CC BY
61
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
DOI: 10.23868/201805006
эффективность сочетанного использования плдзмидных конструкций, содержащих гены HGF и АнгиопоЭтинА-1, для восстановления кровотока в ишемизированных тканях
К.А. Рубина1, Е.В. Семина12, Д.Т. Дыйканов1, М.А. Болдырева2, П.И. Макаревич23, Ж.А. Акопян13, Е.В. Парфенова12, В.А. Ткачук1-3
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии, Москва, Россия
3 Институт регенеративной медицины медицинского научно-образовательного центра Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
Efficacy of combined use of plasmid constructs containing HGF and angiopoietin-1 genes to restore blood flow in ischemic tissues
K.A. Rubina1, E.V. Semina12, D.T. Diykanov1, M.A. Boldyreva2, P.I. Makarevich23, Y.V. Parfyonova12, Zh.A. Akopyan13, V.A. Tkachuk1-3
1 M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia
2 Russian Cardiology Research and Production Complex, Moscow, Russia
3 Institute of Regenerative Medicine, Medical Research and Education Centre, M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia
e-mail: [email protected]
В мире активно ведутся исследования, направленные на разработку методов и подходов для лечения ишемических заболеваний, в основе которых лежит стимуляция роста и ремо-делирования кровеносных сосудов. Эта стратегия была названа терапевтическим ангиогенезом.
Цель настоящей работы — на моделях in vitro, ex vivo и in vivo оценить специфическую биологическую активность и ангиоген-ный потенциал исследуемого вещества Васкопоэтина, содержащего плазмиды для экспрессии HGF и ангиопоэтина-1.
В модельных экспериментах in vitro и ex vivo было показано, что Васкопоэтин оказывает стимулирующее действие на миграцию, пролиферацию и формирование капилляроподобных структур сосудистыми клетками. In vivo на модели ишемии задней конечности у мышей введение Васкопоэтина обеспечивало стабильный синтез белков HGF и ангиопоэтина-1, что приводило к активации ангиогенеза и стабилизации вновь сформированных сосудов в ишемизированной мышце. Кроме того, при введении Васкопоэтина было обнаружено восстановление кровотока в ишемизированной конечности, уменьшение размеров некроза и снижение частоты ампутаций.
На основании полученных данных можно сделать вывод о наличии у Васкопоэтина ангиогенной активности, что позволяет рассматривать его как перспективное средство для терапевтического ангиогенеза.
ключевые слова: фактор роста гепатоцитов, ангиопоэтин-1, Васкопоэтин, генная терапия, ангиогенез, лечение ишемии.
введение
Заболевания, вызываемые ишемией миокарда, головного мозга и нижних конечностей относятся к наиболее значимым причинам инвалидизации и смертности населения России. Существующие хирургические методы лечения применимы не для всех больных, а консервативные методы неэффективны у тяжело больных. В этой связи, помимо медикаментозной терапии, методов эндоваскулярной и хирургической реваскуляризации активно ведутся разработки инновационных технологий для решения данной проблемы. В их основе лежит понимание фундаментальных механизмов индукции роста новых кровеносных сосудов и их стабилизации для обеспечения восстановления кровоснабжения в ишемизированных тканях. Терапевтический ангиогенез представляет собой одну из стратегий в лечении ишемических заболеваний,
New methods to stimulate blood supply of the ischemic organs and tissues are being intensively developed worldwide. These approaches are based on revascularization and remodeling of the newly formed blood vessels. This strategy was called therapeutic angiogenesis.
Using in vitro, ex vivo and in vivo models we investigated the specific biological activity and angiogenic potential of Vascopoietin, which contained the plasmids for HGF and angiopoietin-1 expression. Vascopoietin stimulated vascular cell migration, proliferation and the formation of capillary-like structures in vitro and ex vivo. Using in vivo model of posterior limb ischemia in mice we demonstrated that Vascopoietin administration mediated stable HGF and angiopoietin-1 production resulting in new blood vessel formation and their stabilization in the ischemic muscles. In addition, Vascopoietin injection led to the restoration of the blood flow, decrease in the size of necrosis in ischemic limb and the reduction in the amputation frequency.
The current data suggest Vascopoietin a promising drug for therapeutic angiogenesis.
Keywords: hepatocyte growth factor, angiopoietin-1, Vascopoietin, gene therapy, angiogenesis, ischemia treatment.
которая направлена на стимуляцию роста и ремоде-лирования кровеносных сосудов. Формирование новых функциональных сосудов достигается с помощью введения рекомбинантных ангиогенных факторов, их генов или прогениторных клеток, способных продуцировать ангиогенные факторы и факторы роста или дифференцироваться в клетки сосудов [1].
среди наиболее изученных индукторов ангиогене-за — фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), фактор роста гепатоцитов (HGF) [2, 3]. Созревание сосудов и их стабилизация происходят за счёт взаимодействия эндо-телиальных клеток растущего сосуда с перицитами или гладкомышечными клетками и за счет продукции муральными клетками ангиопоэтина-1 (Ang-1), фактора роста тромбоцитов (PDGF-B) и трансформирующего фактора роста (TGF-p) [2, 3].
Было показано, что введение рекомбинантных белковых факторов в зону ишемии стимулирует процессы регенерации [1], однако, использование генетических конструкций оказывается более эффективно, поскольку обеспечивает продолжительную экспрессию трансгена в ткани-мишени [2, 4, 5].
Действующим началом исследуемого вещества, прошедшего доклинические токсикологические исследования (зарегистрированный товарный знак Васкопоэтин, номер регистрации 2014743133) является смесь плаз-мид, несущих гены фактора роста гепатоцитов HGF и Ang-1. HGF — это гликопротеин, исходно идентифицированный как митоген для гепатоцитов, участвующий в регенерации печени. Известно, что HGF стимулирует пролиферацию и миграцию не только эпителиальных клеток (эпидермис, почки, легкие), но и клеток эндотелия. Кроме этого, HGF является антиапоптотическим фактором [6]. В органах и тканях HGF секретируется мультипотентными мезенхи-мальными стромальными клетками (ММСК), клетками эндотелия и рядом клеток иммунной системы. Он действует как мультифункциональный цитокин, облегчая миграцию и стимулируя пролиферацию, что делает его одним из центральных факторов роста, регулирующих процессы ангио-генеза, роста нервов и регенерации тканей [7]. Эффекты HGF реализуются через его взаимодействие с рецептором c-Met, который синтезируется многими типами клеток и представляет собой тирозинкиназный рецептор, обеспечивающий активацию целого ряда сигнальных каскадов в клетке-мишени [8, 9]. Результаты клинических исследований эффективности и безопасности (I фаза) плазмид с геном HGF для терапии ишемии конечностей проводились R. Morishita и соавт. (2004), и полученные данные легли в основу II-III фаз клинических исследований [6]. Другой фактор — Ang-1 продуцируется перицитами и гладкомышечными клетками, и также оказывает стимулирующее действие на ангиогенез, но механизм его действия заключается в стабилизации вновь образованных сосудов. Кроме того, Ang-1 уменьшает проницаемость сосудов и обладает противовоспалительной активностью. По данным литературы, присутствие ангиогенных факторов роста в течение двух недель оказывается достаточно для активации ангиогенеза и стабилизации вновь сформированных сосудов в ишемизированной мышце [9].
Целью настоящего исследования было проведение углубленного изучения специфической активности и ангиогенного потенциала Васкопоэтина, содержащего плазмиды для экспрессии HGF и Ang-1, на моделях in vitro, ex vivo и in vivo.
Материал и методы
Получение исследуемого вещества
Исследуемое вещество (далее Васкопоэтин) представляет собой смесь в равных весовых пропорциях двух плазмидных ДНК pH-CMV1, содержащих гены HGF (pH-CMV1-HGF) и Ang-1 (pH-CMV1-Ang-1), с суммарной концентрацией 1 мг/мл в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия. Наработка и очистка плазмид осуществлялась в стерильных условиях с помощью набора «EndoFree Plasmid Giga Kit» (Qiagen).
Дизайн исследования
Работы по изучению биологической активности и ангиогенного потенциала Васкопоэтина проводили на трёх уровнях: in vitro, ex vivo и in vivo. В экспериментах in vitro была проведена оценка продукции белков HGF и Ang-1 в кондиционированной среде, полученной после культивирования клеток НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином, влияние этой среды на пролиферацию эндотелиальных клеток
пуповины человека (HUVEC), миграцию клеток HUVEC и ММСК человека, а также на формирование клетками HUVEC капилляроподобных структур. В экспериментах ex vivo была проведена оценка влияния кондиционированной среды, полученной после культивирования клеток НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином, на миграцию сосудистых клеток из экспланта аорты мыши. В экспериментах in vivo была проанализирована длительность экспрессии белков HGF и Ang-1 в мышце у мышей после введения Васкопоэтина, а также динамика восстановления кровотока в ишемизированной конечности с использованием методов допплерографии и гистологического анализа. Оценивали частоту ампутаций и размер некроза.
Экспериментальные животные
В экспериментах использовали мышей-самцов линии C57/B6 (n=75) и линии BALB/c (n=12) в возрасте 8-10 недель (питомник ФИБХ, Пущино, Россия). Манипуляции с животными были одобрены этическим комитетом в соответствии с внутренними требованиями Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦК» Минздрава РФ (Номер протокола 385.06.2009 от 06.2009 г.). Перед операцией мышей наркотизировали интраперитонеальной инъекцией авер-тина (300 мкл 2,5 % раствора). Эвтаназию мышей осуществляли дислокацией шейных позвонков предварительно наркотизированных мышей.
Определение концентрации HGF и Ang-1 в кондиционированной среде от трансфицированных клеток НЕК293 методом иммуноферментного анализа
Клетки НЕК293 (клеточная линия, полученная из эмбриональных почек человека, ATCC® CRL-1573™, США) культивировали при стандартных условиях в среде DMEM с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС, реактивы фирмы HyClone, США). Затем клетки транс-фицировали Васкопоэтином или контрольной плазми-дой pH-CMV1 с помощью реагента Lipofectamine2000™ (Invitrogen, США). Через 48-72 ч. после трансфекции в кондиционированных средах определяли концентрацию HGF и Ang-1 методом ИФА с использованием соответствующих коммерческих наборов серии Quantikine (R&D Systems, США) в соответствии с рекомендациями производителя; при необходимости образцы среды разводили для соблюдения диапазона линейности, предусмотренного набором для иммуноферментного анализа (ИФА).
Культивирование ММСК и эндотелиальных клеток пуповины человека
ММСК, выделенные из подкожной жировой клетчатки человека и эндотелиальные клетки пуповины человека (HUVEC) были получены из национального банка-депозитария живых систем, созданного в рамках научной программы «Научные основы создания национального банка-депозитария живых систем» (соглашение РНФ № 14-50-00029). ММСК культивировали в чашках Петри в среде, поддерживающей рост недифференцированных ММСК АdvanceSTEM с добавлением 10 % Advance Stem Cell Growth Supplement (Thermo Scientific, США), эндотелиальные клетки HUVEC культивировали в чашках Петри, покрытых желатином, в среде EGM-2 с 10 % ФБС (Lonza, Швейцария).
Оценка пролиферации клеток HUVEC
Для оценки пролиферации клеток HUVEC использовался MTT-тест в соответствии со стандартным протоколом. На 2 пассаже клетки HUVEC высаживали в пять
96-луночных планшетов (в количестве 8х103 клеток на лунку) и культивировали в течение 24 ч. до формирования клетками 50 % монослоя. Планшет № 1 использовали для построения калибровочного графика. Через 24 ч. среду культивирования EGM-2 с 10 % ФБС заменяли на другие среды: в планшете № 2 (отрицательный контроль) на среду EGM-2 с 5,5 % ФБС; в планшете № 3 на кондиционированную среду от трансфицирован-ных клеток НЕК293 контрольной плазмидой pH-CMV1; в планшете № 4 на кондиционированную среду от транс-фицированных клеток НЕК293 Васкопоэтином (конечная концентрация HGF при этом составляла 50 нг/мл); в планшете № 5 на среду EGM-2 с 10 % ФБС (положительный контроль). Пролиферацию оценивали по изменению оптической плотности раствора, коррелирующей с количеством клеток, с помощью калибровочного графика; среднее время удвоения популяции Td рассчитывали по формуле Td=(log22)*t/[log2(Nt/N0)], где t — время прироста популяции, Nt — количество клеток через время t, N0 — исходное количество клеток [10].
Оценка миграции клеток HUVEC и ММСК
Перед началом эксперимента ММСК и HUVEC депри-вировали в бессывороточной среде в течение 18 ч. в день эксперимента в камеры 24-луночной системы Transwell® вносили раствор коллагена I типа (ИМТЕК, Россия) в концентрации 100 мкг/мл (в верхние камеры — по 200 мкл, в нижние—по 700 мкл) и инкубировали при +37 °С 60 мин. Депривированные клетки снимали с чашек Петри раствором версена и осаждали центрифугированием при 200 g в течение 10 мин. Полученный осадок ресуспен-дировали в бессывороточной среде DMEM, содержащей 0,25 % БСА. Концентрацию клеток доводили до 6х105/ мл. В верхние камеры Трансвелл® вносили по 200 мкл клеточной суспензии, в нижние — 700 мкл среды для культивирования клеток ММСК или HUVEC, в которую добавляли разные варианты сред: кондиционированную среду от клеток НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином; кондиционированную среду от клеток НЕК293, трансфицированных контрольной плазмидой pH-CMV1); среду DmeM с 10 % ФБС (положительный контроль). Образцы (20 лунок для каждой точки) помещали в СО2-инкубатор на 17 ч. Мигрировавшие клетки окрашивали красителем Diff-Quick согласно инструкции производителя. Миграцию клеток анализировали с помощью световой микроскопии Axiovert 200M (Zeiss, Германия) в 6 случайно выбранных полях зрения для каждого образца.
Оценка формирования клетками HUVEC
капилляроподобных структур на Матригеле
В качестве модели ангиогенеза in vitro использовали стандартную методику формирования трубочек на Матригеле, известную как «tube assay». На покрытый Матригелем 48-луночный планшет высаживали суспензию клеток HUVEC 2 пассажа, ресуспендиро-ванных в разных средах, в конечной концентрации 2х105кл/мл: в кондиционированной среде от клеток нЕК293, трансфицированных контрольной плазми-дой pH-CMV1; в кондиционированной среде от клеток нЕК293, трансфицированных Васкопоэтином (конечная концентрация hGf 50 нг/мл); в среде EGM-2, содержащей 5 % ФБС. на каждую экспериментальную точку анализировали 12 лунок; эксперимент повторяли 3 раза с использованием трёх культур клеток HUVEC, полученных от разных доноров. Фотографирование образовавшихся капилляроподобных структур в 6 случайно выбранных полях зрения в каждой лунке осуществляли через 3 и 6 ч. после нанесения клеток на Матригель.
Оценка миграции сосудистых клеток из эксплантов аорты мыши в Матригеле ex vivo
Выделение брюшной аорты мышей линии C57/Black проводили по методу, описанному ранее [11]. Выделенную брюшную аорту мыши помещали в лунки 8 луночных планшетов (Nunc™ Lab-Tek™ Chambered Coverglass, Thermo Scientific, США) и наносили 60 мкл Матригеля, в который предварительно в зависимости от условий эксперимента добавляли одну из субстанций: кондиционированную среду от клеток НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином, или контрольной плазмидой pH-CMV1, или рекомбинант-ный VEGF (20 нг/мл, положительный контроль). После полимеризации Матригеля в лунки вносили среду EGM-2 с 10 % ФБС. Миграцию сосудистых клеток из экспланта оценивали на 7 и 14 сут. с использованием световой тем-нопольной микроскопии при увеличении в 50 раз. На каждую экспериментальную точку брали 3 образца аорты от трёх мышей; эксперимент повторяли три раза.
Определение концентрации факторов HGF и Ang-1 в эксплантах скелетных мышц методом ИФА
Здоровым животным в m. tibialis anterior вводили 100 мкг Васкопоэтина в 100 мкл 0,9 % NaCl (n=15). В группе отрицательного контроля в m. tibialis anterior вводили контрольную плазмиду pH-CMV1 в количестве 100 мкг в 100 мкл 0,9 % NaCl (n=15). Для повышения эффективности трансфекции использовали метод низковольтовой электропорации по ранее отработанному протоколу [12]. Образцы мышц m. tibialis anterior выделяли на 3 и 14 и 21 сут. после введения плазмид. После эвтаназии животного мышцу выделяли и отмывали в буфере Хэнкса, далее образец помещали в ступку, предварительно охлажденную в жидком азоте, дальнейшее выделение белка и очистку гомогената проводили по ранее разработанному методу [12]. Полученный белковый экстракт использовали для количественного определения концентрации HGF и Ang-1 методом ИФА с помощью наборов серии Quantikine (R&D Systems, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Полученные данные по содержанию HGF и Ang-1 нормировали на концентрацию общего белка в гомогенате, измеренную методом Брэдфорда.
Оценка восстановления кровотока на модели ишемии задней конечности in vivo методом лазерной допплерографии
В работе использовали модель ишемии задней конечности у мышей линии С57, описанную ранее [13]. Сразу после индукции ишемии животным вводили 100 мкг Васкопоэтина в 100 мкл 0,9 % NaCl в m. tibialis anterior (группа Васкопоэтин, n=25). В группе отрицательного контроля мышам (контрольная группа, n=25) вводили 100 мкг контрольной плазмиды pH-CMV1 в 100 мкл 0,9 % NaCl. Для повышения эффективности трансфек-ции использовали метод низковольтовой электропора-ции по ранее отработанному протоколу [12].
Для оценки восстановления подкожного кровотока на подошвенной поверхности задних лап применяли лазерный допплеровский сканер (Laser Doppler Imaging System, Moor, Англия) по методу, описанному ранее [14].
Иммунофлуоресцентная визуализация сосудов на препаратах скелетных мышц
Из образцов мышц m. tibialis anterior 5 животных из каждой группы, делали криосрезы толщиной 7 мкм, фиксировали в ацетоне 1 5 мин., и для визуализации CD31 и а-гладкомышечного актина (а-ГМА) использовали иммунофлуоресцентный метод, описанный ранее [14]. Для каждого среза получали серию изображений
с 4 случайных полей зрения, на которых проводили подсчёт количества CD31 + и а-ГМА+ структур с последующей статистической обработкой данных.
Гистологическая оценка размера некроза ткани
Криосрезы мышц, полученные от 5 животных из каждой группы, фиксировали в течение 15 мин. в 4 % растворе формальдегида, промывали и затем окрашивали гематоксилином и эозином стандартным способом. Окрашенные срезы заключали в среду Cytoseal-60 (Richard-Allen Scientific, США). Анализ образцов осуществляли при помощи инвертированного микроскопа Axiovert 200M с цифровой видеокамерой Axiocam HRC и программой Axiovision 3.1 (Zeiss, Германия). С каждого среза получали изображения в 4 случайных полях зрения. с помощью программы MetaMorph 7.1.0.0 (Universal Imaging Corporation, США) для каждого изображения оценивали площадь некроза, которую нормировали на площадь поля зрения. Признаками некроза считали нарушение нормальной морфологии волокон, кариолизис, инфильтрацию клетками воспаления или замещение мышц рубцовой тканью.
Оценка частоты некрозов
Для оценки частоты некрозов и ампутаций ишеми-зированной конечности нами были проведены предварительные эксперименты для выбора линии мышей, наиболее пригодных для этих экспериментов. Было обнаружено, что у мышей линии C57/Black, несмотря на развитие некрозов мышц, достаточно хорошо развита система коллатеральных сосудов, и практически не наблюдаются высокие ампутации конечностей. Поэтому использование таких мышей в данных экспериментах было нецелесообразно. нами были использованы мыши-самцы линии BALB-c (n=12) основным отличием которых от мышей C57/Black является незначительное развитие коллатерального кровотока и крайне тяжелая степень ишемии, возникающая после использованной операции. При проведении операции a. femoralis лигировали и пересекали на границе средней и нижней трети бедра с сохранением n. ischiadicus. После этого животным в m. biceps femoris однократно вводили 100 мкл раствора 0,9 % NaCl, содержащего 100 мкг Васкопоэтина (группа Васкопоэтин, n=6) или 100 мкг контрольной плазмиды pH-CMV1 (контрольная группа, n=6). На 7 сут. проводили оценку протяженности некроза конечности (в сантиметрах) и оценивали общее состояние конечности. Встречаемость патологических изменений приводили в виде частоты/процентов.
Влияние кондиционированной среды от клеток НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином, на миграцию клеток Н^ЕС и ММСК
На рис. 1 представлены результаты мигрирования клеток ММСК на вставке Трансвелл, полученные при изучении влияния кондиционированной среды от клеток НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином или
Статистическая обработка данных
Данные представлены в виде значений среднего ± стандартное отклонение (СО). Нормальность распределений проверялась с помощью критериев Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова. Статистическая оценка различий показателей перфузии проводилась по U-критерию Манна-Уитни. Сравнение количества капилляров проводили с помощью t-критерия Стьюдента, плотности ГМА-положительных структур — с помощью U-критерия Манна-Уитни. для статистической оценки различий частоты встречаемости некрозов использовали критерий X2. Значимыми принимались отличия при р<0,05.
Результаты
Содержание факторов HGF и Ang-1 в среде клеток
НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином
Содержание факторов в кондиционированной среде от клеток НЕК293 после трансфекции контрольной плаз-мидой pH-CMV1 было ниже порогового уровня определения, а при трансфекции Васкопоэтином концентрации HGF и Ang-1 в среде возрастали: до 0,207 мкг/мл для HGF и 0,9 мкг/мл для Ang-1. Эти данные свидетельствуют о том, что плазмиды pH-CMV1-HGF и pH-CMV1-Ang-1, входящие в состав васкопоэтина, функционально активны и при трансфекции клеток человека in vitro обеспечивают эффективную продукцию соответствующих факторов роста. во всех последующих экспериментах использовали кондиционированную среду от клеток НЕК293 после трансфекции Васкопоэтином или контрольной плазмидой pH-CMV1.
Влияние кондиционированной среды клеток
НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином,
на пролиферацию клеток HUVEC
наиболее распространенной моделью для изучения ангиогенной активности тестируемых препаратов in vitro является анализ их влияния на пролиферацию эндотелиальных клеток. Было обнаружено, что кондиционированная среда от клеток нЕК293, после транс-фекции их Васкопоэтином, в 1,5 раза уменьшает время удвоения популяции HUVEC, даже по сравнению с положительным контролем. В группе отрицательного контроля пролиферация клеток HUVEC в течение 24 ч. отсутствовала, что может объясняться либо низким содержанием факторов роста, регулирующих пролиферацию клеток, либо тем, что выбранный интервал (24 ч.) недостаточен для удвоения клеток HUVEC при таком сниженном содержании сыворотки (табл. 1).
Время удвоения, ч.
0
71±11 77±6 50±14
контрольной плазмидой рИ-СМУ1 (контрольная среда). Анализ данных о миграции клеток свидетельствует о том, что кондиционированная среда, содержащая высокие концентрации ангиогенных факторов ИВЕ и Апд-1 значительно стимулирует миграцию ММСК (в 10,3 раза) и ИЫУЕС в (5,38 раз) по сравнению с контрольной средой. Однако наибольший эффект стимуляции направленной
Таблица 1. Оценка пролиферации клеток ИЫУЕС с помощью МТТ-теста
Состав среды
Среда ЕЭМ-2 с 5,5 % ФБС (отрицательный контроль) Среда ЕЭМ-2 с 10 %% ФБС (положительный контроль)
Кондиционированная среда от клеток НЕК293, трансфицированных контрольной плазмидой рИ-СМУ1
Кондиционированная среда от клеток НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином
миграции клеток был обнаружен в группе положитель- содержит стероидные гормоны, жирорастворимые вита-
ного контроля — среда DMEM с 10 % ФБС (табл. 2). Это мины, липопротеиды, а также целый спектр биологиче-
может объясняться тем, что использованная в положи- ски активных веществ, которые, как известно, стимули-
тельном контроле сыворотка животного происхождения руют миграцию и пролиферацию клеток.
Таблица 2. Оценка миграции клеток ММСК и HUVEC с помощью системы Transwell®
Состав среды Число мигрировавших ММСК Число мигрировавших HUVEC
Кондиционированная среда от клеток
НЕК293, трансфицированных контрольной 6,8±2,2 9,75±4 плазмидой pH-CMV1
Кондиционированная среда от клеток НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином
Среда DMEM с 10 % ФБС (положительный контроль)
Примечание: *р < 0,005, данные сравнивали с группой контрольная плазмида pH-CMV1.
70,65±11,6* 52,45±14,2*
98,9±22,3* 124,3±38,6*
A Б В
Рис. 1. ММСК в условиях стимуляции миграции ангиогенными факторами HGF и Ang-1: миграция клеток по градиенту концентрации HGF и Ang-1, содержащихся в кондиционированной среде клеток НЕК293, трансфицированных контрольной плазмидой pH-CMV1 (А) или Васкопоэтином (Б). В — среда DMEM с 10 % ФБС
A
Б
В
( W
—л1».
----г л
%■>•* . / / V г
Д
Рис. 2. Капилляроподобные структуры, формирующиеся клетками HUVEC под действием ангиогенных факторов HGF и Ang-1: результаты через 3 (А-В) и 6 ч. после начала эксперимента (Г-Е) в присутствии факторов HGF и Ang-1, содержащихся в кондиционированной среде от клеток НЕК293, трансфицированных контрольной плазмидой pH-CMV1 (А и Г) и Васкопоэтином (Б и д); среда EGM-2 с 5 % ФБС (В и Е)
Г
Е
Влияние кондиционированной среды клеток НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином, на формирование капилляроподобных структур in vitro
Одной из распространенных моделей для изучения ангиогенной активности веществ является анализ формирования эндотелиальными клетками капилляроподобных структур на Матригеле в присутствии тестируемых агентов. На рис. 2 представлены данные, демонстрирующие увеличение количества капилляроподобных структур, сформированных клетками HUVEC под влиянием кондиционированной среды от клеток НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином, в зависимости от времени экспозиции: через 3 ч. после начала эксперимента (рис. 2Б), и через 6 ч. (рис. 2Д) по сравнению с контролем (кондиционированная среда от клеток НЕК293, трансфицированных контрольной плазмидой pH-CMV1, рис. 2Г). Таким образом, ангиогенные факторы HGF и Ang-1,
содержащиеся в среде клеток НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином, стимулируют формирование и стабилизацию капилляроподобных структур эндотели-альными клетками по сравнению с контролем.
Влияние кондиционированной среды от клеток НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином, на миграцию сосудистых клеток из эксплантов аорты мыши в Матригеле ex vivo
Культивирование брюшной аорты мыши в трёхмерном матриксе ex vivo является широко используемой моделью ангиогенеза [11]. Введение в Матригель различных биологически активных веществ позволяет анализировать их влияние на процесс ангиогенеза в динамике. На рис. 3 представлены микрофотографии эксплантов аорты, сделанные с помощью темнопольной микроскопии на 7 сут. (рис. 3А-В) и 14 сут. (рис. 3 Г-Е) после начала эксперимента. На рис. 3Ж представлены
A
Б
В
Ù
/
Д
Ж
Рис. 3. Стимуляция миграции клеток сосудов из эксплантов аорты в Матригель ангиогенными факторами HGF и Ang-1: микрофотографии эксплантов на 7 (А—В) и 14 сут. (Г—Е). А, Г — добавление в Матригель кондиционированной среды от клеток НЕК293, трансфицированных контрольной плазмидой pH-CMV1; Б, Д — положительный контроль (рекомбинантный белок VEGF, 20 нг/мл); В, Е — добавление в Матригель кондиционированной среды от клеток НЕК293, трансфицированных Васкопоэтином. Белой линией и стрелкой обозначен фронт миграции клеток из экспланта. Ж — результаты статистического анализа миграции, где представлены данные, полученные в трёх независимых экспериментах на 7 и 14 сут. после начала эксперимента (*р<0,05, сравнение проводили между группами VEGF и Васкопоэтин с контролем pH-CMV1 на 7 сут.; **р<0,05 сравнение проводили между группами VEGF и Васкопоэтин с контролем pH-CMV1 на 14 сут.)
Г
Е
результаты, полученные при подсчёте и статистическом анализе длины миграционного пути клеток из эксплан-тов аорты в Матригель на 7 сут. Данные свидетельствуют о статистически значимом стимулирующем миграцию эффекте Васкопоэтина по сравнению с группой контроля pH-CMV1 (р<0,05). Следует отметить, что Васкопоэтин, как и VEGF, ангиогенные свойства которого хорошо изучены [15], значительно увеличивали скорость миграции сосудистых клеток из эксплантов аорты в Матригель и скорость миграции клеток в группе Васкопоэтин была сопоставима со скоростью миграции клеток в группе VEGF, что говорит о высокой способности Васкопоэтина стимулировать миграцию клеток сосудов.
Наработка факторов роста HGF и Ang-1 в скелетных мышцах
В полученных гомогенатах мышц животных, которым вводили контрольную плазмиду, содержание факторов HGF и Ang-1 оказалось ниже уровня детекции. Однако в мышцах, трансфицированных Васкопоэтином, содержание белка HGF и Ang-1 детектировалось уже на 3 сут. после введения плазмид (290 пг/мкг белка и 70 пг/мкг белка, соответственно), достигало максимума на 7 сут. (375 пг/мкг белка и 410 пг/мкг белка, соответственно), и сохранялось на высоком уровне, как минимум, в течение 14 сут. (180 пг/мкг белка и 270 пг/мкг белка, соответственно).
Влияние Васкопоэтина на восстановление кровотока после введение Васкопоэтина в ишемизированную конечность
После проведения операции по индукции ишемии у большинства животных показатели перфузии падали до уровня 5-7 % (по сравнению с неоперированной конечностью) (рис. 4А). В группе контроля (плазмида pH-CMV1 ) отмечалась чёткая тенденция к слабой перфузии тканей кровью и выходу ее на плато на уровне 40 % от нормы через 15-20 сут. При введении Васкопоэтина отмечалась более динамичная реперфузия конечности уже к 15 сут.: кровоток в этой точке был достоверно выше, чем в контроле, однако, максимальных значений этот эффект достигал к 20 сут. и перфузия тканей к 20 сут. превышала 60 % от уровня перфузии в здоровой конечности.
Влияние Васкопоэтина на формирование сосудов в ишемизированной конечности, частоту ампутаций и размер некроза
Для оценки специфической ангиогенной эффективности Васкопоэтина по восстановлению кровотока мы исследовали его влияние на формирование сосудов в ишемизированной конечности мыши. При анализе окрашенных криосрезов образцов ткани мышц m. tibialis anterior и подсчёте капилляров и артериол оказалось, что к 15 сут. плотность капилляров (С1331+-структур] была достоверно выше на срезах, полученных от животных, которым вводили Васкопоэтин, по сравнению с животными, которым вводили контрольную плазмиду (рис. 4Б, В и Г]. Что касается плотности артериол (а-ГМА+-структур), была отмечена лишь тенденция (p>0,05) к её увеличению в группе Васкопоэтин по сравнению с контролем (рис. 4Б, В и Д].
Полученные данные подтверждают наличие специфической ангиогенной активности у Васкопоэтина. Отсутствие статистической значимости в различиях по плотности а-ГМА+ артериол может объясняться также крайне высокой вариабельностью количества артериол, плотность которых существенно отличалась даже между разными срезами внутри одной группы животных.
При оценке площади некроза на криосрезах ишеми-зированных мышц было обнаружено, что площадь некроза в образцах мышц, которым вводили Васкопоэтин, была в 2 раза меньше по сравнению с площадью некроза в контроле (рис. 5]. Полученные нами данные свидетельствуют о тканепротективном действии Васкопоэтина, которое может быть обусловлено как ангиогенными эффектами HGF и Ang-1, так и антиапоптотическим эффектом HGF. Нельзя также исключить и роль противовоспалительного действия HGF [16].
При оценке частоты ампутаций (стопа и выше] и не-кротизации тканей (дистальные некрозы фаланг или пальцев] некроз наблюдался практически у всех животных ввиду слабого развития коллатерального кровотока. Тем не менее, было обнаружено, что при введении контрольной плазмиды (pH-CMV1 ] частота ампутаций составила 66,7 %, а в группе мышей, которым вводили Васкопоэтин, частота ампутаций была снижена практически на 50 % и составила 33,3 % (табл. 3].
Таблица 3. Оценка размера и тяжести некроза после введения в ишемизированную конечность Васкопоэтина
Группа Дистальные некрозы Средние некрозы Высокие некрозы Всего
Васкопоэтин(n=6] 1 1 0* 2/6 (33,3 %]
Контрольная плазмида pH-CMV1 (n=6] 0 2 2 4/6 (66,7 %]
Примечание: *p=0,045, 7 сут.
Обсуждение
Несмотря на то, что с момента проведения первых экспериментальных работ по терапевтическому анги-огенезу прошло более 15 лет, значительных успехов в клинике достигнуто не было [4, 17]. Единственным препаратом отечественного рынка является Неоваскулген, представляющий собой плазмидный препарат с геном VEGF, который может быть назначен в качестве одного из элементов комплексного лечения пациентов с хронической ишемией нижних конечностей [18].
В этой связи в нашей стране и во всем мире активно продолжаются исследования, направленные на усовершенствование методов и повышения эффективности
генной терапии, как в плане использования различных генетических конструкций, так и способов доставки и режима введения [12, 13]. Вирусные конструкции (аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, лентивирусы) с генами факторов роста активно применяются в работах по терапевтическому ангиогенезу [13, 19]. На модели ишемии задней конечности у мышей было показано, что сочетанное введение аденовирусных конструкций для экспрессии VEGF164 и PDGF-BB, эффективно восстанавливает кровоснабжение [20]. В некоторых работах были использованы генно-мо-дифицированные клетки. Так, в нашей лаборатории ранее было установлено, что использование ММСК,
синтезирующих белок VEGF, для трансплантации цельных клеточных пластов или инъекции клеток в суспензии, вызывают выраженную реперфузию ишемизированной конечности мыши [13, 14].
Использование невирусных методов доставки генетического материала считается более актуальным: транзиторность экспрессии генов и большое количество исследований, показавших эффективность и безопасность, делают плазмидные векторы оптимальным инструментом для генной терапии сегодня [13, 19].
В поисках более эффективных методов генной терапии ряд исследователей использовали комбинацию векторов, кодирующих несколько факторов роста. Этот подход основан на понимании того, что ангиогенез является комплексным процессом, в котором участвуют несколько типов клеток (эндотелиальные и гладкомышечные, ММСК, моноциты, клетки-предшественники); процессы деградации и стабилизации матрикса, пролиферация, миграция и апоптоз клеток четко регулируются различными факторами роста и цитокинами. Координированное действие разных факторов обеспечивает формирование нового функционально зрелого сосуда, артериогенез
и ремоделирование сосудов [2]. Эффективность восстановления кровотока в тканях и увеличение плотности сосудов на экспериментальных моделях были продемонстрированы в ряде исследований при использовании следующих комбинаций генов: VEGF и HGF [21] VEGF и bFGF [22], VEGF и PDGF-BB [23], VEGF и Ang-1 [24], VEGF и SDF-1 а [25].
в настоящей работе выбор комбинации HGF и Ang-1 для создания васкопоэтина основан на понимании механизмов ангиогенного и антиапоптотического действия этих факторов. При ишемических повреждениях органов и тканей происходит массовая гибель клеток из-за отсутствия нормального кровоснабжения, в этой связи первоочередной задачей для обеспечения полноценной регенерации является защита от апоптоза, индукция формирования кровеносных сосудов и их стабилизация. Выбор клеток в экспериментах in vitro был обусловлен тем, что эндотелиальные клетки представляют собой главную клеточную мишень для анги-огенных факторов и экспрессируют рецепторы к HGF и Ang-1. Взаимодействие эндотелиальных клеток с ГМК и перицитами необходимо для формирования
A
Динамика восстановления кровотока в ишемизированной конечности
Васкопоэтин Контроль
Г
Оценка плотности капилляров в мышцах на 15 сутки эксперимента
! 700
I 600
£ 500 I 400 > 300
Контроль Васкопоэтин
Д
Оценка плотности артериол в мышцах на 15 сутки эксперимента
S 8
ш 7
* 6 ш
¡3 5 < 4
I 3
£: 2
g 1 О
0
5 дней
10 дней 15 дней 20 дней
Контроль Васкопоэтин
Б CD31 ГМА DAPI В CD31 ГМА DAPI
* . \ / / t <? -- f ' йоо \ •-■ é - . ' ,4.. ■ \ ' ■ ч' ■ .-• W ■ , ; П ' '0 • -v ■'■'• :-чг>- v ЙЮ
Контроль Васкопоэтин
Рис. 4. Восстановление кровотока в ишемизированной конечности мыши после введение Васкопоэтина: А — график восстановления кровотока в конечности, оценка по величине перфузии тканей подошвы кровью. (Б-Д) — оценка влияния Васкопоэтина на плотность капилляров и артериол в ишемизированной мышце конечности мыши. Б, В — окрашивание срезов мышц на маркёры капилляров (CD31) (красная флуоресценция) и артериол (-ГМА+) (зелёная флуоресценция). Г, Д — результаты расчета плотности сосудов на срезах мышц, представленные как среднее количество сосудов в одном поле зрения. Различия статистически значимы при *р<0,05, #p>0,05
70
- 60
50
40
30
> 20
0
A
Б
В
40 35 30 25 20 15 10 5 0
Некроз скелетных мышц
Контроль
Контроль
Васкопоэтин
Рис. 5. Площадь некроза в ишемизированной мышце после введение Васкопоэтина: А — средние значения площади некроза на срезах мышц (по 4 поля зрения для каждого образца, 5 образцов в каждой группе, *р<0,05), Б - ишемизированные мышцы, окраска: гематоксилин и эозин. Чёрной линией обведены зоны некроза
стабильных, функционально зрелых сосудов [26]. Гетерогенная популяция ММСК содержит субпопуляцию перицитов и гМК, которые также экспрессируют на мембране рецепторы к HGF и Ang-1. При изучении биологической активности Васкопоэтина было обнаружено, что присутствие факторов HGF и Ang-1 в среде культивирования активирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, миграцию ММСК, увеличивает способность эндотелиальных клеток формировать капилляроподобные структуры на Матригеле in vitro (рис. 2). Следует отметить, что в случае использования Васкопоэтина эндотелиальные клетки не только достоверно лучше формировали капилляроподобные структуры, но и сами структуры характеризовались большей протяжённостью и толщиной. Мы предполагаем, что присутствие HGF и Ang-1 в среде культивирования эндотелиальных клеток не только стимулирует сборку капилляроподобных структур, но и способствует их стабилизации. Кроме того, использование комплексной трёхмерной модели эксплантной культуры аорты мыши ex vivo показало, что присутствие hGf и Ang-1 значительно увеличивает миграцию сосудистых клеток из экспланта и формирование капилляроподобных структур в Матригеле (рис. 2, 3).
Стимулирующие эффекты Васкопоэтина были далее подтверждены на моделях in vivo. Введение Васкопоэтина в мышцы с последующей электропорацией приводило к их эффективной трансфекции и продукции трансгена в высокой концентрации, о чем свидетельствуют данные по содержанию HGF и Ang-1 в гомогенатах мышц т.
ЛИТЕРАТУРА
1. Deveza L., Choi J., Yang F. Therapeutic Angiogenesis for Treating Cardiovascular Diseases. Theranostics 2012; 2(8): 801-14.
2. Carmeliet P., Jain K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature 2011; 473(7347): 298-307.
3. Xu K., Cleaver O. Tubulogenesis during blood vessel formation. Semin. Cell Dev. Biol. 2011; 22(9): 993-1004.
4. Gupta R., Tongers J., Losordo D.W. Human Studies of Angiogenic Gene Therapy. Circ. Res. 2009; 105: 724-36.
5. Carmeliet P. VEGF gene therapy: stimulating angiogenesis or angio-ma-genesis. Nat. Med. 2000; 6: 1102-13.
6. Morishita R., Aoki M., Hashiya N. et al. Therapeutic angiogenesis using hepatocyte growth factor (HGF). Curr. Gene Ther. 2004; 4: 199-206.
7. Shimamura M., Nakagami H., Taniyama Y. et al. Gene therapy for peripheral arterial disease. Expert Opin. Biol. Ther. 2014; 14(8): 1175-84.
8. Ono K., Matsumori A., Shioi T. et al. Enhanced expression of hepa-tocyte growth factor/c-Met by myocardial ischemia and reperfusion in a rat model. Circulation 1997; 95(11): 2552-8.
9. Rincon M.Y., Vanden Driessche T. et al. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovasc. Res. 2015; 108(1): 4-20.
10. Pospelova T.V., Bykova T.V., Zubova S.G. et al. Rapamycin induces pluripotent genes associated with avoidance of replicative senescence. Cell Cycle 2013; 12(24): 3841-51.
11. Semina E.V., Rubina K.A., Sysoeva V.Yu. et al. Three-Dimensional Model of Biomatrix as a Method of Studying Blood Vessels and Nerve Growth in Tissue Engineering Structures. Moscow University Chemistry Bulletin 2016; 71(3): 172-7.
12. Makarevich P., Tsokolaeva Z., Shevelev A. et al. Combined transfer of human VEGF165 and HGF genes renders potent angiogenic effect in ischemic skeletal muscle. PLoS One 2012; 7(6): e38776.
13. Макаревич П.И., Болдырева М.А., Дергилёв К.В. и соавт. Трансплантация клеточных пластов из мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани эффективно индуцирует ангиогенез в ишемизированных скелетных мышцах. Гены и Клетки 2015; 10(3): 68-77.
14. Shevchenko E., Makarevich P., Tsokolaeva Z. et al. Transplantation of modified human adipose derived stromal cells expressing VEGF165 results in more efficient angiogenic response in ischemic skeletal muscle. J. Transl. Med. 2013; 11: 138.
tibialis anterior. На модели ишемии задней конечности было обнаружено, что Васкопоэтин вызывает васкуля-ризацию мышц, восстанавливает кровоток, значительно уменьшает некроз тканей и способствует сохранению конечности (рис. 4, 5).
Таким образом, в настоящем исследовании на моделях in vitro, ex vivo и in vivo продемонстрировано стимулирующее действие Васкопоэтина на процессы анги-огенеза. Мы предполагаем, что в основе ангиогенных эффектов Васкопоэтина лежит активация процессов миграции и пролиферации сосудистых клеток и их способности формировать капилляроподобные структуры. Создание препарата, обладающего выраженными анги-огенными свойствами, способного не только стимулировать рост новых сосудов, но и обеспечивать их стабилизацию, защищать клетки от апоптоза в зоне повреждения и восстанавливать кровоснабжение в ишемизированных тканях, является перспективным подходом к решению проблемы улучшения кровоснабжения и восстановления функции органов и тканей после повреждения.
Благодарности
Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда (проект № 14-24-00086) с использованием биоматериала, собранного и сохраняемого в рамках научной программы Научные основы создания национального банка-депозитария живых систем (соглашение РНФ № 14-50-00029), и оборудования, приобретенного за счёт средств Программы развития МГУ им. М.В. Ломоносова.
15. Carmeliet P. VEGF as a key mediator of angiogenesis In cancer. Oncology 2005; 69: 4-10.
16. Min J.K., Lee Y.M., Kim J.H. et al. Hepatocyte Growth Factor Suppresses Vascular Endothelial Growth Factor-Induced Expression of Endothelial ICAM-1 and VCAM-1 by Inhibiting the Nuclear Factor-B Pathway. Circ. Res. 2005; 96: 300-7.
17. De Haro J., Acin F., Lopez-Quintana A. et al. Meta-analysis of randomized, controlled clinical trials in angiogenesis: gene and cell therapy in peripheral arterial disease. Heart Vessels 2009; 24: 321-8.
18. Deev R., Plaksa I., Bozo I. et al. Results of an International Postmarketing Surveillance Study of pl-VEGF165 Safety and Efficacy in 210 Patients with Peripheral Arterial Disease. Am. J. Cardiovasc. Drugs 2017; 17(3]: 235-42.
19. Kim J., Mirando A.C., Popel A.S. et al. Gene delivery nanoparticles to modulate angiogenesis. Adv. Drug Deliv. Rev. In press 2016.
20. Banfi G., von Degenfeld R., Gianni-Barrera S. et al. Therapeutic angiogenesis due to balanced single-vector delivery of VEGF and PDGF-BB. FASEB J. 2012; 26: 2486-97.
21. Makarevich P., Tsokolaeva Z., Shevelev A. et al. Combined transfer of human VEGF165 and HGF genes renders potent angiogenic effect in ischemic skeletal muscle. PLoS One 2012; 7(6]: e38776.
22. Spanholtz T.A., Theodorou P., Holzbach T. et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF165] plus basic fibroblast growth factor (bFGF] producing cells induce a mature and stable vascular network — a future therapy for ischemically challenged tissue. J. Surg. Res. 2011; 171: 329-38.
23. Kupatt C., Hinkel R., Pfosser A. et al. Cotransfection of vascular endothelial growth factor — A and platelet-derived growth factor-B via recombinant adeno-associated virus resolves chronic ischemic malperfusion role of vessel maturation. J. Am. Coll. Cardiol. 2010; 56: 414-22.
24. Su H., Takagawa J., Huang Y. et al. Additive effect of AAV-mediated angiopoietin-1 and VEGF expression on the therapy of infarcted heart. Int. J. Cardiol. 2009; 133: 191-7.
25. Yu J.X., Huang X.F., Lv W.M. et al. Combination of stromal-derived factor-1alpha and vascular endothelial growth factor genemodified endothe-lial progenitor cells is more effective for ischemic neovascularization. J. Vasc. Surg. 2009; 50: 608-16.
26. Макаревич П.И., Рубина К.А., Дыйканов Д.Т. и соавт. Терапевтический ангиогенез с применением факторов роста: современное состояние и перспективы развития. Кардиология 2015; 9: 59-71.
Поступила: 17.04.2017
