 25 кГр. Результаты проведенных экспериментов представлены на рис. 4.
Полученные данные показали отсутствие достоверного воздействия ГГ на выживаемость клеток и гемолиз (при сравнительном межгрупповом анализе р <0,05). Следовательно, изучаемый ГГ после стерилизации в режиме 25 кГр соответствует критериям биосовместимости. Таким образом, полученные результаты подтверждают возможность использования ГГ после обработки предлагаемым способом в качестве платформы, или скаффолда, для заселения клетками.
3D-культивирование ММСК в ГГ. ММСК получали из аспирата костного мозга собак. Полученные после культивирования клетки характеризовались следующим фенотипом: СD34- СШ5- CD105Ыgll+CD90и«ll+-CDПchigll+CDПb+CD95low+ (что позволило идентифицировать их как ММСК). ММСК заселяли в образцы ГГ (модель пространственного скаффолда для 3D-куль-тивирования), а также на дно лунок планшета (модель 2D-культивирования) и оценивали их пролифератив-ную активность, а также фенотип через 12 сут инкубации.
Рис. 5 демонстрирует, что в условиях 3D-культи-вирования образуются циркулярные структуры, формирующие в толще гидрогеля капилляроподобную сеть.
Для изучения пролиферативной активности ММСК в ГГ была оценена экспрессия внутриклеточ-
25
20
15
10
Цитотокси
чность / Cytotoxicity
Гидрогель / Hydrogel Контроль / Control
Гемолиз / Hemolysis
È.1.. Л
24 2
Время, ч / Time, hours
24
Рис. 4. Сравнительный анализ цитотоксичности и гемолиза, индуцированных гидрогелем, в сравнении с контролем (инкубация клеток при отсутствии гидрогеля в аналогичных условиях) Fig. 4. Comparative analysis of cytotoxicity and hemolysis induced by hydrogel compared with the control (incubation of cells in the absence of hydrogel under similar conditions)
ного белка Ю-67. Установлено, что инкубация в ги-дрогелевом скаффолде достоверно не влияла на количество Ю-67+-клеток (22 ± 3,5 % при 2D-культи-вировании и 27 ± 1,7 % при 3D-культивировании в ГГ). Изучение фенотипа ММСК в различных моделях культивирования также не позволило выявить угнетающего воздействия ГГ на экспрессию клетками молекул адгезии в условиях 3D-культивирования (см. таблицу).
б
а
5
0
2
Экспрессия мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками (ММСК) молекул адгезии и маркеров пролиферации после инкубации в гидрогеле
Mesenchymal multipotent stromal cells (MMSC) expression of adhesion molecules and proliferation markers after incubation in hydrogel
Модель культивирования Образцы ММСК
MMSC samples
Cultivation mode
CD11c CD11b CD62
В гидрогеле после облучения (3D-KynKraB^OBarne), % In the hydrogel after irradiation (3D cultivation), % 83 ± 4,6 92 ± 1,5 76 ± 2,3
Контроль (2Б-культивиро-вание), % Control (2D cultivation), % 81 ± 4,1 95 ± 2,6 77 ± 4,4
P 0,376 0,248 0,414
Заключение
Полученные результаты позволяют прийти к заключению, что обработка пучком ускоренных электронов обладает бактерицидной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий использованных модельных штаммов. В частности, было установлено, что обработка пучком ускоренных электронов предотвращала деление клеток и снижала жизнеспособность бактериальной культуры на 95—100 % как в суспензии, так и при контаминации образцов ГГ.
Воздействие пучка ускоренных электронов обладало более слабым эффектом в отношении одноклеточных дрожжевых грибов вида cerevisiae. Так, было обнаружено, что только самые жесткие режимы обработки — 50 и 100 кГр — способствуют достоверной гибели клеток. Однако обработка пучком ускоренных электронов на всех режимах повреждает клеточные структуры, предотвращая возможность пролиферации микроорганизмов, что проявляется подавлением роста и последующей гибелью микробной культуры. Учитывая вышеизложенное, можно констатировать, что экспериментальный метод обработки способствовал деконтаминации ГГ от бактерий на всех режимах, тогда как его применение даже в самых жестких дозах гарантировало только частичное снижение количества живых дрожжевых клеток к концу обработки. Однако повреждения дрожжевых клеток, вероятно,
Рис. 5. Структурирование культуры мезенхимальных мультипо-тентных стромальных клеток в модели пространственного скаф-фолда для SD-культивирования на 12-е сутки инкубации. Окраска гематоксилином и эозином, х 400
Fig. 5. Structuring of mesenchymal multipotent stromal cells culture in a spatial scaffold modelfor 3D cultivation on the 12th day of incubation. Hematoxylin and eosin staining, х 400
были настолько значительны, что это приводило к подавлению клеточного деления и в конечном счете к отсроченной гибели дрожжевой культуры. Таким образом, обработка пучком ускоренных электронов на всех испытанных режимах ингибировала колоние-образование как бактерий, так и дрожжей, т. е. демонстрировала бактериостатический и фунгиостатиче-ский эффект.
Проведенные исследования показали, что предложенный режим обработки ГГ пучком ускоренных электронов в дозе 25 кГр оказывает микробицидное воздействие, не вызывая разрушающего воздействия на структуру ГГ, не влияя на пролиферативный потенциал и способность формировать капилляропо-добные структуры ММСК. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, показавших, что оптимальным стерилизующим режимом для гидрогелей является облучение электронным пучком (в пределах 25—100 кГр). Следовательно, обработка в указанном режиме может применяться для стерилизации ГГ с целью их использования для разработки новых продуктов медицинского назначения, в том числе скаффолдов, колонизированных клеточными культурами, что принципиально важно для обеспечения васкуляризации биоинженерной конструкции после имплантации в ткани организма.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Li Z., Chen Z., Chen H. et al. Polyphenol-based hydrogels: pyramid evolution from crosslinked structures to biomedical applications and the reverse design. Bioact Mater 2022;17:49-70. DOI: 10.1016/j.bioactmat.2022.01.038
2. Santamaria G., Brandi E., Vitola P. et al. Intranasal delivery of mesenchymal stem cell secretome repairs the
brain of Alzheimer's mice. Cell Death Differ 2021;28(1):203-18. DOI: 10.1038/s41418-020-0592-2
3. Sultan M.T., Choi B.Y., Ajiteru O. et al. Reinforced-hydrogel encapsulated hMSCs towards brain injury treatment by trans-septal approach. Biomaterials 2021;266:120413. DOI: 10.1016/ j.biomaterials.2020.120413
4. Kiselevskii M.V., Vlasenko R.Y., Stepanyan N.G. et al. Secretome of mesenchymal bone marrow stem cells: is it immunosuppressive or proinflammatory? Bull Exp Biol Med 2021;172(2):250-3. DOI: 10.1007/s10517-021-05371-5
5. Kiselevskiy M., Vlasenko R., Reshetnikova V. et al. Potential use of mesenchymal multipotent cells for hemopoietic stem cell transplantation: pro and contra. J Pediatr Hematol Oncol 2021;43(3):90-4. DOI: 10.1097/MPH.0000000000002065
6. Kakudo N., Morimoto N., Ma Y., Kusumoto K. Differences between the proliferative effects of human platelet lysate and fetal bovine serum on human adipose-derived stem cells. Cells 2019;8(10):1218. DOI: 10.3390/cells8101218
7. Kirsch M., Rach J., Handke W. et al. Comparative analysis
of mesenchymal stem cell cultivation in fetal calf serum, human serum, and platelet lysate in 2D and 3D systems. Front Bioeng Biotechnol 2021;8:598389. DOI: 10.3389/fbioe.2020.598389
8. Shanbhag S., Rashad A., Nymark E.H. et al. Spheroid coculture of human gingiva-derived progenitor cells with endothelial cells in modified platelet lysate hydrogel. Front Bioeng Biotechnol 2021;9:739225. DOI: 10.3389/fbioe.2021.739225
9. Chahal A.S., Gomez-Florit M., Domingues R.M.A. et al. Human platelet lysate-loaded poly(ethylene glycol) hydrogel induce stem cell chemotaxis in vitro. Biomacromolecules 2021;22(8):3486-96. DOI: 10.1021/acs.biomac.1c00573
10. Ясюкевич А.С., Загородный Г.М., Потапнев М.П. и др. Показания, безопасность, результаты клинического использования аутологичной плазмы, обогащенной растворимыми факторами тромбоцитов, и дальнейшие перспективы ее изучения. Прикладная спортивная наука 2021;1(13):100-9.
Yasyukevich A.S., Zagorodny G.M., Potapnev M.P. et al. Indications, safety, results of clinical use of autologous plasma enriched with soluble platelet factors, and further prospects for its study. Prikladnaya sportivnaya nauka = Applied sports science 2021;1(13):100-9. (In Russ.).
11. Gallego M., Lopez C., Carmona J.U. Carmon Evaluation
of the pro-, anti-inflammatory, and anabolic effects of autologous platelet-rich gel supernatants in an in vitro coculture system of canine osteoarthritis. Vet Med Int 2022;2022:3377680. DOI: 10.1155/2022/3377680
12. Lei T., Liu Y., Deng S. et al. Hydrogel supplemented with human platelet lysate enhances multi-lineage differentiation
of mesenchymal stem cells. J Nanobiotechnology 2022;20(1):176. DOI: 10.1186/s12951-022-01387-9
13. Senatov F., Anisimova N., Kiselevskiy M. et al. Polyhydroxybutyrate/hydroxyapatite highly porous scaffold
for small bone defects replacement in the nonload-bearing parts. J Bionic Eng 2017;14(4): 648-58. DOI: 10.1016/S1672-6529(16)60431-6
14. Galante R., Pinto T.J.A., Colaço R., Serro A.P. Sterilization of hydrogels for biomedical applications: a review. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2018;106(6):2472-92.
DOI: 10.1002/jbm.b.34048
15. Sedlacek O., Kucka J., Monnery B.D. et al. The effect of ionizing radiation on biocompatible polymers: from sterilization
to radiolysis and hydrogel formation. Polym Degrad Stab 2017;137:1-10. DOI: 10.1016/j.polymdegradstab.2017.01.005
16. Zhang K., Wang Y., Wei Q. et al. Design and fabrication of sodium alginate/carboxymethyl cellulose sodium blend hydrogel for artificial skin. Gels 2021;7(3):115. DOI: 10.3390/gels7030115
17. Osidak E.O., Karalkin P.A., Osidak M.S. et al. Viscoll collagen solution as a novel bioink for direct 3D bioprinting. J Mater Sci Mater Med 2019;30(3):31. DOI: 10.1007/s10856-019-6233-y
18. Pavlov Yu.S., Bystrov P.A. Software and hardware complex for radiation processing facility control. Radiat Phys Chem 2022;196:110110. DOI: 10.1016/j.radphyschem.2022.110110
19. Choudhary R., Venkatraman S.K., Bulygina I. et al. Biomineralization, dissolution and cellular studies of silicate bioceramics prepared from eggshell and rice husk. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2021;118:111456. DOI: 10.1016/j.msec.2020. 111456
Вклад авторов
П.А. Быстров: отработка методики и проведение электронно-лучевой обработки гидрогелей, написание и редактирование текста статьи;
К.М. Новрузов: проведение исследований для получения данных, статистический анализ данных, написание и редактирование текста статьи;
М.П. Потапнев: разработка дизайна экспериментов по изучению биоактивных свойств гидрогеля;
С.М. Космачева: обзор публикаций по теме статьи, анализ данных о колонизации гидрогеля мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками;
Н.Ю. Анисимова: проведение исследований для получения данных, интерпретация полученных результатов, написание и редактирование текста статьи;
М.В. Киселевский: обзор публикаций по теме статьи, разработка дизайна исследований биологических свойств гидрогеля;
П.С. Мышелова, И.Н. Булыгина, Ф.С. Сенатов: характеристика гидрогеля и исследование его физических свойств методом ИК-Фурье.
Author's contribution
P.A. Bystrov: development of the methodology for electron beam processing of hydrogels, article writing and editing; K.M. Novruzov: conducting research to obtain data, statistical analysis of data, article writing and editing; M.P. Potapnev: development of the design of experiments to study the bioactive properties of the hydrogel;
S.M. Kosmacheva: review of publications on the topic of the article, analysis of data on the colonization of the hydrogel by mesenchymal multipotent stromal cells;
N.Yu. Anisimova: conducting research to obtain data, interpreting the results, article writing and editing;
M.V. Kiselevskiy: review of publications on the topic of the article, development of the design of studies of the biological properties of the hydrogel; P.S. Myshelova, I.N. Bulygina, F.S. Senatov: characterization of the hydrogel and the study of its physical properties by the IR-Fourier method.
ORCID авторов / ORCID of authors
П.А. Быстров / P.A. Bystrov: https://orcid.org/0000-0001-8453-5739 K.M. Новрузов / K.M. Novruzov: https://orcid.org/0000-0002-0773-255X М.П. Потапнев / M.P. Potapnev: https://orcid.org/0000-0001-7705-9383 Н.Ю. Анисимова / N.Yu. Anisimova: https://orcid.org/0000-0002-4370-6578 М.В. Киселевский / M.V. Kiselevskiy: https://orcid.org/0000-0002-0132-167X Ф.С. Сенатов / F.S. Senatov: https://orcid.org/0000-0003-3907-5344
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках программы стратегического академического лидерства «Приоритет 2030».
Funding. The study was funded by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation under the strategic academic leadership program "Priority 2030".
Статья поступила: 13.04.2022. Принята к публикации: 31.08.2022. Article submitted: 13.04.2022. Accepted for publication: 31.08.2022.
