CC BY
104
УДК 616-006.484-085.2/3:616-092.9+611.013.68
И. С. Брюховецкий
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕПАРАТА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ЭКСПЕРИМЕНТЕ IN VIVO ПОСЛЕ КУРСА ХИМИОТЕРАПИИ НА МОДЕЛИ ГЛИОБЛАСТОМЫ У КРЫС
Дальневосточный федеральный университет Школа биомедицины, Владивосток Контактная информация
Брюховецкий Игорь Степанович, к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной и клеточной нейробиологии
адрес: 690950 г. Владивосток, ул. Суханова, 8; тел. +7(914)723005003 e-mail: [email protected]
Статья поступила 08.10.2014, принята к печати 24.11.2014.
Резюме
МТБ - одна из самых агрессивных, злокачественных, глиальных опухолей человеческого организма. Стандартом лечения является хирургическая резекция, облучение и химиотерапия темозоламидом. Прогноз крайне неблагоприятный. Медиана выживаемости составляет 12-15 месяцев. Высокую резистентность глиальных опухолей связывают с опухолевыми стволовыми клетками. Феномен направленной миграции здоровых стволовых клеток к опухолевому очагу открывает новые перспективы в лечении МТБ. ГСК наименее вовлечены в нейроканцерогенез и могут быть использованы для совершенствования и оптимизации протоколов лечения МТБ.
Целью данной работы стало изучение эффективности и перспектив клинического применения препарата мобилизованных стволовых клеток после курсового введения темозоламида крысам с экспериментальной глиомой линии С6.
Эксперимент выполнен на 130 крысах линии Вистар с глиомой С6. Животные были разделены на 4 группы: контрольную; группу получавших темозоламид; группу получавших биомедицинский препарат мобилизованных стволовых клеток и группу получавшую биомедицинский препарат мобилизованных стволовых клеток после курса химиотерапии темозоламидом. Продолжительность эксперимента - 70 дней.
Наименьшее значение объёма глиомы выявлено у крыс, получивших темозоламид 115,76±16,25мм3 и у животных группы темозоламид + клетки 114,74±5,54 мм3, что было достоверно (p<0,05) меньше размеров неопластического узла у животных в контрольной группе - 202,09±39,72 мм3.
Животные из группы «темозоламид+клетки» жили достоверно дольше крыс контрольной группы или получавших только химотерапию. Имплантированные клетки мигрируют из области введения в неопластический очаг и взаимодействуют с клетками глиомы, но механизмы этого явления нуждаются в дальнейшем изучении.
Ключевые слова: мультиформная глиобластома, темозоламид, стволовые клетки, нейральные стволовые клетки, опухолевые стволовые клетки, гемопоэтические стволовые клетки.
I.S. Bryukhovetskiy
EFFICIENCY OF STEM CELL PREPARATION IN THE EXPERIMENT IN VIVO AFTER A COURSE
OF CHEMOTHERAPY ON THE EXPERIMENTAL MODEL OF GLIOBLASTOMA IN RATS
School of Biomedicine, Far Eastern Federal University, Vladivostok
Abstract
MGB is one of the most aggressive, malignant glial tumors of the human body. Standard treatment is surgical resection, radiation, and chemotherapy temozolomide. Prognosis is extremely poor. Median survival is 12-15 months. High resistance of glial tumors is associated with tumor stem cells. The phenomenon of directional migration of healthy stem cells to tumor foci opens new perspectives in the treatment of the MGB. HSCs are the least involved in neurotu-morogenesis and can be used to improve and optimize treatment protocols MGB.
Objective. To study the prospects for the use of biomedical drug mobilized stem cells in treatment of rats with experimental glioblastoma.
The experiment was performed on 130 Wistar rats with glioma C6. Animals were divided into the control group, the group of animals treated with Temozolomide, the group of animals treated only biomedical cell preparation of stem cells and the group of rats treated with biomedical cell preparation of stem cells after the chemotherapy course Temozolomide. The duration of experiment - 70 days. Used complex biotechnology, surgical, neuroimaging morphological and physiological methods.
The smallest value of the volume of glioma was found in rats receiving temozolomide 115,76 ± 16,25mm3 and party animals temozolamide + cells 114,74 ± 5,54 mm 3, which was significantly (p <0,05) than the size of a neoplastic node in the control group 202,09 ± 39,72 mm 3.
Animals from group "temozolamide + cells" lived significantly longer than control rats receiving only chemotherapy or. Implanted cells migrate from the introduction of neoplastic foci and interact with glioma cells, but the mechanisms of this phenomenon need to be further explored.
Key words: glioblastoma multiforme, Temozolomide, stem cells, neural stem cells, tumor stem cells, hemato-poietic stem cells.
Введение
Мультформная глиобластома - одна из самых агрессивных первичных злокачественных, глиальных опухолей головного мозга человека [17; 18]. Несмотря на все достижения медицинской науки, сегодня, при условии выполнения всех современных терапевтических протоколов, медиана выживаемости больных с МТБ составляет 12-14 месяцев [25]. Крайне низкую эффективность лечения принято объяснять запоздалой диагностикой, большим числом диагностических ошибок, высокой степенью инфильтрации паренхимы мозга опухолевыми клетками, специфическими особенностями, связанными с локализацией опухоли в замкнутой полости черепа в непосредственной близости от жизненно важных центров мозга.
Высокую резистентность МТБ к облучению и химиотерапии в последние годы связывают с ОСК - особой популяцией клеток новообразования, обладающими способностью восстанавливать поврежденную ДНК, беспрепятственно мигрировать в пределах паренхимы мозга и имеющих ряд других стратегических преференций [1; 3; 6; 34].
Фармацевтических препаратов, способных направленно уничтожать ОСК, сегодня не существует. Изучается возможность поражения только отдельных мишеней в ОСК. Например, иматиниб нарушает сигнализацию рецептора к фактору роста тромбоцитов PDGFR и блокирует сигнальный путь MAPK [19]. Рапамицин инактивирует ген PTEN, а циклопамин прерывает сигнальный путь Wnt/Sonichedgehod [20; 27]. При этом, будучи ограниченно эффективны против ОСК, эти препараты не способны поражать интерфазные опухолевые клетки, рассеянные по веществу мозга. Попытки использовать для этой цели про-карбазин (нагулан), ломустин (CCNU), нимустин (ACNU), фотемустин (мюстофоран), дакарбазин, иринотекан, аранозу, лизомустин и даже темозола-мид, используемые для лечения меланомы, пока еще не увенчались успехом [9; 12; 24].
Применение моноклональных антител тоже нельзя назвать решением проблемы. Эффективность антител к белкам ОСК CD 133 пока не доказана. Иппилимумаб (антитело, связывающее белок CTLA4) не проникает в гипоксические зоны опухоли. Бевацизумаб угнетает костномозговое кроветворение и повышает риск кровотечений, а ингибиторы тирозинкиназы эрлотиниб и имматиниб пока имеют только хорошие перспективы [30]. Появление липосомальных и таргетных препаратов существенно не изменило показателей выживаемости больных с МТБ и другими глиальными опухолями головного мозга [4; 10; 11; 13].
Важнейшим этапом в процессе разработки новых биомедицинских решений для терапии МТБ стало открытие феномена направленной миграции стволовых клеток в опухолевый очаг [6]. Главная роль в этом процессе отводится фактору стромальных клеток SDF-1a или CXCL12, хемокину подсемейства CXC [28]. Данный лиганд связывается с рецепторами CXCR4 и CXCR7 мембраны стволовой клетки и индуцирует миграцию. SCF, HGF, VEGF, MCP-1, HMGB1, uPA и ряд других лигандов выступают модераторами этого процесса. Применение стволовых клеток позволяет преодолеть гематоэнцефалический барьер, воздействовать на опухолевые клетки, рассеянные в паренхиме мозга, и проникать в гипоксические зоны опухоли [6]. Однако воздействие на ОСК требует специфического подхода, соответствующего особой роли и степени сложности этого объекта.
Общность иммунофенотипических кластеров дифференцировки, единство основных генов и эпигенетических механизмов, регулирующих ключевые жизненные процессы, сходство протеомного и транскриптомного профилей свидетельствует о том, что ОСК инвазивных глиальных опухолей является продуктом патологической эволюции НСК головного мозга человека [7]. НСК, будучи инструментом локального тканевого гомеостаза, постоянно мигрируют из герминативных зон мозга и взаимодействуют с нейронами и глиальными клетками. Межклеточное взаимодействие служит основным фактором согласованной регуляции метаболизма, запускает программы выживания, детерминации, дифференцировки, адаптации, пролиферации и апоптоза. Индукционное взаимодействие между НСК и патологически измененными клетками запускает в них естественные механизмы клеточной гибели [2; 5; 14].
Очевидно, что трансплантация стволовых клеток, сохранивших свой регуляторный потенциал, может стать важнейшим направлением модернизации современных протоколов комплексного лечения глиальных опухолей головного мозга [15]. Создание систем соматических и стволовых клеток с заданными свойствами - одно из приоритетных направлений мировой биомедицины. Вместе с тем очевидно, что технологии и методы перепрограммирования клеточных систем, основанные на трансфере ядра соматической клетки в цитоплазму ооцита, слияния двух соматических клеток с плю-рипотентными свойствами, трансфекции с использованием вирусов, как и ряд других генно-инженерных технологий, еще долго не найдут своего места в практической медицине. Возможные генетические последствия и риск вреда для здоровья пациента от применения данных клеточных систем «перечеркивает» все их достоинства и не позволяет рассматривать их в ближайшей перспективе как стратегию выбора в лечении МТБ. Не менее туманными представляются перспективы клинического использования эмбриональных СК в связи с наличием ряда не решаемых вопросов о способах их контроля в организме пациента и серьезных морально-этических проблем их получения.
В 2013 году наша исследовательская группа завершила первый блок экспериментов по сравнительному протеомному картированию и биоинформационному анализу лизатов НСК человека (СБ 133+), выделенных из обонятельной выстилки носа человека, мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (СБ29+, СБ44+, СБ73+, СБ90+, СБ34) костного мозга и СБ 133+ ОСК глиобласто-мы человека линии и87 [7]. Установлено, что наибольшая степень протеомных отличий свойственна стволовым клеткам костного мозга, и это позволяет предположить, что они сохранили естественный циторегуляторный потенциал.
Ряд специализированных онкологических учреждений в России и за рубежом на протяжении ряда лет успешно использует препарат мобилизованных аутологичных стволовых клеток периферической крови, основу которого составляют сепарированные мононуклеарные клетки с высоким содержанием гемопоэтических стволовых клеток [8]. Глубина протеомных отличий этого типа клеток от НСК и ОСК МТБ позволяет предположить, что трансплантация клеток этого типа уже сегодня может быть инструментом повышения эффективности стандартных схем лечения глиальных опухолей головного мозга.
Целью данной работы стало изучение эффективности и перспектив клинического применения препарата мобилизованных стволовых клеток после курсового введения темозоламида крысам с экспериментальной глиомой линии С6.
Материалы и методы
Дизайн исследования
Эксперимент выполнен на 130 половозрелых крысах-самках линии Wistar массой тела 200-220 грамм в начале эксперимента. Животные были разделены на четыре группы.
Контрольную группу составили животные с глиомой С6 (N =30).
Вторая группа сформирована из крыс с глиомой, которым была проведена терапия темозоламидом по стандартной схеме (группа «темозоламид», N = 30).
Третью группу составили крысы с глиомой С6, которым были трансплантирован препарат ге-мопоэтических стволовых клеток (ГСК) далее, группа «клетки», N = 30).
Четвертая группа состояла из крыс с глиомой C6, которым после терапии темозоломидом проводилась стереотаксическая имплантация ГСК в периопухолевое пространство (группа «темозоламид + клетки» N = 30).
Отдельную группу составляли ложно оперированные животные (N = 10).
В работе использован комплекс хирургических, культуральных, морфологических и нейрови-зуализационных методов. Крыс наблюдали в течение 70 дней. Максимум внимания был уделен продолжительности жизни животных. При ухудшении состояния крыс выводили из эксперимента путем глубокого наркоза. Эксперимент был повторен три раза. Содержание и уход за животными осуществлялся в соответствии с требованиями стандартов GLP и Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Экспериментальная часть работы, в том числе использование человеческого материала для исследовательских целей, одобрена этическим комитетом Школы биомедицины Дальневосточного федерального университета (протокол № 12 от 14.12.2013).
Культура клеток глиомы линии С6
В работе использована глиома крыс линии С6, предоставленная сотрудниками лаборатории фундаментальной и прикладной нейробиологии Государственного научного центра имени В.П. Сербского (Россия, Москва). Быстро прогрессирующая клеточная линия этой опухоли получена на крысах Wistar-Furth путем индукции канцерогенеза N, N-нитрозометилмочевиной. По морфологии, характеру инвазивного роста и спектру белков глиома С6 наиболее близко соответствует МТБ человека [18; 35].
Для проведения эксперимента аликвоту, содержащую 106 опухолевых клеток, размораживали в течение 10 мин при 37 °С, отмывали от ДМСО средой DMEM с 10% FBS и добавлением антибио-тика-антимикотика «*100», содержащего 10 000 ед/мл пенициллина, 10 000 мкг/мл стрептомицина, и 25 мкг/мл фунгизона (все - производства компании Gibco®). Клетки осаждали центрифугированием, добавляли свежую среду, и высаживали в 50 мл культуральные матрасы (Costar).
Культивирование продолжали до образования монослоя. После этого клетки снимали путем
ферментативной диссоциацией (0,05% trypsin-EDTA 1 : 4, 10 мин, +37 °С), центрифугировали (120 g, 6 мин), супернатант сливали, добавляли свежую среду, и ресуспендировали. Моделирование опухоли выполнялись под общим наркозом. Наркоз проводили посредством введения 200 мкл смеси, содержащей золетил и рамитар в соотношении 1 : 4 внутрибрюшинно. Клетки глиомы в количестве 106 имплантировали в область каудопутаме-на с помощью стереотаксического аппарата Nar-ishige (Japan) по координатам атласа мозга крысы Swanson: Ар-1; L 3,0; V 4,5, TBS-2,4 мм с помощью гамильтоновского шприца со скоростью 3 мкл/мин в объеме 20 мкл [31]. Перед введением часть клеток глиомы С6 была обработаны Vybrant® CFDA SE Cell Tracer по методике производителя - компании Molecular Probes® (№ V12883).
Препарат
мобилизованных стволовых клеток (ГСК)
Препарат мобилизованных стволовых клеток человека был предоставлен «Клиникой восстановительной и интервенционной неврологии и терапии «Нейровита» (г. Москва).
Подробное описание клеточного препарата представлено ранее [8]. Согласно сопроводительной документации содержание мононуклеарных клеток с маркером клеточной поверхности CD34+/CD 45+ в препарате составляло 1,2 %. После размораживания клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10 % FBS, FGF, EGF и анти-биотик-антимикотик «*100» (все производства компании Gibco®). Перед трансплантацией препарат ГСК был обработан флуоресцирующим красителем CellTracker™ Red CMtPx по методике производителя - компании Molecular Probes® (№ С34552). 6
Препарат в количестве 106 клеток вводили в периопухолевое пространство мозга животным с глиомой С6 на 10 сутки после имплантации клеток глиомы. Предварительное исследование показало, что в течение 10 дней объем глиомы увеличивался в два раза, таким образом, соотношение клетки глиомы/клеточный препарат составляло 2 : 1. У ложно оперированных животных в область каудо-путамена вводили 20 мкл среды DMEM (Gibco).
Химиотерапия
Стандартом химиотерапии инвазивных глиом является темозоламид - цитостатический хими-опрепарат препарат алкилирующего действия. Препарат быстро проникает в системный кровоток и превращается в активный метаболит, цитотокси-ческое действие которого обусловлено алитирова-нием гуанина в положениях O6 и N7, что нарушает структуру и синтез ДНК [22].
В работе был использован препарат производства Shering-Plough Labo N.V. (Belgia) под торговым названием Temodal®. На 10 сутки после имплантации клеток глиомы животным проводили МРТ. При наличии четко визуализируемой опухоли животные соответствующих групп получали перо-рально темиозоламид в дозе 50 мг/кг массы тела с 10 по 14 день эксперимента.
Нейровизуализационное исследование
МРТ головного мозга проводили на МР-томографе Biospec (Bruker) под общим наркозом с применением специальной магнитной катушки для мелких лабораторных животных. МРТ выполняли на 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70 дни эксперимента.
54 | ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕПАРАТА...
Неврологический статус и масса тела Исследование неврологического статуса у крыс выполнено согласно стандартному алгоритму [33]. Измерение массы тела проводили с использованием лабораторных весов Sartorius CPA12001S.
Морфологическое исследование Срезы толщиной 40 мкм окрашивали крезило-вым фиолетовым, толуидиновым синим и гематоксилином-эозином согласно стандартному протоколу. Для визуализации очагов некроза использован метод И.В. Викторова [36]. В работе использованы: система визуализации живых клеток LSM 5 Karl Zeis Pascal, конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Carl Zeiss LSM 710, система мультифотонной лазерной микроскопии производства компании «Olympus». Для работы с изображением применялась программы 3D for LSM Version 1.4.2 и ImageJ (США).
Морфометрия опухоли
Объем глиомы определяли по формуле:
V
4 3ж
abc
, где
a, b, c - полуоси эллипсоида. Первоначально находили срез с максимальной площадью глиомы, на котором определяли большую полуось (а) и малую полуось эллипсоида (b). Затем путем суммирования толщины фронтальных срезов на расстоянии от переднего до заднего полюса опухолевого узла находили переднезаднюю полуось (с).
Статистический анализ проведен с использованием MS Excel 2010. Обработка изображений выполнена с использованием программы ImageJ (USA).
Результаты
Стереотаксическая имплантация клеток глиомы С6 в головной мозг экспериментальных животных привела к формированию объемных опухолей. На МРТ сканах выявлялось объемное новообразование неправильной формы с признаками сдавления желудочков мозга, очагами кровоизлияний, явления отека и компрессии мозговых структур (рис. 1). Морфологическое исследование выявляло опухоль с нечеткими границами, участками инвазии в мозговую паренхиму и отеком прилегающего белого вещества (рис. 2; см. вклейку).
/Л
I т^
SI 1.00/1.50 mm FOV 4.00 cm MTX 256 Pos 0.50 mm A
Рис.1. Магнитно-резонансное изображение мозга крысы через семь дней после имплантации клеток глиомы С6. Видны признаки сдавления желудочков мозга, отека и дислокации срединных мозговых структур. Т2 - режим ТигЪоЯЛКЕ.
70 60 50 40 30 20 10 0
I I
Контроль
Темозоламид
■ Клетки
| ■ Темозоламид +Клетки
Р<0,005 Планки погрешности-стандартное отклонение
Рис. 5. Выживаемость экспериментальных животных в ходе эксперимента.
250 200
150
100
50
kill
Контроль Темозоламид Клетки Темозоламид +
В начале исследования
Клетки
По выходу ИЗ эксперимента
Рис. 6. Динамика массы тела животных в эксперименте.
Опухоль состояла из клеток различной формы и величины, которые содержали разное число ядер. Распространение опухоли происходило по перивазальным и переневральным пространствам. Ацидофильные клетки селективно окрашивались ванадиевокислым фуксином в гранатовый цвет и обнаруживали обширные зоны центрального некроза, местами трансформирующиеся в кисты (рис. 3). Флуоресценция, вызванная аргоновым лазером (X 488 пш), обнаружила неоднородное распределение неопластических элементов в паренхиме опухоли и тенденцию к их миграции в прилежащие ткани (рис. 4).
Средняя продолжительность жизни животных контрольной группы составила 27,23±5,82 дня с момента операции (рис. 5). Животные быстро теряли массу тела (рис. 6), были вялыми, не проявляли интереса к событиям, происходящим в клетке, отказывались от еды, неохотно пили. Попытка взять животное в руки или осторожное прикосновение к вибриссам сопровождались пронзительным визгом. Неврологическая симптоматика нарастала быстро. Не грубые симптомы в виде птоза, тремора и неглубоких парезов конечностей быстро сменялись параличами, сопровождаемыми появлением на стороне опухоли экзофтальма с последующим развитием комы и дыхательных нарушений, что очевидно было обусловлено дислокационным синдромом. В свою очередь ложно оперированные животные не обнаружили значимых изменений массы тела и функционального статуса и благополучно дожили до конца эксперимента.
Средняя продолжительность жизни животных группы «темозоламид» составила 46,2±3,6 дней с момента начала эксперимента (рис. 5). Животные этой группы не обнаруживали принципи-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕПАРАТА... | 55
альных различий в показателях массы тела по сравнению с контролем (рис. 6), неохотно принимали пищу и были очень вялыми. Общее состояние животных было менее тяжёлым, характеризовалось большей стабильностью и менее резким развитием тяжелых неврологических нарушений. Мозговая симптоматика проявлялась в виде двустороннего полуптоза, негрубых спастических парезов конечностей в сочетании с судорожными подергиваниями лапок. Заторможенность сменялась эпизодами возбуждения в виде манежных движений в пределах клетки, что свидетельствовало о поражении одного из полушарий. Картина морфологических изменений, выявляемых при исследовании головного мозга животных, выбывших из эксперимента, не отличались от таковой в контрольной группе.
Средняя продолжительность жизни животных с глиомой С6, получивших трансплантацию препарата мобилизованных стволовых клеток, составила 49,56±1,94 дней с момента начала эксперимента. Эти показатели достоверно отличаются от крыс контрольной группы, однако не обнаруживают значительных различий по сравнению с группой животных, получивших темозоламид. Неврологическое обследование, проводимое в ходе эксперимента, выявляло негрубые неврологические симптомы: снижение роговичного рефлекса, птоз и экзофтальм на стороне опухоли, снижение сгибательных и хва-
тательных рефлексов, увеличение времени реакции на световые и звуковые раздражители, замедление при тесте встряхивания головы. Эти животные длительное время оставались более активными по сравнению с таковыми группы контроля, не отказывались от еды и не обнаруживали значительной потери массы тела.
Морфологическое исследование выявляло объемное образование с нечеткими границами и участками инвазии в вещество мозга.
Имплантированные клетки визуализировались как в области введения, так и на некотором расстоянии от нее. Клетки имели шаровидную форму и не образовывали отростков (рис. 7; 8). Очевидно, в процессе роста глиомы они мигрировали вслед за неопластическими клетками в паренхиму мозга, и возможно, как-то взаимодействовали с ними. На 30 день исследования воздействие лазера (X 650 пт) не взывало флуоресценции трансплантированных клеток, что, возможно, связанно с их гибелью, дифференцировкой или вовлечением в опухолевый процесс. Продолжительность жизни животных, получивших химиотерапию с последующим введением препарата мобилизованных стволовых клеток, составила 62,8±4,85 дня, что достоверно выше подобного показателя в контроле и в группе «темозоламид».
Рис. 9. Объем опухолевого узла, мм3
Животные не обнаруживали значительной потери массы тела, длительно сохраняли активность и не отказывались от еды. Неврологическое исследование выявляло негрубые неврологические симптомы с последующим резким развитием комы и витальных нарушений. Объём опухоли у экспериментальных животных существенно различался (рис. 9). Наименьшее значение объёма глиомы выявлено у крыс, получивших темозоламид, -115,76±16,25 мм3 и у животных группы «темозоламид + клетки» - 114,74±5,54 мм3. Это значение были достоверно (р<0,05) меньше размеров неопластического узла в контрольной группе 202,09±39,72 мм3, и существенно меньше, чем в группе крыс, получавших только клеточную терапию, 182,72±15,96 мм3.
Обсуждение
С позиций антагонистического взаимоотношения ОСК и здоровых НСК развитие опухоли в головном мозге следует понимать, как результат локального преобладания и функционального доминирования СК неопластического вида. Культура глиомы С6 имеет 87,24 % СБ133+ ОСК [35], это её
стратегическое преимущество перед другими моделями инвазивных глиом. Трансплантация клеток глиомы линии С6 приводит одномоментному срыву механизмов ауторегуляции тканевого гомеостаза в мозге крысы, количественное преимущество позволяет ОСК быстро сформировать сосудистую, лимфатическую и нейральную сети, оптимизировать метаболизм и беспрепятственно, с максимальной скоростью запустить инвазивные процессы, что объясняет тяжесть состояния и высокую смертность животных в контрольной группе.
Темозоламид достоверно уменьшает объем глиомы, что было доказано в нашем эксперименте и соответствует данным литературы [32]. Цитото-регуляторное действие препарата в отношении опухолевых клеток редуцирует объем опухолевого узла, но резко усиливает гипоксию, что очевидно, способствует выброске хемокинов, индуцирующих процессы направленной миграции СК в опухолевый очаг. Появление такого фактора как мигрировавшие в очаг нормальные СК, резко смещает равновесие в противоположную сторону, что объясняет увеличение продолжительности жизни экспериментальных животных - главного критерия компенсации в данной системе.
Трансплантированные ГСК способны замедлять интенсивность пролиферации опухолевых клеток, что делает их восприимчивыми к регуля-торным сигналам апоптоза и аутофагии. Активизация рецепторов TNF, NGFR, CARI, TRAIL, EGFR, IGF1R, CD 95 и трансмембранных белков DR3, DR4, RD5 при взаимодействии с ГСК индуцирует в опухолевых клетках апоптоз [14]. При совместном культивировании опухолевых клеток с ГСК в среде накапливается циклины E, D2, что блокирует пролиферацию опухолевых клеток в фазе G0/G1 [6; 32]. Смерть клеток глиомы С6 при взаимодействии с ГСК может быть вызвана нарушением внутриклеточного гомеостаза ионов кальция, а инструктивный специфический сигнал передан через щелевые межклеточные контакты посредством BMP4 и ин-терлейкина-1 [21]. Нейропластическое действие СК и продукцию биологически активных веществ СК в патологическом очаге также следует отнести к числу механизмов противоопухолевого действия ГСК [23; 29]. Необходимо отметить, что судьба ксе-нотрансплантата в нашем эксперименте была определена изначально. Некоторая степень иммуносу-прессии, вызванная гормонами или цитостатиками, может отсрочить моменты гибели трансплантированных в мозг крысы человеческих клеток. В контексте эксперимента это позволяет рассматривать ГСК как клеточные системы с индуцированным апоптозом. Мы сообщали о возможности развития апоптоза в клетках глиальных опухолей при взаимодействии с НСК и клетками-предшественницами гемопоэза. Эти клеточные системы при совместном культивировании с клетками глиомы С6 и глиобла-стомы U87 индуцируют в них апоптоз и замедляют темпы развития неопластического процесса [21]. Возможно, именно этот механизм редуцирует объем опухолевого узла и улучшает общее состояние
Литература
крыс в ходе эксперимента. Нельзя исключить и того факта, что гибель клеток опухоли активизирует механизмы выживания ОСК, выступает как фактор селекции, отбирающий наиболее агрессивные и резистентные клеточные элементы [26].
Результаты эксперимента позволяют сделать принципиально важный вывод: крысы c глиомой С6, получившие трансплантацию биомедицинского препарата мобилизованных стволовых клеток в сочетании с химиотерапией, живут достоверно (р<0,05) дольше животных, получавших только темозоламид. Таким образом, выживаемость как главный критерий эффективности терапии в онкологии, достоверно увеличивается с использованием клеточной трансплантации. Идентификация механизмов этого явления и разработка более тонких методов и деликатных технологий управления процессами клеточной индукции входят в число приоритетных задач ближайшего будущего. Наши результаты позволяют рассматривать биомедицинский препарат мобилизованных стволовых клеток как перспективный инструмент регуляции и управления неопластическими процессами в глиальной опухоли, что открывает возможность разработки новых стратегий лечения этих нейроонкологиче-ских болезней.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (проект № 14.575.21.0038).
Автор выражает благодарность за методологическую помощь и продуктивное научное сотрудничество сотрудникам Государственного научного центра имени В.П. Сербского, Российского онкологического научного центра имени H.H. Блохина, клиники восстановительной и интервенционной неврологии «Нейровита».
1. Алексеева И.С., Кулаков A.A., Гольдштейн Д.В. и др. Результаты клинико-экспериментального исследования по использованию комбинированного клеточного трансплантата на основе мультипо-тентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани для восстановления дефектов костной ткани //Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - T. 11, № 4. - C. 967-69.
2. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Программированная клеточная смерть (апоптоз) // Российский онкологический журнал. - 1996. - №1. - С. 58.
3. Барышников А.Ю. Взаимодействие опухоли и иммунной системы организма // Практическая онкология. - 2003. - Т. 4, № 3. - С. 127-130.
4. Барышникова М.А., Грищенко Н.В., Бурова О.Н. и др. Роль CD95/Fas рецептора в индукции апоптоза противоопухолевыми препаратами // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - T. 13, № 3. -C. 9-14.
5. Боценовский В.А., Барышников А.Ю. Молекулы клеточной адгезии // Успехи современной биологии. - 1994. - Т. 114, № 6. - С. 741.
6. Брюховецкий И.С., Брюховецкий A.C., Мищенко П.В., Хотимченко Ю.С. Роль системных механизмов миграции и хоуминга стволовых клеток в развитии злокачественных опухолей центральной нервной системы и разработке новых методов противоопухолевой терапии // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - T.12, № 4. - C. 3-12.
7. Брюховецкий A.C., Шевченко В.Е., Чехонин В.П. и др. Сравнительное протеомное картирование опухолевых стволовых клеток, выделенных из глиобластомы линии U87, нейрональных стволовых и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека: от каталогизации клеточных белков к инновационной парадигме протеом-основанной клеточной терапии опухолей // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2013. - T. 8, № 2. - C. 85-92.
8. Брюховецкий И.С. Травма спинного мозга: клеточные технологии в лечении и реабилитации. - M.: Практическая медицина, 2010. - 341 с.
9. Горбунова В.А., Манзюк Л.В., Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю. Лизомустин - отечественный препарат из группы производных нитрозомочевины для лечения меланомы кожи // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 1. - С. 55-6.
10. Грищенко Н.В., Барышникова М.А., Полозкова А.П. и др. Липосомальные противоопухолевые препараты не используют CD95-завиcимый сигнальный путь апоптоза // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 1. - С. 37-42.
11. Дмитриева М.В., Оборотова H.A., Санарова Е.В. и др. Наноструктурированные системы доставки
противоопухолевых препаратов // Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - Т. 11, № 4. - С. 21-7.
12. Лихванцева В.Г., Оборотова Н.А., Когония Л.М. и др. Первый опыт применения аранозы в лечении увеальных меланом // Российский биотерапевтический журнал. - 2005. - Т. 4, № 3. - С. 34-9.
13. Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Липосомальные лекарственные формы в клинической онкологии // Успехи современной биологии. - 2009. - Т. 121, № 5. - С. 464.
14. Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е. Межклеточные взаимодействия. M.: Медицина, 2003. - 288 с.
15. Пальцев М.А., Смирнов В.Н. Терапевтический потенциал клеток пуповинной крови при негематологических заболеваниях. - М. ОАО Издательство «Медицина», 2011. - 176 с.
16. Уласов И.В., Каверина Н.В., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. Антиглиомная аденовирусная вироте-рапия: механизм, регуляция и клинические перспективы // Российский биотерапевтический журнал.
- 2014. - Т. 13, № 2. - С. 11-8.
17. Уласов И.В., Каверина Н.В., Барышников А.Ю. Роль сурвивина в диагностике и терапии опухолей головного мозга // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 3. - С. 71-6.
18. Barth R.F., Kaur B. Rat brain tumor models in experimental neuro-oncology: the C6, 9L, T9, RG2, F98, BT4C, RT-2 and CNS-1 // J. Neurooncol. - 2009. - 94(3). - P. 299-312.
19. Dong Y., Han Q., Zou Y. et al. Long-term exposure to imatinib reduced cancer stem cell ability through induction of cell differentiation via activation of MAPK signaling in glioblastoma cells // Mol Cell Biochem.
- 2012. - 370(1-2). - P. 89-102.
20. Eimer S., Dugay F., Airiau K. et al. Cyclopamine cooperates with EGFR inhibition to deplete stem-like cancer cells in glioblastoma-derived spheroid cultures // Neuro Oncol. - 2012. - 14(12). - P. 1441-51.
21. Grobben B., De Deyn P.P., Slegers H. Rat C6 glioma as experimental model system for the study of glioblastoma growth and invasion // Cell Tissue Res - 2002. - 310(3). - P. 257-70.
22. Hirst T.C., Vesterinen H.M., Sena E.S. et al. Systematic review and meta-analysis of temozolomide in animal models of glioma: was clinical efficacy predicted? // Br J Cancer. - 2013. - 108(1). - P. 64-71.
23. Hou L., WangX., Zhou Y. et al. Inhibitory effect and mechanism of mesenchymal stem cells on liver cancer cells // Tumour Biol. - 2014. - 35(2). - P. 1239-50.
24. Hottinger A.F., Stupp R., Homicsko K. Standards of care and novel approaches in the management of glioblastoma multiforme // Chin J Cancer - 2014. - 33(1). - P. 32-9.
25. Louis D.N., Ohgaki H., Wiestler O.D. et al. The 2007 WHO Classifications of Tumors of central nervous system // Acta neuropathol. - 2007. - 114(2). - P. 97-109.
26. Liu J., Zhang Y., Bai L. et al. Rat bone marrow mesenchymal stem cells undergo malignant transformation via indirect co-cultured with tumour cells // Cell Biochem Funct. - 2012. - 30(8). - P. 650-6.
27. Mendiburu-Eligabe M., Gil-Ranedo J., Izquierdo M. Efficacy of rapamycin against glioblastoma cancer stem cells // Clin Transl Oncol. - 2014. - 16(5). - P. 495-502.
28. Nagasawa T. CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) and its receptor CXCR4 // J Mol Med (Berl). - 2014. -92(5). - P. 433-9.
29. Pittenger M.F. Mesenchymal stem cells from adult bone marrow. Methods in molecular biology.// Methods Mol Biol. - 2008. - 449. - P. 27-44.
30. Rovere R.K Bevacizumab as secondline treatment of glioblastoma - worth the effort? // Klin Onkol. - 2014.
- 27(3). - P. 219-20.
31. Swanson L. W. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. 2nd Edition. Amsterdam, Elsvier Science Publishers В. V, 1998.
32. Shen W., Hu J.A., Zheng J.S. Mechanism of temozolomide-induced antitumor effects on glioma cells // J Int Med Res. - 2014. - 42(1). - P. 164-72.
33. Tupper D.E., Wallace R.B. Utility of the neurological examinations in rats // Acta Neurobiol Exp (Wars). -1980. - 40(6). - P. 999-1003.
34. Tamura K., Aoyagi M., Ando N. et al. (Expansion of CD 133-positive glioma cells in recurrent de novo glioblastomas after radiotherapy and chemotherapy // J. Neurosurg. - 2013. - 119(5). - P. 1145-55.
35. Shen G., Shen F., Shi Z. et al. Identification of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line and the limitation of current identification methods // In Vitro Cell Dev Biol Anim. - 2008. - 44(7). - P. 280-9.
36. Victorov I.V., Prass K., Dirnagl U. Improved selective, simple, and contrast staining of acidophilic neurons with vanadium acid fuchsin // Brain Res. Protoc. - 2000. - 5. - P. 135-39.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ГСК (HSCs) - гемопоэтические стволовые клетки (Hematopoietic stem cells)
МТБ (MGB) - мультформная глиобластома (Glioblastoma multiforme)
МРТ - магнитно-резонансная томография
ОСК - опухолевые стволовые клетки
СК - стволовые клетки
НСК - нейральные стволовые клетки
