CC BY
50КЛІТИННА БІОФІЗИКА CELL BIOPHYSICS
Фізика живого, Т. 20, No2, 2012. С.30-33. © Пацева Д.А.
УДК 576.314
ДОСЛІДЖЕННЯ ЕЛЕКТРОФІЗІОЛОГІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ НИЗЬКОПОРОГОВИХ КАЛЬЦІЄВИХ КАНАЛІВ ТАЛАМІЧНИХ НЕЙРОНІВ ЩУРА, ЩО ЕКСПРЕСУЮТЬСЯ В ООЦИТАХ XENOPUS LAEVIS
Пацева Д.А.
Київський національний університет імені Тараса шевченка, Київ, Україна Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАНУ, Київ, Україна
Надійшла до редакції 25.09.2012
Досліджено електрофізіологічні властивості низькопорогових кальцієвих каналів, експресованих у ооцитах Хепорш ЬаеуІ8. Підтверждена можливість використання ооцитів Хепорш ЬаеуІ8 в якості тестової моделі для дослідження клонованих низькопорогових кальцієвих каналів.
Ключові слова: кальцієві канали Т-типу, ооцити Хепорш ЬаеуІ8.
ВСТУП
Перебіг багатьох важливих фізіологічних процесів в організмі, таких як опосередковування секреції гормонів і нейромедіаторів, клітинна смерть, процеси диференціації клітин, скорочення м'язів та експресія генів залежить від цитоплазматичної концентрації різних іонів в клітині, одним з основних являється Са2+ [1]. Кількість іонів Са2+ всередині клітини контролюється великою кількістю клітинних структур; серед них головну роль відіграють кальцієві канали. Кальцієві канали (КК) є трансмембранними структурами, що за певних умов забезпечують вхід іонів кальцію до цитозолю із зовнішньоклітинного середовища. Кальцієві канали поділяються на два основних класи: лігандкеровані та потенціалкеровані. Головною особливістю потенціалзалежних, або потенціалкерованих, кальцієвих каналів (ПККК) є те, що їх функціональний стан визначається величиною мембранного потенціалу [2]. Ці канали забезпечують зв' язок між внутрішньоклітинною концентрацією іонів Са2+ зі змінами трансмембранного потенціалу плазматичної мембрани [3]. ПККК діють як зв’язуюча ланка між електричними сигналами, що виникають на поверхневій мембрані, та специфічними функціональними реакціями клітин: секрецією, скороченням, активацією генів тощо [4].
Основними властивостями іонних каналів є вибіркова проникність (селективність) для іонів і здатність відкриватися та закриватися при різноманітних впливах на мембрану (так звана ворітна функція). Молекулярна будова ПККК представлена п’ятьма білковими субодиницями: головною - а1 і допоміжними - а2, в, у, 5 [5]. Головною субодиницею ПККК є а1-субодиниця, вона несе більшість функціональних якостей каналу, а саме селективність
провідність, чутливість до мембранного потенціалу та блокуючим агентам.
Усі ПККК розподілено на два типи: високо порогові (ВПКК) та низько порогові (НПКК) кальцієві канали, відповідно до значення граничного потенціалу їх активації [б]/
ПККК Т-типу ( «Т» - від англ. tiny та transient) відносяться до каналів низькопорогових - тих, у яких активація каналів розвивається при деполяризації трохи вище від значення потенціалу спокою(~ -65 mV). За особливостями молекулярної будови та фармакологічних властивостей КК Т-типу поділяються на CaV3.1, CaV3.2, CaV3.3 [У, В]. Канал CaV3.1 сформований a 1G субодиницею, він має найбільш швидкий час відновлення після інактивації, локалізується в клітинах мозку, при цьому бере участь у генерації пачок імпульсів у таламокортикальних нейронах і гострокінцевих хвилеподібних розрядів, опосередкованих Б-рецепторами. Канал CaV3.2 сформований субодиницею a 1н, має найбільш повільний час відновлення після інактивації, широко розповсюджений у печінці та нирках, а також у серці, в нервовій та ендокринній тканинах. Канали CaV3.3 формуються a п-субодиницею і генерують Т-струми, що сприяють підтриманню електричної активності нейронів, так як активуються при слабкій деполяризації, близької до величини ПС, локалізуються у нейронах мозку [9,10].
Тема вивчення НПКК є дуже актуальною сьогодні. Детальне дослідження функціонування даних каналів може надати змогу з'ясувати причини багатьох патологій, наприклад, таких, як хвороба Альцгеймера та епілепсія, а також дати можливість знайти нові шляхи для лікування неврологічних, кардіологічних та ендокринних захворювань.
Метою роботи було з’ ясувати умови для оптимальної регулярної експресії a1G-субодиницi
низькопорогових кальцієвих каналів таламічних нейронів щура і переконатися, що ооцити Xenopus Laevis є ефективною моделлю для дослідження клонованих низькопорогових кальцієвих каналів.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
ДНК плазміда з субклонованою у в рGEM-HEA-векторі aiG-субодиницею таламічних нейронів щура (GenBankTM/EBI, ідентифікаційний номер AF0279B4) була люб’язно надана проф. Е. Пересом-Рісом (Університет штату Вірджинія, США). Окрім ділянки, що містила послідовність, яка кодує aiG-субодиницю, вектор містить ТУ полімеразний промотор, 3'та 5' UTR,а також ген стійкості Afl II до ампіциліну.
Отримання матричної РНК (мРНК) включало певний набор послідовних етапів, внаслідок чого з плазмідної ДНК була отримана мРНК. Були проведенні наступні етапи експерименту:
трансформація, електрофорез ДНК, рестрикція, транскрипція, електрофорез РНК.
Частки яєчника самки шпорцевої жаби Xenopus laevis попередньо наркотизованої 0.1%-им розчином етиламінобензоату, виділяли оперативним шляхом (Рис. В) [15], промивали в стерильному сольовому розчині OR2 наступного складу (у мілімолях на 1 л): NaCl 82,5; KCl 2,0; MgCl2 1,0; HEPES (5,0 (рН = У.5) і розділяли на окремі фрагменти. Після промивання фрагменти яєчника ферментативно обробляли у розчині OR-2 із додаванням колагенази 1А типу (2мг/мл) у термостаті при t=36°C впродовж 40 хв. Після цього зливали розчин ферменту, і промивли клітини 5 разів розчином OR-2 та 3 рази ND-96 (розчин Барта) наступного складу : NaCl (88,0
ммоль/л); KCl (1,0 ммоль/л); NaHCO3 (2,4 ммоль/л); Ca(NO3)2 (0,3 ммоль/л); CaCl2 (0,4 ммоль/л); MgSO4 (0,82 ммоль/л); HEPES (15,0 ммоль/л) (рН=У,5).
Клітини сортували під бінокуляром; неушкоджені ооцити, які знаходились на V-VI стадіях розвитку, відбирали і інкубували при t=18°C на протязі 1 доби перед ін’єкцією. Після проходження 1 доби ооцити інжектували отриманною мРНК та інкубували на протязі 3-4 діб. Ооцити у розчині Барта придатні для експерименту протягом 5-У діб.
Для реєстрації струму та побудови вольт-амперної характеристики експресованих каналів
використовували метод двомікроелектродної фіксації потенціалу
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Отримання мРНК. За допомогою гель-електрофорезу ми тестували ДНК, яку було отримано після трансформації E. то1і та рестрикції виділеної накопиченої пДНК. Результати гель-електрофорезу отриманої ДНК представлено на рис. 1. Як свідчать дані візуалізації зразків ДНК, згідно показникам електрофорезу леддера смуга лінеаризованої ДНК відповідає значенню У kb, як і очікувалося.
Отримані дані ДНК форезу свідчать по те що трансформація пройшла успішно, і накопичений
плазмідний матеріал є набором генів, що кодують aiG-субодиницю таламічних нейронів.
Рис. 1. Фото, отримане в УФ-камері для візуалізації результатів ДНК-форезу:
1 - ДНК з послідовністю, що кодує нормальну alG-субодиницю після рестрикції
2 - пДНК, що кодує послідовність нормальної alG-субодиниці
М - ДНК ladder.
м
6583 Ьр
4981 Ьр 28 S' 3638 bp
2604 bp
1908 bp, 18 S'
1383 bp
955 bp
Рис. 2. Фото, отримане в УФ-камері для візуалізації результатів РНК-форезу:
1-мРНК, що кодує послідовність нормальної аЮ-субодиниці,
2-тотальна мРНК, виділена з таламічних нейронів щура.
Гель-електрофорез було також використано для тестування мРНК, що була отримана в результаті транскрипції лінеаризованої плазмідної ДНК аЮ-субодиниці НПКК таламічних нейронів щурів. В якості ледера було використано тотальну РНК, виділену з таламічних нейронів щура. Відомо, що тотальна РНК при проведенні електрофорезу розділяється на дві смуги, які відповідаються значенням [21]. Результати електрофорезу мРНК представлені на рис. 2.
Візуалізація результатів РНК-форезу свідчать про те, що отримана мРНК є ідентичною мРНК, що кодує аЮ-субодиницю і може бути використана для ін'єкції в ооцити з метою отримання функціональної експресії НПКК.
Результати двомікроелектродної фіксації потенціалу. Ооцити Хепорш іаеуІ8 є зручною тест-
Пацева Д. А.
системою для дослідження експресії генів у біофізиці, фізіології, молекулярній біології. Введення ДНК або мРНК в ооцит дозволяє вивчити їх білкові продукти (в даному експерименті - низькопорогові кальцієві канали, що експресуються). Через незначну експресію в цих клітинах ендогенних потенціалзалежних іонних каналів , вони активно використовуються при дослідженні експресії та властивостей потенціалкерованих кальцієвих каналів. Інжекція в ооцити Xenopus laevis транскрибованої in vitro мРНК до aGl призводила до значної експресії низькопорогових каналів через 4-5 днів після введення мРНК.
Під час виконання експерименту у якості контролю були використані неінжектовані ооцити Xenopus Leavis, які не містили мРНК, і були поміщені
Завдяки отриманим записам змогли переконатись, що ми зареєстрували саме кальцієві струми Т-типу.
Ознакою того, за якою ми визначили, що данні струми є саме НПКК, є залежність форми вольт-амперної характеристики, що ми вимірювали за максимальним значенням барієвого струму у
використовували в якості носія заряду іони барію. Отримали оригінальний запис струмів Ва2+ току через НПКК Са2+ канали. Після оброблення отриманих результатів струму побудували вольт амперні характеристики струмів, нормованих до максимального значення кальцієвого струму.
Компенсацію струмів витоку та початкову обробку отриманих під час експерименту результатів було проведено за допомогою програмного забезпечення Clampfit 8.0 ( “Axon Instruments”, США).
Для побудови графіків вольт амперної характеристики струмів та для їх апроксимації була використана програма Origin 7.5 ( “OriginLab
Corporation”, США).
Дані на ВАХ аппроксимувались рівнянням Гольдмана-Ходжкіна-Катца-Больцмана:
відповідь на ступінчасту деполяризацію, від величини потенціалу на мембрані. Для порівняння та
підтвердження того, що отримані струми є саме Ва-струмами, що протікають через низькопорогові кальцієві канали, були використані оригінальні записи
в розчин Ва 10мМ.. Використовуючи методику двомікроелектродної фіксації потенціалу, було встановлено, що ооцити не мають власного кальцієвого струму, і фіксувались лише ендогенні кальцій-залежні С1—струми. Під час проведення експерименту в підготовлені згідно наведеної методики ооцити Хепорш laevis було інжектовано мРНК, що відповідає за експресію Сау3.1 клонованого НПКК. Після інкубації інжектованих ооцитів на протязі 4-5 діб, безпосередньо перед проведенням електрофізіологічних досліджень, у клітини додатково інжектували буфер ВАРТА. Як відомо, даний буфер використовується для усунення Са-залежних С1- струмів, які вносять шуми при реєстрації струмів через Т-канали. При реєстрації інтегральних струмів через низько порогові канали
і = psz2
VF2 [S]i -[S]0 exp(- zsFV/RT) RT 1 - exp(- zSFV/RT)
(l + exp
1
V - V r *1/2)
к
де Р8 - коефіціент абсолютної проникності
(сантиметри в секунду); z - валентність тестованого катіона Ва (Б), [Б]! и [Б]0 -відповідно їх внутрішня і зовнішня концентрації, I - нормоване пікове значення амплітуди струму при підтримуючому на мембрані потенціалі -У,Я - газова стала , Т - абсолютна температура, Б - константа Фарадея (при кімнатній температурі 25оС, ЯТ/Б дорівнювала 25.7), Vі/2 -потенціал половини активації та к - коефіціент нахилу.
60 мВ
-100
-70
В
v„. мВ
Рис. 3. ВАХ струмів, що переносяться двовалентними катіонами через Сау3.1-канали. А - запис протоколу. Б -усереднене ВАХ (п = 6), нормована до максимального значення кальцієвого струму. В - оригінальні записи струмів, отримані в присутності 10мМ Ва2+ в якості переносника заряду у зовнішньриу розчині. Точки на графику були аппроксимовані рівнянням Гольдмана-Ходжкіна-Катца-Больцмана._______________________________
струмів та їх вольт-амперні характеристики із відомих даних.
Дані реєстрації оригінальних записів струму та характер вольт-амперної характеристики (ВАХ) дають підстави зробити висновок, що в ході проведеного експерименту при використанні рОБМ-НБЛ-вектору було досягнено функціональну експресію Сау3.1 кальцієвих каналів таламічних нейронів щура. Висновки
ВИСНОВКИ
Використання обраних методів молекулярної біології дозволило отримати функціональну експресію а1О-субодиниці низькопорогових кальцієвих каналів таламічних нейронів щура. Завдяки використанню двоелектродної фіксації мембранного потенціалу були зареєстровані інтегральні струми та побудовані вольт амперні характеристики. Аналіз зареєстрованих інтегральних струмів та характер побудованих ВАХ дав підстави вважати, що експресовані канали належать до родини низькопорогових кальцієвих каналів Т-типу. Ооцити Хепорш ЬаеуІ8 є ефективною моделлю для дослідження клонованих низькопорогових кальцієвих каналів. В подальших дослідженнях ми намагатимемося з'ясувати, чи придатна данна система до фармакологічних досліджень.
Література
1. Я. М. Шуба. Основи молекулярної фізіології іонних каналів.
- К.: Наук. Думка, 2010. - 448 с.
2. Perez-Reyes E. Molecular Physiology of Low-Voltage-Activated T-type Calcium Channels.// Physiol Rev. 83: 117-1б1, 2003.
3. Nilius B., K. Talavera, A. Verkhratsky. T-type calcium channels: The never ending story.// Cell Calcium 40 (200б) 81-88.
4. P. Kostyuk, E. Lukyanetz, Ya Shuba Molecular physiology and pharmacology of the calcium channels // Нейрофизиология. — 2002. — 34, N 2-3. — С. 117-120.
5. Lacinova L. Voltage-dependent calcium channels.// Gen Physiol Biophys. 2005 Jun; 24 Suppl 1:1-78.
6. Talavera K., B. Nilius. Biophysics and structure-function relationship of T-type Ca2+ channels.// Cell Calcium 40- (200б)
- 97-114.
7. А.К. Щегловитов, ЯМ. Шуба Натрий-кальциевая
избирательность клонированных кальциевых каналов T-
типа // Нейрофизиология. - 200б. - 38, N 3. - С. 183-192
8. А.К. Щегловитов, А.И. Болдырев, О.П. Любанова, ЯМ.
Шуба Особенности селективности трех подтипов клонированных кальциевых каналов Т-типа //
Нейрофизиология. - 2005. - 37, N 4. - С. 319-329.
9. С.В.Романенко, П.Г.Костюк, О.П.Костюк. Транс-
мембранна кальцієва сигналізація - роль у ноцицепції.// Журн. АМН України. - 2008. - Т. 14, №1. - С. 3-25.
10. Мельников К.Н. Разнообразие и свойства кальциевых каналов возбудимых мембран.// Психофармакол. биол. наркол. - 200б. - Т. б, № 1-2. - С. 1139-1155.
RESEARCH ELECTROPHY SIOLOGICAL PROPERTIES OF LOW-CALCIUM CHANNELS IN THALAMIC NEURONS OF RATWHAT EXPRESSED IN OOCYTES XENOPUS LAEVIS
Patseva D.A.
The electrophysiological properties of low-threshold calcium channels expressed in oocytes of Xenopus Laevis were studied. The use of oocytes Xenopus Laevis as a test model for the study of cloned low-threshold calcium channels was proven.
Keywords: calcium channels, T-type oocytes Xenopus Laevis.
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НИЗКОПОРОГОВЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ ТАЛАМИЧЕСКИХ НЕЙРОННОВ КРЫСЫ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ В ООЦИТАХ ХЕШРШ ЪАЕУШ
Пацева Д. А.
Исследованы электрофизиологические свойства низькопорогових кальциевых каналов, экспрессированных в ооцитах Хепорш Laevis. Показана принципиальная возможность использования ооцитов Хепорш Ьае^ в качестве тестовой модели для исследования клонированных низькопорогових кальциевых каналов.
Ключевые слова: кальциевые каналы Т-типа, ооциты Xenopus Laevis.
