CC BY
17
УДК 578.81
Науменко О.В., © к.т.н., старший науковий ствроб1тник ([email protected]) 1нститут продоволъчыхресурав НААН Украшы, м.Кшв
ДОСЛ1ДЖЕННЯ ВПЛИВУ ПОМ1РНИХ ФАГ1В НА ПРОМИСЛОВ1 ШТАМИ МОЛОЧНОКИСЛИХ БАКТЕР1Й
Встановлено умови выявления л1зогенного стану лактобактерш методом хгмгчно! шдукцп, застосовуючы мтомщн С та хлороформ. Проведено скрыншг промысловых штам1в лактобактерш на прысутшстъ пом1рных фаг1в. В1д1брано фагочутлыв1 нел1зогент штамы як тест-культуры для вызначання фаг1в.
Ключое1 слова: бактерюфагы молочнокыслых бактерш, профагы, гндукцгя, мтомщын С, л1зогентстъ.
Вщомо, що залежно вщ реакци росту у бактер1альнш кл1тиш-хазя!ш бактерюфаги розподшяють на дв1 основш категори - в1рулентш або л1тичш бактерюфаги (шфшують та спричинюють л1зис кл1тини-хазя1на), та пом1рш (профаги) або л1зогенш (нев1рулентш) бактерюфаги (не л1зують бактер1ального хазяша, а вбудовують сво! геноми у його хромосому). В1рулентш фаги еволюцюнують ¿з одного виду в шший, I кнуе ¿мов1ршсть, що саме ДНК пом1рних фапв сприяе еволюци фапв в цшому [1]. Явище л1зогени у молочних стрептокоюв було доведено ще у 1949 рощ. 3 того часу проведено цший ряд дослщжень, яю довели, що бшьшкть штам1в молочнокислих бактерш, яю використовувались у заквасках кисломолочного виробництва, були л1зогенними [2]. Л1зогешя також була продемонстрована в ¿золят1в лактобактерш, видшених ¿з комерцшних мультиштамових заквасок [3] таз непастеризованого молока [4].
Дослщження л1зогенного стану лактобактерш е вкрай необхщним для встановлення можливост1 1х застосування у бютехнолопях ферментованих молочних продукпв, оскшьки таю культури е потенцшним джерелом накопичення фапв на виробництвг Якщо до складу заквашувально! композици залучено л1зогенний штам, то в1рогщшсть того, що вившьнеш фаги будуть шфжувати ту чи шшу чутливу до них культуру закваски, е дуже високою. У результат! буде порушено сшввщношення м1ж компонентами закваски, або взагал1 втрачено певну чутливу культуру, як наслщок, ферментацшний процес буде мати неконтрольований характер [5].
Пом1рш фаги можуть бути спонтанно активоваш у кл1тинах молочнокислих бактерш, однак, частше це вщбуваеться внаслщок впливу певного ф1зико-х1м1чного фактору, наприклад: хлороформу, м1томщину С, ультрафюлетового випромшювання чи пщвищення температури. Вившьнення пом1рних фапв можна простежити за л1зисом кл1тин та дослщженням за допомогою електронно! мжроскопи або ж розмноженням фагу на шдикаторних штамах. 1снуе вщмшшсть м1ж результатами, отриманими за використання
© Науменко О.В., 2012
327
р1зних метод1в ¿ндукци профапв, так само, як i м1ж р1зними методами спостереження за р1внем ¿ндукцп пом1рних фапв. Так, Reyrolle J. показав, що найнижчий р1вень л1зогени був спричинений л1тичним ростом пом1рних фапв на шдикаторних штамах [6]. А найбшьший р1вень л1зогенп (80%) спостер1гали задопомогою електронно! мжроскопи [7].
Метою роботи було дослщити л1зогенний стан промислових штам1в лактобактерш.
Матер1али та методи. Об'ектами дослщжень були чист1 культури молочнокислих бактерш вид1в Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, L. lactis ssp. lactis bv. diacetilactis, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium з колекци промислових культур вщдшу бютехнологи IUP. Наявшсть л1зогенного стану лакобактерш дослщжували двома методами: 1) обробкою бактер1ально! суспензи хлороформом (1:10) упродовж 30 хв. Оброблеш кл1тини витримували у термостат! за 30 °С (для мезофшьних бактерш) або 37 °С (для термофшьних бактерш) упродовж 1,5 год, пот1м осаджували центрифугуванням за 3000 об/хв упродовж (15±5) хв i дослщжували надосадову рщину на наявшсть фапв методом подвшного агару з 10 мМ СаС12 [8]; 2) шдукщею профапв м1томщином С згщно з [9]. Для цього 2% (17 годинно!) бульйонно! культури вносили до 40 см3 гщрол1зованого молочного бульйону та культивували за оптимально! температури росту упродовж 3-4 год для отримання бактер1ально! суспензи з оптичною густиною 0,1-0,2 од. (екстинцш суспензи визначали на фотоелектроколориметр1 КФК-3 у кювет1 3,0 мм за А=600 нм). Пот1м пщготовану культуру розливали у дв1 проб1рки по 10 см3 - контрольну i дослщну. До дослщно! проб1рки додавали 2 мкг/см3 м1томщину С для шдукцп пом!рних фапв. Дослщну та контрольну проб1рки переносили до термостату та продовжували культивування бактерш, щогодини перев1ряючи змшу оптично! густини бактер1ально! суспензи упродовж 3-4 годин. У pa3i значного зменшення оптично! густини у дослщнш npo6ipn;i пор1вняно з контрольною, вважали таку культуру л1зогенною. Вмкт дослщно1 проб1рки дослщжували на наявшсть бактерюфага двошаровим методом. Реестрували наявшсть чи вщсутшсть зон л1зису тест-культури - так званих негативних колонш. Визначення титру фапв - за кшькютю негативних колонш, виражали у БУО/см3. Стшкють культур до бактерюфапв визначали шляхом нанесения л1зат1в бактерюфапв на чашку Петр1 з твердим поживним середовищем на основ! гщрол1зованого молока та дослщжуваною культурою в логарифм1чнш фаз1 росту. У дослщах використовували бактерюфаги титру 107 БУО/см3 об' емом по 0,02 см . Чутливими вважали Ti штами, на газонах яких у мюцях нанесения фагол1зату спостер1гали наявшсть зони л1зису.
Результати дослщження.
Встановлено, що 16% вщ загально! кшькост1 проанал1зованих культур за обробки хлороформом вившьняли профаги. Аналопчш результати отримано Мытник Л.Г. [10], л1зогенний стан було встановлено у 20% дослщжених штам1в лактобактерш теля обробки ix хлороформом. Оскшьки хлороформ руйнуе оболонки кл1тин, це сприяе вившьненню профапв.
328
Для того щоб пщвищити ефектившсть визначення л1зогенних бактерш було використано шший ¿ндукцшний агент, а саме - м1томщин С.
За даними р1зних автор1в, умови проведения дослщжень з визначення л1зогенних бактерш за допомогою м1томщину С е дуже вар1ативними. Так концентрация м1томщину коливаеться вщ 0,1 до 5 мкг/см3 [11], термш обробки -вщ 20 хв до 6 год [12] I т.д. Отже, оптимальш умови визначаються експериментально залежно вщ об'екту анал1зу.
Було опрацьовано та визначено оптимальш умови для шдукци профапв лактобактерш задопомогою м1томщину С. Встановлено, що час необхщний для вившьнення фапв у взятих до дослщу штам1в лактобактерш ктотно р1знився. Реакцш зниження оптично! густини бактер1ально! суспензи у результат! л1зису фагами, вивщьненими пщ д1ею м1томщина пор1вняно до контролю без м1томщину, спостер1гали у частини культур уже через 2 год (рис.1) - I група, та через 3 години - у II групи культур (рис.2).
о о
я х
5
е 2
Я
х
у
I-С
О
1
0; 0,6 0,4 0,2 0
г
1 2 3 термш, год
■2145РК —■-2145+МС
2147РБ — А— 2147+МС
0
Рис. 1. Влив мггомщина С на розвиток лактобактерш I групи: Л-л1зогенна культура
329
-С-36Ж ^ 36+МС
— О- Ent.PS - -■-- Е^+МС
2
—Л—6/12Б8
А 816/12+МС — О- 6/10 БЯ
Рис. 2. Влив мгтомщина С на розвиток лактобактерш II групи:
Л-л1зогенна культура
Було встановлено, що через 2 години обробки м1томщином оптична густина бактер1ально! суспензи зменшувалась пор1вняно до контролю на (20-44,9)% та (47,0-53,7)%, вщповщно, у I та II груп культур. Через 3 години шдукщя л1зису пщ вливом м1томщину призводила до зменшення оптично! густини культур вже на (52,0-74,7)% - у I грут, { на ( 70,5-71,2)% - у II грут.
Максимальне зниження оптично! густини фжсували для уЫх культур на 3 годину обробки м1томщином С. Встановлено, що подальше витримування упродовж 4-01 години культвування ютотно не вливала на шдукцш профапв як для I, так 1 для II груп культур (рис.3).
0
1
4
0
4
5
330
□ 2год ВЗгод Шгод
Рис.3 1ндукщя л1зису культур пщ ВЛИВОМ МГГОМЩИНу, за 100% брали оптичну густину иеоброблеио1 культури
Наступне культивування л1зат1в упродовж 17-24 год не призводило до вщновлення концентрацп кл1тин л1зогенних бактерш (оптична густина не збшьшувалась).
Загалом, у результат! проведенних дослщжень було встановлено, що використання м1томщину С як шдукцшного агента, дозволило пщвищити ефектившсть виявлення л1зогенних штам1в у три рази пор1вняно з використанням хлороформу. За таких умов обробки 50% культур вившьнили профаги. Таю результати зб1гаються з даними, отриманими Park С. [13], Cuesta Р. [9], Huggins А. [11], вщповщно, 52; 53 i 60%. За даними Kilic A. [14] теля шдукци м1томщином встановлено л1зогени у 55% зразюв.
Однак е повщомлення i про нижч1 значения шдукци. Так, Lowrie R. визначив, що тшьки 20% з дослщжених культур вившьняли профаги за обробки мггомщином [15], a Heap Н. [16] - 37%.
Л1зати, отримаш вщ ¿ндукованих культур, було протестовано на л1тичну актившеть по вщношенню до колекцшних культур молочнокислих бактерш. Лише для частини л1зат1в було визначено шдикаторш культури, щ дат подано у табл.1. Як видно з табл. 1, три штами, шдуковаш м1томщином С, були чутливими до CBoi'x профапв. Пом1рн1 фаги проявляли л1тичну актившеть щодо 2-3 культур, фагов1 титри варшвали вщ 10-104 БУО/см3.
У велико! частини шдукованих культур спостер1гали в1зуал1зацш л1зису (за зниженням оптично! густини культур), але не було встановлено шдикаторш штами, на яких би профаги репродукувались i утворювали негативш колони у твердому поживному середовищ1 (метод подвшного агару). Можна припустити, що щ фаги були дефектними. Такий ефект описано у po6otí [9].
331
Таблиця 1
Лггичний спектр пом1рних фаПв_
Тест-к-ра Л1зогенн1 культури
81 2145 81 2168 81 36 81 6/10
К МС К МС К МС К МС
812145 - + - + - - - -
812168 - + - + - - - -
812147 - - - - - - - -
8166 - - - - - - - -
812142 - - - - - - - -
81381 - - - + - - - -
812120 - - - - - - - -
8174 - - - - - - - -
812185 - - - - - - - -
8136 - - - - - + - -
816/10 - - - - - - - -
8127 - - - - - ++ - ++
Ы-1 - - - - - - - -
Ы-2 - - - - - - - -
Ь.1-3 - - - - - - - -
Ь.1 6/3 - - - + - ++ - +
Бп1.Р8 - - - - - ++ - +
Ь.сг.12 - - - - - - - -
Ь.1 3/5 - - - - - - - -
10 ^ 0 А ^
Прим1тка: - немае л1зису; +- л1зис 101-2 БУО/см3 ; ++ - тзис 102-4 БУО/см3 ;
К - фшьтрат не1ндуковано! культури; МС-л1зат культури, 1ндуковано1 михэмщином С
Необхщно також наголосити, що культури, визначеш у цш робот1 як л1зогенш, були в той же час фагорезистентними до в1рулентних фапв з колекцп вщдшу бютехнологи 1ПР. I, навпаки, фагочутлив1 культури не мютили профаг1в. На п1дстав1 цього було в1д1брано ¿ндикаторн1 культури S.thermophilus 6/12, S.thermophilus 2/11 , S.thermophilus 2147, E.faecium Б8 для проведения фагового мошторингу.
Висновки.
1. Опрацьовано оптимальш умови виявлення л1зогенних штам1в молочнокислих бактер1й методом х1м1чно! ¿ндукц11: нарощування бактер1ально! культури упродовж 3-4 год для одержання культури у раннш log-фaзi з оптичною густиною 0,1-0,2 од. (А,=600 нм); концентрац1я м1томщина 2 мкг/см3 ;
332
термш обробки 3 години.
2. Проведено скриншг промислових штам1в лактобактерш на присутшсть пом!рних фапв.
3.Ввдбрано фагочутлив1 нел1зогенн1 штами як тест-культури для визначання фапв.
Л1тература
1. Brussow H., Desiere F. Comparative phage genomics and the evolution of Siphoviridae: insights from dairy phages // Mol. Microbiol. - 2001. - Vol.39. -P.213-222.
2. Davidson B.E., Powell I.B., Hillier A.J. Temperate bacteriophages and lysogeny in lactic acid bacteria // FEMS Microbiol. Rev. - 1990. - Vol.7, №1-2. -P.79-90.
3. Labrie S., Deveau H., Lamoureux M., Bissonnette F., Moineau S. Characterization of mesophilic mixed starter cultures used for the manufacture of aged cheddar cheese (abstract) // J. Dairy Sci. - 2000. - Vol.83. - P.620-627.34.
4. Heap H.A., Jarvis A.W. A comparison of prolate and isometric-headed lactic streptococcal Bacteriophages// New Zealand J. Dairy Science Technology. -1980. - Vol.15. - P.75.
5. Гудков A.B. Сыроделие: технологические, биологические и физико-химические аспекты. Под ред. С.А. Гудкова. - М.: ДеЛи принт. - 2003. - 800 с.
6. Reyrolle J., Chopin M.C., Letellier F., Novel G. Lysogenic strains of lactic acid Streptococci and lytic spectra of their temperate bacteriophages // Appl. Environ. Microbiol. -1982. - Vol.43, №2. - P.349-356.
7. Jarvis A. W., Meyer J. Electron microscopic heteroduplex study and restriction endonuclease cleavage analysis of the DNA genomes of three lactis streptococcal bacteriophages // Appl. Environ. Microbiol. - 1986. - Vol.51. - P.566.
8. Адаме M. Бактериофаги. - M.: Мир. - 1961. - 527 с.
9. Cuesta P., Suarez J.E., Rodriguez A. Incidence of lysogeny in wild lactococcal strains // J. Dairy Sci. - 1995. - Vol.78. - P.998-1003.
10. Мытник Л.Г., Беспалова И.А., Тихоненко A.C. Сравнительное изучение умеренных и вирулентных фагов мезофильных молочнокислых стрептококков// Прикладная биохимия и микробиология. - 1975., том 9, вып. 6.-С.819-823.
11. Huggins A., Sandine W.E. Incidence and properties of temperate bacteriophages induced from lactic streptococci// Appl Environ Microbiol.- 1977.-Vol.33, N 1. - P. 184-191.
12. Wiederholt K.M., Steele J.L. Profage curing and partial characterization of temperate bacteriophages from thermolytic strains of Lactococcus lactis ssp cremoris// J. Dairy Sci.-1993.- Vol. 76, N 4. - P. 921-930.
13. Park C., McKay L.L. Induction of profage in lactic streptococci isolated from commercial dairy starter cultures//J.Milk Food Technol. - 1975. - 38. - P.594.
14. Kilic A.O., Pavlova S.I., Wen-ge Ma, Lio Tao. Analysis of Lactobacillus Phages and bacteriocins in American Dairy products and characterization of a phage isolated from yogurt // Apply Environmental Microbiology. - 1996. - Vol. 62, № 6. -
333
P. 2111-2116.
15. Lowrie R. J. Lysogenic strains of group N Lactic Streptococci // Appl. Environ. Microbiol. - 1974. - Vol.27, №1. - P.210-217.
16. Heap H.A., Limsowtin G.K.Y., Lawrence R.C. Contribution of Streptococcus lactis strains in raw milk to phage infection in commercial cheese factories// N.Z.J. Dairy Sci. Technol. - 1978. - Vol.13. - P. 16.
Summary
Conditions for detection of lactobacteria lysogenic state by method of chemical induction using mitomycin C and chloroform were defined. Screening of lactobacteria industrial strains for presence of temperate phages was conducted. Phage-sensitive non-lysogenic strains were selected as test cultures for phages detection.
Рецензент - д.с.-г.н., професор Щсарик О.Й.
334
