CC BY
15
СТОМАТОЛОГ1Я
© Браун Ю. е.
УДК: 616.314.13-085:611-081.41:612.08 Браун Ю. С.
ДОСЛ1ДЖЕННЯ ПРЯМОГО ВПЛИВУ ЕМАЛЕВИХ МАТРИЧНИХ ПРОТЕШ1В НА ОСТЕОГЕНН1 КЛ1ТИНИ-ПОПЕРЕДНИКИ К1СТКОВОГО МОЗКУ IN VITRO
Нацiональна медична академ1я шслядипломно'Г освiти iMeHi П. Л. Шупика (м. КиГв)
Робота е фрагментом НДР 1С НМАПО iм. П.Л. Шупика та е складовою частиною загально! теми на-уково-дослiдноI роботи кафедри терапевтично! стоматологiI НМАПО iм. П. Л. Шупика «Патогене-тичне обгрунтування нових пiдходiв профiлактики та лiкування генералiзованих захворювань тканин пародонта та супутньо! !м патологiI твердих тканин зубiв», номер державно! реестрацiI 01111и002802.
Вступ. Генералiзований пародонтит (ГП) е най-бiльш поширеною патологiею серед хвороб тканин пародонта [3-5,12,15,16], залишаючись i до сьогоднiшнього дня неповнютю вилiковною. Важ-ливою особливiстю цього захворювання е хроыч-ний перебщ який супроводжуеться прогресуючим руйнуванням та втратою перiодонтальних тканин [3,4,16]. При цьому вражаеться альвеолярна юст-ка, перюдонтальна зв'язка та цемент кореня зуба, яю за даними сучасних до^джень [5,13-16] ха-рактеризуються дуже повтьним вiдновленням та регенерацiя яких залежить вщ загоення iнших компонен^в перiодонтального комплексу тканин [3,12,13]. Складнють будови перiодонтальних тканин та !х анатомiчний зв'язок в ходi функцюнуван-ня, обумовлюють складнiсть досягнення бажано! регенераци за допомогою юнуючих сучасних ме-тодiв [3,4,10,11,13,14]. Втрата зуба або груп зубiв у хворих на ГП, залишаеться частим наслщком несвоечасного лiкування та результатом прогре-сування ГП [5,15,16]. Але досягненнями останых десятилiть було показано, що пародонтальна ре-генерацiя може бути досягнута [13,14]. Завдяки створенню умов для кл™н та !х мiкрооточення, якi нагадують протiкання процесу формування пародонтально! зв'язки, стало можливим досягнення регенераци пародонта. Пщ дiею емалевих матричних проте!нiв (ЕМП), в тому числi препарата ЕтСодат [12,16]. Роботами чисельних авторiв показано, що рiзнi типи кл™н, в тому числi i стро-мальнi клiтини-попередники кiсткового мозку, мо-
жуть приймати участь у регенераци пародонта [68,10-14]. Pi3Hi види кгмтин пародонтально! рани мають здатнють до трансформацiI в певнi типи, яю вiдповiдають за ремоделювання та вщновлення ар-хiтектонiки пародонтальних тканин [3,4,12-14,16]. ЕМП мають здатнють хiмiчного впливу на рiзнi типи кттин [11,13,14], а також завдяки прециттаци на кореневу поверхню кореня, вони створюють мiкро-оточення для цементоблас^в, остеобластiв та !х попередникiв [13,14,16]. Однак до тепер е незрозу-мiлим, який з типiв ЕМП шдукуе регенерацiю та якi саме молекулярн механiзми задiянi в цьому про-цесi [9-11,13,14,16]. Пiд час до^дження прямо! дi! ЕМП на людсью остеобласти лiнi! SaM-1 вщ одного пацiента (Keila S. et al., 2004) на строму юсткового мозку стегново! кiстки щура (Mizutani S. et al., 2003) та преостеобластичну лшто клiтин мишей в експе-риментi (He J. et al., 2004), була визначена значна стимуля^я на пролiферацiю клiтин. Однак Rickon J.C. et al. (2005) в своему до^джены при викорис-таннi клiтин альвеолярного паростка, не спостер^ гали ефекту вiд прямо! дм ЕМП на процеси прол^ ферацi!. Проте використання ЕМП при хiрургiчних втручаннях на пародонтi за даними Sculean A. et al. (2014) призводить до регенераци юстково! ткани-ни та сприяе кращому загоенню з вiдновленням м'яких тканин. Наявнють суперечливих даних щодо особливостей впливу Emdogain на остеогеннi про-генiторнi клiтини, стало пiдставою для проведення даного до^дження.
Мета дослiдження. Дослiдити остеошдуктив-нi властивостi прямого впливу Emdogain шляхом впливу на остеогенн кл^ини - попередники юсткового мозку людини - колонiеутворюючi одиницi фiбробластiв (КУОф) ex vivo.
Об'ект i методи дослiдження. Проведен на-уковi дослiдження вiдповiдають морально-етичним принципам Гельсшсько! декларацi!, прийнято! Гене-ральною асамблеею Всесвiтньо! медично! асо^аци
(1964-2000 рр.), КонвенцiI Ради бвропи про права людини та бюмедицину (1997 р.), вiдповiдним по-ложенням ВООЗ, МiжнародноI ради медичних на-укових товариств, Мiжнародного кодексу медично! етики (1983 р.) та законам Укра!ни.
Клонування КУОф кiсткового мозку проводили згщно методики Фрщенштейна О. Я. (1973) [5] в модифкаци Астахово! В. С. (1982) [1]. Для до-слiдження використовували здухвинну спонпозну кiстку, яку брали у соматично здорових па^ен^в поза межами вогнищ запалення та дегенератив-но-дистрофiчних уражень при проведеннi ортопе-дичних хiрургiчних втручань. Забiр юсткового ма-терiалу у всiх па^ен^в проводили пiсля отримання добровiльноI згоди в ходi проведення оперативного втручання по ортопедичним показанням. Забiр матерiалу мав задовольняти вимоги лаборатори та мав мати об'ем не менше 0,1 см3. Процедура забору юсткового матерiалу не спричинювала до-датково! травми у пацiентiв, проводився в умовах операцмно! згiдно загальноприйнято! методики. Забраний матерiал помiщали в контейнер з по-живним середовищем "199". Клонування ССК проводили за стандартних умов протягом 14 дiб без змши культурального середовища у флаконах Ру при температурi 37оС у газовiй сумiшi з 5% вмютом СО2 в атмосферному повiтрi з використанням летально опромшених клiтин кiсткового мозку кроля у якост фiдера. Щiльнiсть експлантаци фiдерних клiтин складала 5Ч105 на 1 см2 дна культурального флакона. За цих умов in vitro в нормi ССК проходять весь цикл диференцтвання - вщ раных попере-дникiв до зрiлих форм, для яких характерна здат-нють до синтезу основно! речовини юстково! ткани-ни з наступною !! мiнералiзацiею.
По закiнченнi термiну клонування (14 дiб), культури фiксували етанолом 96о та фарбували за Романовським - Пмзою. За колонiю приймали скупчення 50 i бтыше стромальних фiбробластiв кiсткового мозку. При наявност меншо! за 50 юль-кост клiтин стромальних фiбробластiв, скупчення кл™н приймали за кластер. Результати оцшювали за показником ефективностi клонування - числом ССК серед 105 ядровмюних клiтин кiсткового мозку.
Для до^дження прямого впливу Emdogain на клонування КУОф юсткового мозку людини було проведено 4 сери експеримен^в ex vivo. I серiя -в культуральний флакон протягом посадки матер^ алу до кл™н юсткового мозку додавали Pref-Gel.
II серiя - в культуральний флакон протягом посадки кл™н юсткового мозку додавали Pref-Gel i Emdogain.
III серiя - в культуральний флакон додавали лише Emdogain. IV серiя - клонування КУОф проводили без додавання будь-яких зазна-чених препара^в, контрольна серiя (табл. 1). В умовах проведених серм експери-мен^в було вирощено 9 екс-периментальних та 6 контр-ольних колонiй.
Регенераторний потен^ал кiстково! тканини оцiнювали згiдно значення показника ефективност клонування КУОф юсткового мозку людини серед 105 ядровмщуючих клiтин (ЕККУОф). Показник ефективностi клонування КОУф оцшювали згщно формули:
ЕККУОф =
K N
X 105
де K - кльксть кoлoнiй, як виросли в культу-ральному флаконi на 105 ступенi; N - кльксть Kni-тин, як були noca^eHÍ в культуральний флакон.
аналiз проводили в програмi
Статистичний «^айвйса».
Результати дослщжень та 'Гх обговорення.
При проведены клонування КУОф юсткового мозку людини бактерiальний чи грибковий прорют не спо-стеркали в жоднiй серií експериментiв. Це означав, що проведений експеримент проведено згщно вимог використано! методики та з дотриманням умов стерильност на вЫх етапах при робот з вталь-ними юстковомозковими клiтинами - КУОф та компонентами експерименту - ш'екцмна форма 24% ЕДТА та ЕтСодат. Результати дослщження наведенi в таблицi 2.
У 1-м та 2-iй групах серií експерименту в 6 випад-ках (66,7%) при додаваннi травильного гелю Рге'ГОе! та комбiнацiI Рге^е! з EmCogain рiст стромальних ф^ бробластiв не спостерiгався, ефективнiсть клонування - ЕККУОф = 0. В культуральних флаконах зустр^ чались лише поодиною стромальнi фiбробласти, яю не утворювали колонiI. Такi результати свщчать про прямий цитотоксичний вплив 24% ЕДТА (Рге'ГОе!) на СКК, яю гинули пiд його прямою дieю. Пiсля додавання вказаного м^мального об'ему ЕДТА (0,2 мл) в культуральний флакон, спостеркалась миттева змiна ко-льору поживного середовища "199". Це в свою чергу свщчить про рiзку змiну рН середовища у флакону так як по хiмiчнiй структурi ЕДТА е кислотною сполукою. Пiсля отриманих змш, протягом всього часу експерименту колiр поживного середовища у флакон не зм^ нювався. Такi змши спричинювали миттеву загибель КУОф та унеможливлювали хiмiчну деактивацiю ЕДТА, що потребуе створення умов аналопчних живому ор-ганiзму. Це доводить прямий пошкоджуючий вплив 24% ЕДТА на вггальы СКК. У 2-й сери експерименту отримали аналопчы результати. Нав^ь в групах при додаваннi Рге'Где! i EmCogain не спостерiгали покра-щення показникiв. Пiсля додавання в культуральний
Таблиця 1.
Характеристика основних екпериментальних груп
Основш експеримен-тальшгрупи Компоненти експерименту в експериментальних групах Тривалють експерименту, умови
I Культуральний флакон з втальними СКК + 0,2 мл 24% ЕДТА Клонування 14 дiб без змши поживного середовища при температурi 37оС у газовм сумш з 5% вмiстом СО2 в атмосферному повiтрi
II + 0,2 мл 24% ЕДТА + 0,15 мл Emdogain
III + 0,15 мл Emdogain
IV + Без додавання будь-яких препара™
Таблиця 2
Результати клонування КУОф в основних групах серп експерименту
Основш групи серГГ експерименту Кшьшсть посажених кл1тин у флакон К1льк1сть кл1тин ф1дера Ктькють колонш, що виросли Ефектив-шстькло-нування
I 9,6х105 2х107 0 0
9,6х105 2х107 0 0
9,6х105 2х107 0 0
II 9,6х105 2х107 0 0
9,6х105 2х107 0 0
9,6х105 2х107 0 0
III 9,6х105 2х107 127 13,23
9,6х105 2х107 151 15,73
9,6х105 2х107 157 16,35
IV 9,6х105 2х107 117 12,19
9,6х105 2х107 108 11,25
9,6х105 2х107 152 15,83
9,6х105 2х107 136 14,17
9,6х105 2х107 62 7,19
9,6х105 2х107 137 14,27
флакон 24% ЕДТА (0,2 мл), спостерталась аналопчна змiна кольору поживного середовища та пiсля посл^ дуючого внесення 0,15 мл ЕтСодат, колiр поживного середовища у культуральному флаконi залишався незмiнним. За даними виробника рН ЕтСодат е луж-ним, з утриманням даного препарату в пародонтвль-нiй ранi протягом 3 тижыв, що може спричинювати вплив на пщтримку рН середовища за рахунок сво!х хiмiчних властивостей [16]. Але через 14 дыв отрима-ли результати аналогiчнi з 1-ю експериментальною групою. Це свщичить про те, що першочергове внесення 24% ЕДТА в культуральний флакон, що iмiтуе етапнiсть внесення препара^в згiдно рекомендацiй виробника при робот на пародонтi, чинить прямий пошкоджуючий вплив на КУОф. Подальше внесення ЕтСодат не спричиняло змЫи кольору поживного середовища. Через 14 дыв не отримали рiст колонм в жодному випадку, що також свщчило про загибель вiтальних кгмтин пiд дiею ЕДТА.
В 3-й груп експеримента рiст КУОф спостер^ гався в уЫх культуральних флаконах (33,3%) з дода-ванням ЕтСода1п та ктькють нових колонiй колива-лась вщ 127 до 157, ЕККУОф складала 13,23-16,35. В середньому з ^е! сери виросли 145 колонм КУОф з ЕККУОф 15,10 ± 0,95 серед 105 ядровмiщуючих кгм-тин. Додавання ЕтСода1п в культуральний флакон спричиняло пщсилення росту втальних КУОф протягом 14 дыв. Щiльнiсть колонiй аС оои!из не в^^з-нялась вiд аналогiчних колонм без додавання пре-паратiв (4 експериментальна група), але ктькють колонм була збтьшеною. Такi данi свщчать про прямий вплив ЕтСодат активнють КУОф, спричинюючи збiльшення числа колонм, а отже його остеоЫдук-тивнi властивостi.
В IV груп (контрольнiй) рiст КУОф спостертав-ся у вЫх культуральних флаконах i кiлькiсть колонiй склала вiд 69 до 152 з ЕККУОф вщ 7,19 до 15,83. В середньому в цм сери виросли 120 колонм КУОф
з ЕККУОф 12,48 ± 1,24 серед 105 ядров-мiщуючих клiтин. Отриман результати свщчать про те, що за умов клонування КУОф без додавання будь-яких препа-ра^в, рют колонiй КУОф вщбувався, але кiлькiсть утворених колонм була меншою порiвняно з ктькютю колонiй КУОф отри-маними пщ дieю Emdogain (III група).
При порiвняннi аd oculus колонiI трьох груп (I, II, III) та контрольно! (IV) не в^^з-нялись одна вщ одно!. Висновки
В 1-й та 2-й експериментальних групах рют стромальних фiбробластiв не спостертався, ЕККУОф=0. В 3-й груп в середньому виросло 145 колонм КУОф, з ЕККУОф 15,10 ± 0,95 серед 105 ядров-мiщующих кгмтин. В контрольнiй групi в середньому виросло 120 колонм КУОф, з ЕККУОф 12,48 ± 1,24 серед 105 ядров-мiщующих клiтин. Ad oculus колони контрольно! (I група) та основних груп (I-III групи) не вiдрiзнялись одна вщ одно!.
Emdogain на 20,8% в порiвняннi з контрольною групою пщвищуе ктькють КУОф у кютково-му мозку, пщвищуючи специфiчну щiльнiсть бага-тошарових колонiй, вказуючи на наявнють в нього остеоiндуктивних властивостей.
Попередн результати проведеного ex vivo до-слiдження показали наявнiсть прямо! ди Emdogain з додатковими складовими на остеогенн кгмтини-попередники кiсткового мозку здухвинно! кiстки лю-дини ex vivo, про що свщчить пщвищення активностi КУОф на 20,8% у порiвняннi з контролем. Пщвищен-ня специфiчно! щiльностi багатошарових колонiй пщ впливом Emdogain вказуе на наявнють у нього ос-теоiндуктивних властивостей. Отриман результати мають значення при проведены регенеративних х^ рургiчних втручань на пародонтг
Перспективи подальших дослщжень Отриманi результати можуть вiдiгравати важ-ливе клiнiчне значення при проведены рiзних типiв хiрургiчних втручань на пародонт, направлених на регенерацiю пародонта. Це в свою чергу свщчить про необхщнють розробки та включення в хiд паро-донтально! операци, етапу додатково! обробки па-родонтально! рани (корiнь зуба, альвеолярна кютка) пiсля внесення ЕДТА, з повним !! видаленням за до-помогою додатково! обробки за допомогою сучас-них ультразвукових приладiв пiсля струменевого промивання. Пюля максимально щадного внесення, необхщним е попередження контакту з сумiжними вiтальними тканинами, особливо кютковою тканиною. Виявлений стимулюючий ефект, отриманий пiсля внесення ЕМП (Emdogain), свщчить про по-зитивну реакцю зi сторони мiтотично! активностi вггальних кiстковомозкових клiтин. Отриманi ре-зультати мають значення для подальшо! розробки та модифкаци iснуючих оперативних методих хiрур-гiчних втручань на пародонтi з урахуванням особли-востей клiтинних взаемовщносин в пародонтальнiй ранi.
Л^ература
1. Астахова В. С. Остеогенные клетки-предшественники костного мозга человека / В. С. Астахова. - К., 2000. - 172 с.
2. Astachova V. S. Comperative characteristics of ksenofiders during cloning of human bone marrow stromal fibroblasts / V. S. Asta-
chova // Bulletin of experiment, biology and medicine. - 1982. - № 17. - Р. 11-113.
3. Bosshardt D. D. Biological mediators and periodon- tal regeneration: a review of enamel matrix proteins at the cel- lular and molecu-
lar levels / D. D. Bosshardt // J Clin Periodontol. - 2008; 35 (Suppl. 8): Р. 87-105.
4. Bosshardt D. D. Hertwig's root sheath, enamel ma- trix proteins, and initiation of cementogenesis in porcine teeth / D. D. Bosshardt,
A. Nanci // Journal of Clinical Periodontology. - 2004. - № 31. - Р. 184-192.
5. Cortellini P. Clinical and radiographic outcomes of the modified minimally invasive surgical technique with and without regenerative
materials: a randomized- controlled trial intrabony defects / P. Cortellini, M. S. Tonetti // J Clin Periodontol. - 2011. - № 38. -P. 365-373.
6. Dacy J. A. Effects of phosphated titanium and enamel matrix derivatives on osteoblast behavior in vitro / J. A. Dacy, R. Spears
[et al.] // International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. - 2007. - № 22. - P. 701-709.
7. Deutsch D. Amelogenin, a major structural protein in mineralizing enamel, is also expressed in soft tissues: brain and cells of the
hematopoietic system / D. Deutsch, A. Haze-Fildelman, A. Blumefeld [et al.] // Eur J Oral Sci. - 2006. - № 114. - P. 183-189.
8. Fong C. D. Expression of amelin and amelogenin in epithelial root sheath remnants of fully formed rat molars / C. D. Fong, L. Ham -
mastrum // Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radio Endodon. - 2000. - № 90. - P. 218-223.
9. Fridenstein A. J. Induction of bone tissue and osteоgenous progenitor cells / A. J. Fridenstein, K. S. Lalikina. - Moskow, "Medi-
cine". - 1973. - 223 p.
10. Galli C. Osteopretegerin and receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand modulation by enamel matrix derivate in human alveolar osteoblasts / C. Galli, G. M. Macaluso, S. Guizzardi [et al.] // Journal of Periodontology 2006. - № 77. - P. 1223-1228.
11. Guida L. In vitro biologic response of human bone marrow stromal cells to enamel matrix derivative / L. Guida, M. Annunziata, F. Carinci [et al.] // Journal of Periodontology 2007. - № 78. - P. 2190-2196.
12. Hagenaars S. Soft-tissue wound healing following periodontal surgery and Emdogain applicaton / S. Hagenaars, P. G. H. Louwerse, M. F. Timmerman [et al.] // J Clin Periodontol 2004. - № 31. - P. 850-856.
13. Hammastrum L. Enamel matrix, cementum development and regeneration / L. J. Hammastrum // Clin Periodontol. - 1997. -№24. - Р. 658-668.
14. Hammastrum L. Periodontal regeneration in a buccal dehiscence model in monkeys after application of enamel matrix proteins / L. Hammastrum, L. Heijl, S. Gestrelius // J Clin Periodontol. - 1997. - № 24. - P. 669-677.
15. Linares A. Guided tissue regeneration - deproteinized bovine bone mineral or papilla preservation flaps alone for treatment of intrabony defects. II: radiographic predictors and outcomes. European Research Group on Periodontology (Ergoperio) / A. Linares, P. Cortellini, N. P. Lang, J. Suvan J. [et al.] // J Clin Periodontol. - 2006. - № 33. - P. 351-358.
16. Sculean A. Healing of human intrabony defects following treatment with enamel matrix proteins or guided tissue regeneration / A. Sculean, N. Donos, P. Windisch [et al.] // J Periodontal Res. - 1999. - № 34. - P. 310-322.
УДК: 616.314.13-085:611-081.41:612.08
ДОСЛ1ДЖЕННЯ ПРЯМОГО ВПЛИВУ ЕМАЛЕВИХ МАТРИЧНИХ ПРОТЁШ1В НА ОСТЕОГЕНН1 КЛ1ТИ-НИ-ПОПЕРЕДНИКИ К1СТКОВОГО МОЗКУ IN VITRO
Браун Ю. е.
Резюме. Комплексне л^вання генерал1зованого пародонтиту II, II-III ступеыв включае проведения xi-рурпчно! фази, яка мае на мет регенера^ю тканин пародонта з тривалою ремiсiею захворювання. Метою даного дослщження було визначити остеогенний потен^ал остеогенних кттин - попередниюв кюткового мозку людини (колоыеутворюючих одинищь фiбробластiв - КУОф) пщ впливом Emdogain ex vivo. Клонування КУОф кюткового мозку проводили згщно методики Фрщенштейна О. Я. (1973) в модифiкацiI Астахово! В. С. (1982). Для дослщження використовували губчасту кюткову тканину. Клонування кштин здмснювалось згщно методики протягом 14 дыв. Для дослщження прямого впливу ЕМП - Emdogain на клонування КУОф кюткового мозку людини було проведено 4 серп експериментв ex vivo. I група - в культуральний флакон протягом посадки матерiалу до кттин кюткового мозку додавали "Pref-Gel". II група - з додаванням "Pref-Gel" i "Emdogain". III група - з додаванням лише "Emdogain". IV група - без додавання будь-яких зазначених пре-паратв (контрольна група). Регенераторний потен^ал кютково! тканини ощнювали згщно значення показ-ника ефективност клонування КУОф (ЕККУОф) кюткового мозку людини серед 105 ядровмщуючих клггин. Статистичний аналiз проводили в програмi "Statistica".
Результати показали, що у I та II групах експерименту в 6 випадках (66,7%) при додаванн травильного гелю Pref-Gel та комб^а^! Pref-Gel з Emdogain рют стромальних фiбробластiв не спостеркався, ЕККУОф = 0. В III груп експеримента рют КУОф спостер^ався в уЫх культуральних флаконах (33,3%) з ЕККУОф = 13,2316,35. В середньому з uieí серп виросли 145 колонм КУОф з ЕККУОф 15,10 ± 0,95 серед 105 ядровмщуючих кттин. В IV груп (контрольна) рют КУОф спостер^ався у вЫх культуральних флаконах з ЕККУОф вщ 7,1915,83. В середньому в ^й сери виросли 120 колонм КУОф з ЕККУОф 12,48 ± 1,24 серед 105 ядровмщуючих кттин. Отриман дан свщчать про наявнють прямого пошкоджуючого впливу на КУОф "Pref-Gel" та наявнють остеощуктивних властивостей у "Amdogain".
Ключовi слова: генералiзований пародонтит, регенера^я, емалевi матричы проте!ни, Emdogain, остео-гены кттини-попередники кюткового мозку людини, остеошдук^я.
УДК: 616.314.13-085:611-081.41:612.08
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЯМОГО ВЛИЯНИЯ ЭМАЛЕВЫХ МАТРИЧНЫХ ПРОТЕИНОВ НА ОСТЕОГЕННЫЕ КЛЕТКИ-ПРЕДШЕСТВЕННИКИ КОСТНОГО МОЗГА IN VITRO
Браун Ю. Е.
Резюме. Комплексное лечение генерализованного пародонтита II, II-III ступени включает проведение хирургической фазы, целью которой является регенерация тканей пародонта с длительной ремиссией заболевания. Целью данного исследования было исследование остеогенного потенциала остеогенных клеток - предшественников костного мозга человека (колониеобразующих единиц фибробластов - КОЕф) под влиянием Emdogain ex vivo. Клонирование КОЕф костного мозга человека проводили согласно методики Фриденштейна А. Я. (1973) в модификации Астаховой В. С. (1982). Для исследования использовали губчатую костную ткань. Клонирование клеток осуществляли согласно методики на протяжении 14 дней. Для исследования прямого влияния ЭМП - Emdogain на клонирование КОЕф костного мозга человека было проведено 4 серии экспериментов ex vivo. I группа - в культуральный флакон на протяжении посадки материала к клеткам костного мозга человека добавляли "Pref-Gel". II группа - с добавлением "Pref-Gel" и "Emdogain". III группа - с добавлением только "Emdogain". IV группа - без добавления каких-либо указанных препаратов (контрольная группа). Регенераторный потенциал костной ткани оценивали согласно значения показателя эффективности клонирования КОЕф (ЭККОЕф) костного мозга человека среди 105 ядросодержащих клеток. Статистический анализ проводили в программе "Statistica".
Результаты показали, что в I и II группах эксперимента в 6 случаях (66,7%) при добавлении травильного геля Pref-Gel и комбинации Pref-Gel с Emdogain, рост стромальных фибробластов не наблюдался, ЭККОЕф = 0. В III группе эксперимента рост КОЕф наблюдался во всех культуральных флаконах (33,3%) с ЭККОЕф = 13,23-16,35. В среднем с этой серии выросли 145 колоний КОЕф с ЭККОЕф 15,10 ± 0,95 среди 105 ядросодержащих клеток. В IV группе (контрольной) рост КОЕф наблюдался во всех культуральных флаконах с ЭККОЕф от 7,19-15,83. В среднем в этой серии выросли 120 колоний КОЕф с ЭККОЕф 12,48 ± 1,24 среди 105 ядросодержащих клеток. Полученные данные свидетельствуют о наличии прямого повреждающего влияния на КОЕф "Pref-Gel" и наличия остеоидуктивных свойств у "Amdogain".
Ключевые слова: генерализованный пародонтит, регенерация, эмалевые матричные протеины, Emdogain, остеогенные клетки-предшественники костного мозга человека, остеоиндукция.
UDC: 616.314.13-085:611-081.41:612.08
THE INVESTIGATION OF DIRECT ACTION OF ENAMEL MATRIX PROTEINS ON OSTEOGENOUS PROGENITOR HUMAN BONE-MARROW CELLS IN VITRO
Braun I. E.
Abstract. Generalized periodontitis (GP) became to be widely spread disease among other types of periodontal diseases, staying until present times as unsolved clinical problem because of completely untreated. The longterm chronic course of the GP became to be one of the main detail that accompanying by progressive loss of periodontal tissues. During this process such significant structures as: alveolar bone, periodontal ligament and root cement are injured by pathological process, whose are characterized by very slow reparation, need very longtime terms for regeneration that depends on condition of neighboring tissues of periodontal wound. The complicity of periodontal tissues structure and their anatomical connections during functioning determine the main problems in reaching aimed regeneration using modern methods. The tooth loss or loss of group of teeth still considered as frequent consequence of not forehanded treatment and as a result of GP further progression. However, according to modern investigations dedicated to periodontal tissues regeneration, it was stated that the periodontal regeneration can be reached successfully. Due to creation of appropriate micro surrounding conditions for cells, that can mimic the course of periodontal ligament formation process and cementogenesis, it became to be possible to reach regeneration of periodontal tissues. This became to be possible under action of enamel matrix proteins (EMD) in form of Emdogain. Plural scientific works of different authors showed that different types of cells including stromal progenitor cells of bone marrow can take part in regeneration of periodontal tissues. EMD are characterized by influencing on different cell types and also due to precipitation on root surface, they combine appropriate micro surrounding for cementoblasts, osteoblasts and their progenitors.
The aim of current study was to investigate the direct action of "Amdogain" on osteogenous progenitor cells -colony-forming fibroblast units (CFFU) of human bone-marrow ex vivo and to evaluate presence of its osteoinductive properties.
Cloning of CFFU of human bone-marrow was provided according to methodic of Fridenshtein O. Y (1973) in modification of Astachova V S. (1982). According to stated methodic, cancellous bone was taken for investigation. Under requested conditions, the investigation of colony growth of GFFU was provided. According to presented study, the investigation of osteogenous potential of GFFU was provided under action of "Amdogain" and "Pref-Gel" that both are main components recommended for usage in regenerative periodontal procedures. The 4 experimental series of CFFU cloning of human bone-marrow were provided: 1st group - with adding of etching gel "Pref-Gel" into feeding solution in cultural flacon; 2nd group - with adding of "Pref-Gel" with "Amdogain" into feeding solution in cultural flacon; 3rd group - with adding of "Amdogain" only into feeding solution in cultural flacon; 4th - without adding of any preparations into feeding solution in cultural flacon (control). The action was evaluated according to
cloning effectiveness of CFFU of human bone-marrow among 105 nucleus-containing cells. 9 experimental and 6 control colonies were cultivated.
The obtained results showed in 1st and 2nd experimental groups the growth of stromal fibroblasts wasn't detected. The effectiveness of CFFU cloning = 0. In 3rd group in the mean 145 colonies of CFFU grew up with cloning effectiveness of 15,10 ± 0,95. In control group in the mean 120 colonies grew up. The cloning effectiveness was 12,48 ± 1,24 among 105 nucleus-containing cells. Ad oculus the colonies from control and investigated groups weren't differ from each other.
The presented investigated revealed that "Pref-Gel" and combination of "Pref-gel" with "Amdogain" completely depresses proliferation and differentiation of CFFU in human bone-marrow ex vivo. These data can show the direct chemical action on vital stromal bone cells due to action of "Pref-Gel" which is 24% EDTA. This chemical component may change pH in feeding solution in cultural flacon, leading to direct chemical stress in vital bone cells and their death. The obtained chemical changes were not enhanced under additional adding of "Amdogain" after into cultural flacon. However, separate adding of "Amdogain" into cultural flacon enhanced on 20,8% in comparison with control group, amount of CFFU colonies in bone-marrow, increasing specific gravity of multilayer colonies, giving evidence about presence of its osteoinductive properties.
Keywords: generalized periodontits, regeneration, enamel matrix proteins, Emdogain, osteogenous progenitor human bone marrow cells, osteoinduction.
Рецензент - проф. Скрипншов П. М.
Стаття надшшла 01.02.2016 року
