CC BY
24
ВЕСТНИК ПНИПУ
2022
Химическая технология и биотехнология
№ 4
DOI: 10.15593/2224-9400/2022.4.02 УДК 615.324
Научная статья
А. Г. Волков
Пермский медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера, Пермь, Россия
И.С. Безматерных, Л.В. Волкова
Пермский национальный исследовательский политехнический университет, Пермь, Россия
ЭФФЕКТИВНОСТЬ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО БЕЛКОВО-ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА НА КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММАХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Развитие устойчивости микроорганизмов к современным видам антибиотиков является серьезной проблемой здравоохранения. Антимикробные пептиды (АМП) являются перспективным средством в борьбе с патогенами. Они представляют собой амфифильные молекулы, состоящие из 12-50 аминокислотных остатков, с выраженным бактерицидным действием. Для АМП характерны значительные действующие концентрации, низкая избирательность, широкий спектр действия, возникновение цитотоксического эффекта и др. В настоящее время такие пептиды широко используются в производстве новых лекарственных средств.
На фармацевтическом рынке зарегистрировано несколько препаратов, полученных из лейкоцитов крови человека. Существуют как отечественные препараты, такие как «Аффинолейкин», так и зарубежные, такие как «Leukonorm», «Hebertrans» и «Transfer^». Все они имеют идентичную технологию производства, которая начинается с забора крови здоровых доноров с дальнейшим выделением лейкоцитарной массы.
Перспективным методом получения полипептидов из биологических объектов может служить ультразвуковая обработка. При воздействии определенных частот ультразвука на лейкоциты возможно изменение проницаемости клеточной мембраны или полное разрушение клетки, цитоцидный эффект.
В работе была проведена оценка антибактериальной эффективности пептидного комплекса, полученного в результате ультразвуковой обработки лейкоцитов человека in vitro, по отношению к клиническим штаммам микроорганизмов. Для определения антибактериальной активности использовали метод серийных разведений в бульоне. Определяли индивидуальные значения минимальной подавляющей концентрации (МПК) для каждого из исследуемых образцов в отношении тестируемого штамма микроорганизма. Показано, что новый лейкоцитарный белково-пептидный комплекс обладает выраженной антибактериальной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Ключевые слова: антимикробные пептиды, лейкоциты, лейкоцитарный бел-ково-пептидный комплекс, ультразвуковая обработка, клинические штаммы, антибактериальная активность.
A.G. Volkov
Perm State Medical University named after acad. E.A. Vagner, Perm, Russian Federation
I.S. Bezmaternykh, L.V. Volkova
Perm National Research Polytechnic University, Perm, Russian Federation
EFFECTIVENESS OF THE ANTIBACTERIAL LEUKOCYTE PROTEIN-PEPTIDE COMPLEX ON CLINICAL STRAINS OF MICROORGANISMS
The development of resistance of microorganisms to modern types of antibiotics is a serious health problem. Antimicrobial peptides are a promising tool in the fight against pathogens. They are amphiphilic molecules consisting of 12-50 amino acid residues with a pronounced bactericidal effect. AMP is characterized by significant active concentrations, low selectivity, a wide spectrum of action, the occurrence of cytotoxic effect, etc. Currently, such peptides are widely used in the production of new medicines.
Several drugs derived from human blood leukocytes have been registered on the pharmaceutical market. There are both domestic drugs, such as "Affinoleukin", and foreign ones, such as "Leukonorm", "Hebertrans" and "Transferun". All of them have identical production technology, which begins with the collection of blood from healthy donors with further allocation of leukocyte mass.
Ultrasound treatment can serve as a promising method for obtaining polypeptides from biological objects. When exposed to certain ultrasound frequencies on leukocytes, it is possible to change the permeability of the cell membrane or complete destruction of the cell, cytocidal effect.
The work evaluated the antibacterial effectiveness of the peptide complex obtained as a result of ultrasound treatment of human leukocytes in vitro, in relation to clinical strains of microorganisms. To determine the antibacterial activity, the method of serial dilutions in broth was used. Individual values of the minimum suppressive concentration (MPC) were determined for each of the studied samples in relation to the tested strain of the microorganism. It has been shown that the new leukocyte protein-peptide complex has pronounced antibacterial activity against gram-positive and gram-negative bacteria.
Keywords: antimicrobial peptides, leukocytes, leukocyte protein-peptide complex, ultrasound treatment, clinical strains, antibacterial activity.
Серьезной проблемой современного здравоохранения является устойчивость микроорганизмов к различным видам антибиотиков. Вследствие редкого возникновения резистентности в отношении антимикробных пептидов (АМП) у патогенов [1], АМП рассматриваются как перспективное средство в борьбе с ними [2].
Антимикробные пептиды представляют собой маленькие амфи-фильные молекулы, состоящие из 12-50 аминокислотных остатков, с вы-
раженным бактерицидным действием. АМП участвуют во врожденном и приобретенном иммунитете, т.е. являются частью защитного механизма организма животных и человека [3, 4]. Для них характерны значительные действующие концентрации и низкая избирательность, они обладают рядом преимуществ: способны быстро подавлять клетки-мишени, широкий спектр действия, активность в отношении штаммов, резистентных к другим антибиотикам, а также низкая способность клеток к развитию резистентности. Поскольку некоторые антимикробные пептиды обладают цитотоксическим эффектом, наиболее эффективно они могут быть использованы при терапии заболеваний наружных покровов, слизистых -без внутривенного введения [5]. Такие пептиды широко используются для производства новых лекарственных препаратов.
В настоящее время на фармацевтическом рынке существует несколько препаратов, полученных из лейкоцитов крови человека, которые применяются для специфической иммунотерапии условно патогенных инфекций. Это - «Аффинолейкин» (Россия) [6, 7], «Leukonorm» (Германия) [8], «Hebertrans» (Куба) и «Transferyn» (Мексика). Производство всех четырех аналогов идентично и начинается c забора крови у здоровых, не иммунизированных доноров. Из крови выделяют лейкоциты, дезинтегрируют механически, готовят экстракт, из которого диализом, этаноловым фракционированием или ультрафильтрацией получают компоненты с молекулярной массой менее 10 кДа.
Перспективным методом получения полипептидов из биологических объектов может служить ультразвуковая обработка [9, 10]. При воздействии определенных частот ультразвука на лейкоциты возможно изменение проницаемости клеточной мембраны или полное разрушение клетки, цитоцидный эффект [11, 12]. Наиболее важным фактором, определяющим избирательное действие АМП, является различие в составе мембран бактериальных и эукариотических клеток [13, 14].
В Пермском национальном исследовательском политехническом университете проводятся исследования по оптимизации условий воздействия ультразвука на лейкоциты с целью получения новых полипептидных соединений.
Ранее была изучена антибактериальная активность новой биологической субстанции из лейкоцитов человека с использованием музейных штаммов.
Цель данного эксперимента - изучить эффективность белково-пептидного комплекса из лейкоцитов крови человека на клинических штаммах.
Материалы и методы. Объектом настоящего исследования был лейкоцитарный белково-пептидный комплекс (ЛБПК), полученный в результате ультразвуковой обработки донорских лейкоцитов. Выделение белково-пептидных комплексов из лейкоцитов человека проводили по разработанной методике [15].
В качестве исследуемого препарата использовали образец в концентрации 10 мг/мл (0,03г сухого вещества растворяли в 3 мл жидкой питательной среды).
Проведен скрининг на чувствительность к новому ЛБПК клинических штаммов разных родов грамположительных и грамотрицательных бактерий, выделенных на базе городской клинической больницы № 2 им. Ф.К. Граля г. Перми (главный врач В.Н. Грязнов).
Для определения антибактериальной активности использовали метод серийных разведений в бульоне. Тестирование проводили в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах в формате 8*12 лунок. Методом серийных разведений в бульоне Мюллера - Хинтона определяли индивидуальные значения минимальной подавляющей концентрации (МПК) для каждого из исследуемых образцов в отношении тестируемого штамма микроорганизма. Для проведения исследования в подготовленные планшеты осуществляли инокуляцию приготовленной суспензией тестируемых микроорганизмов [16].
Антибактериальное действие катионного пептидного комплекса на штаммы бактерий, выделенных от больных абдоминальной хирургической инфекцией, определяли микрометодом серийных разведений. За минимальную подавляющую концентрацию принимали минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста исследуемого штамма. При постановке методов серийных разведений в бульоне проводили контроль роста на неинокулированной культуре. Контролировали чистоту суспензии микроорганизма, использованной для инокуляции, путем высева на неселективные среды.
Результаты и обсуждение. Предварительный анализ показал, что ЛБПК обладал противомикробной активностью против грамполо-жительных и грамотрицательных бактерий музейных штаммов.
Анализ данных на рис. 1 показал, что большинство штаммов изученных семейств бактерий имели минимальную подавляющую концентрацию, равную 0,43 мг/мл, при этом наибольшую МПК наблюдали в отношении штаммов Ps. Aeruginosa, равной 2,5 мг/мл.
По результатам, представленным на рис. 2, можно сделать вывод о том, что ЛБПК обладает высокой антибактериальной активностью в
отношении клинических штаммов St. aureus, E. coli, St.еpidermidisи средневыраженной активностью в отношении клинических штаммов Ps. aeruginosa.
Рис. 1. Диаграмма зависимости минимальной подавляющей концентрации ЛБПК на клинические штаммы
Рис. 2. Влияние клинического штамма патогенного микроорганизма на уровень минимальной подавляющей концентрации ЛБПК
Полученные результаты могут быть рекомендованы для дальнейшей разработки технологии эффективных природных антибиотиков нового поколения.
Список литературы
1. Bals R. Epithelial antimicrobial peptides in host defense against infection // Respir Res. - 2000. - No. 1 (3). - P. 141-150.
2. Yeaman M.R., Yount N.Y. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance // Pharmacol Rev. - 2003. - No. 55 (1). - P. 27-55.
3. Абатуров А.Е. Катионные антимикробные пептиды системы неспецифической защиты респираторного тракта: дефензины и кателицидины. Де-фензины - молекулы, переживающие ренессанс (часть 2) // Здоровье ребенка. -2011. - Т. 7. - С. 34.
4. Мусин Х.Г. Антимикробные пептиды - потенциальная замена традиционным антибиотикам // Инфекция и иммунитет. - 2018. - № 3. - С. 295-308.
5. Designed antimicrobial and antitumor peptides with high selectivity / J. Hu, C. Chen, S. Zhang, X. Zhao, H. Xu, J.R. Lu // Biomacromolecule. - 2011. -Vol. 12. - P. 3839-3843.
6. Способ получения препарата «Аффинолейкин» для противоинфек-ционной иммунотерапии: пат. 2076715 Рос. Федерации / Мац А.Н., Перепеч-кина Н.П., Воейкова Е С. [и др.]. - № 5008400/14, заявл. 05.11.1991; опубл. 10.04.1997.
7. Аффинолейкин в иммунотерапии атопического дерматита / М.А. Мок-роносова [и др.] // Мед. иммунология. - 2002. - Т. 4, № 4-5. - С. 592-600.
8. Tropical pyomyositis and necrotizing fasciitis / H. Chou [et al.] // Semin. Musculoskelet Radiol. - 2011. - Vol. 15 (5). - P. 489-505.
9. Акопян В.Б. Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами / МГТУ им. Н.Э. Баумана. - М., 2005. - 224 с.
10. Акопян В.Б., Ершов Ю.А., Щукин С.И. Ультразвук в медицине, ветеринарии и биологии: учеб. пособие. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: Юрайт, 2017. - 223 с.
11. Волкова Л.В., Гришина Т. А., Волков А.Г. Фракционный состав лейкоцитарного лизата и его биологические свойства // Современные проблемы науки и образования. - 2019. - № 1. - С. 35.
12. Гришина Т.А., Волков А.Г., Волкова Л.В. Цитотоксичность и токсикологическая характеристика нового лейкоцитарного полипептида // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2020. -Т. 23, № 5. - С. 3-8.
13. Овчинникова Т.В. Структурно-функциональное исследование природных пептидных антибиотиков: автореф. дис. ... д-ра хим. наук. - М., 2011. - 77 с.
14. Шамова О.В. Молекулярно-клеточные основы реализации биологической активности антимикробных пептидов лейкоцитов: дис. ... д-ра биол. наук. - СПб., 2013. - 343 с.
15. Способ фракционирования лейкоцитарных белков: пат. 2737730 Рос. Федерации / Гришина Т.А., Волкова Л.В., Волков А.Г. - № 2019114590, заявл. 13.05.2019; опубл. 13.11.2020. Бюл. № 32.
16. МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: метод. указания / Федер. центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. - М., 2004. - 91 с.
References
1. Bals R. Epithelial antimicrobial peptides in host defense against infection. Respir Res. 2000;1(3):141-50.
2. Yeaman MR, Yount NY. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance. Pharmacol Rev. 2003 Mar; 55(1): 27-55.
3. Abaturov A.E. Kationnye antimikrobnye peptidy sistemy nespeci-ficheskoj zashhity respiratornogo trakta: defenziny i katelicidiny. Defenziny -molekuly, perezhivajushhie renessans [Cationic antimicrobial peptides of the system of nonspecific protection of the respiratory tract: defensins and cathelicidins. Defensins are molecules undergoing a renaissance (part 2)]. Zdorov'e rebenka. 2011. vol. 7. pp. 34.
4. Musin H.G. Antimikrobnye peptidy - potencial'naja zamena tradicionnym antibiotikam [Antimicrobial peptides are a potential replacement for traditional antibiotics]. Infekcija i immunitet. 2018. no.3.
5. J. Hu, C. Chen, S. Zhang, X. Zhao, H. Xu, J.R. Lu Designed antimicrobial and antitumor peptides with high selectivity. Biomacromolecule. 2011. V. 12. P.3839-3843.
6. Mats A.N., Perepechkina N.P., Voeikova E.S. i dr. Sposob polucheniia preparata «Affinoleikin» dlia protivoinfektsionnoi immunoterapii [Method of preparation of the drug "Affinoleukin" for anti-infectious immunotherapy]. Рatent Rossiiskaia Federatsiia no. 5008400/14 (1997).
7. M.A. Mokronosova [et al.] Affinolejkin v immunoterapii atopicheskogo dermatita [Affinoleukin in immunotherapy of atopic dermatitis]. Med. Immune-logija. 2002. vol. 4, no. 4-5. pp. 592-600.
8. H. Chou [et al.] Tropical pyomyositis and necrotizing fasciitis Semin. Musculoskelet Radiol. 2011. Vol. 15 (5). P. 489-505.
9. Akopjan V.B. Osnovy vzaimodejstvija ul'trazvuka s biologicheskimi ob"ektami [Fundamentals of ultrasound interaction with biological objects] / red. S. Shhukin. Moscow: Bauman Moscow State Technical University, 2005. 224 p.
10. Akopjan V.B., Ershov Ju.A., Shhukin S.I. Ul'trazvuk v medicine, veterinarii i biologii [Ultrasound in medicine, veterinary medicine and biology]: uchebnoe posobie dlja bakalavriata i magistratury / Pod red. S.I. Shhukina. 2-e izd., ispr. i dop. Moscow: Jurajt, 2017. 223 p.
11. L.V. Volkova, T.A. Grishina, A.G. Volkov Frakcionnyj sostav lejkocitarnogo lizata i ego biologicheskie svojstva [Fractional composition of leukocyte lysate and its biological properties] . Sovremennye problemy nauki i obrazovanija. 2019. no. 1.
12. T.A. Grishina, A.G. Volkov, L.V. Volkova Citotoksichnost' i toksiko-logicheskaja harakteristika novogo lejkocitarnogo polipeptida [Cytotoxicity and toxico-logical characteristics of a new leukocyte polypeptide]. Voprosy biologicheskoj, medicinskoj i farmacevticheskoj himii- 2020. vol. 23, no. 5. pp. 3-8.
13. Ovchinnikova T.V. Strukturno - funkcional'noe issledovanie prirodnyh peptidnyh antibiotikov [Structural and functional study of natural peptide antibiotics]: Doctor's degree dissertation. Moscow, 2011. 77 p.
14. Shamova O.V. Molekuljarno-kletochnye osnovy realizacii biologicheskoj aktivnosti antimikrobnyh peptidov lejkocitov [Molecular and cellular bases of realization of biological activity of antimicrobial peptides of leukocytes]: Doctor's degree dissertation. S.-Peterburg, 2013. 343 p.
15. Grishina T.A., Volkova L.V., Volkov A.G. Sposob fraktsionirovaniia leikotsitarnykh belkov [Method of fractionation of leukocyte proteins]. Patent Rossiiskaia Federatsiia no. 2019114590, (2020).
16. MUK 4.2.1890-04 Opredelenie chuvstvitel'nosti mikroorganizmov k antibakterial'nym preparatam. Metodicheskie ukazanija. [Determination of the sensitivity of microorganisms to antibacterial drugs. Methodical instructions.]
Об авторах
Волков Александр Геннадьевич (Пермь, Россия) - кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры «Фармакология» Пермский медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера (614000, г. Пермь, ул. Куйбышева, 39, e-mail: [email protected]).
Безматерных Ирина Сергеевна (Пермь, Россия) - студент бакалавриата кафедры «Химия и биотехнология» Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, e-mail: [email protected]).
Волкова Лариса Владимировна (Пермь, Россия) - доктор медицинских наук, профессор кафедры «Химия и биотехнология» Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29; e-mail: [email protected]).
About the authors
Alexander G. Volkov (Perm, Russian Federation) - Ph.D. in Medical Sciences, Senior Lecturer of the Department of Pharmacology, Perm State Medical University name acad. E.A. Vagner (39, Kuibyshev Str., Perm, 614000, e-mail: [email protected]).
Irina S. Bezmaternykh (Perm, Russian Federation) - Candidate of the Department of Chemistry and Biotechnology, Perm National Research Polytechnic University (29, Komsomolsky av., Perm, 614990).
Larisa V. Volkova (Perm, Russian Federation) - Doctor of Medical Sciences, Professor of the Department of Chemistry and Biotechnology (29, Komsomolsky av., Perm, 614990; e-mail: [email protected]).
Поступила: 09.11.2022
Одобрена: 23.11.2022
Принята к публикации: 15.12.2022
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов равноценен.
Просьба ссылаться на эту статью в русскоязычных источниках следующим образом:
Волков, А.Г. Эффективность антибактериального лейкоцитарного белково-петидного комплекса на клинических штаммах микроорганизмов / А.Г. Волков, И.С. Безматерных, Л.В. Волкова // Вестник ПНИПУ. Химическая технология и биотехнология. - 2022. - № 4. - С. 17-25.
Please cite this article in English as:
Volkov A.G., Bezmaternykh I.S., Volkova L.V. Effectiveness of the antibacterial leukocyte protein-peptide complex on clinical strains of microorganisms. Bulletin of PNRPU. Chemical Technology and Biotechnology, 2022, no. 4, pp. 17-25 (In Russ).
