CC BY
103
4. Furchgott, R.E., Zawadzki, J.V. Biology of nitric oxide // Nature. - i9SG. - V. 2SS. - P. 3l3-3l6.
5. Michel J.-B. NO (Nitric oxide) and Cardiovascular Homeostasis. - i999. - Menarini International Industrie Farmaceutiche Riunite. - S.R.l., Paris.
6. Faraci F.M., Heistad D.D. Regulation of the cerebral circulation: role of endothelium and potas-
sium channels // Physiol Rev. - 1998. - Vol. 78 (1). - P. 53-97.
7. Laursen J.B., Rajagopalan S., Galis Z. et al. Role of superoxide in angiotensin Il-induced but not catecholamine-induced hypertension // Circulation. - 1997. - Vol. 95. - P. 588-593.
УДК 615:076.9:59:615.213
ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОСУДОРОЖНОЙ АКТИВНОСТИ И ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРЕПАРАТА С АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИЕЙ
ЛАМОТРИДЖИН
© Лучкина Е.В., Гуреев В.В., Покровский М.В.
НИИ экологической медицины Курского государственного медицинского университета
Сравнительное изучение препаратов "Трилам" производства ОАО "Фармстандарт-Лексредства" и "Ла-миктал" производства "ГлаксоСмитКляйн Фармасьютикалз СА" показало, что препарат отечественного производителя по своим токсическим качествам и противосудорожной активности не отличается от зарубежного аналога.
Ключевые слова: доклиническое исследование, Ламотриджин, токсичность, противосудорожная активность, животные.
PRECLINICAL INVESTIGATING THE ANTICONVULSANT ACTIVITY AND TOXICOLOGICAL PROPERTIES OF A PREPARATION WITH AN ACTIVE SUBSTANCE LAMOTRIGINE
Luchkina E. V., Gureev V. V., Pokrovsky M. V.
SRI of Ecological Medicine of the Kursk State Medical University
The comparative study of the preparations "Trilam" manufactured by JSC "Pharmstandart-Leksredstva" and "Lamictal" manufactured by "GlaxoSmithClain Pharmaceutical SA" has shown that the home-made preparation does not differ from foreign analogue in terms of toxic qualities and anticonvulsant activity.
Key words: preclinical research, Lamotrigine, toxicity, anticonvulsant activity, animals.
Эпилепсия - самое старое из известных на сегодняшний день нарушение функций головного мозга, она сопровождает человеческий род на всем протяжении его существования. Достижения современной фармакологии позволили достичь значительных успехов терапии данного заболевания. Однако требования, предъявляемые к противоэпилептиче-ским препаратам, ставят все новые и новые задачи перед исследователями.
Терапия данного заболевания, нередко, продолжается на протяжении многих лет, поэтому, наряду с высокой эффективностью, препараты должны обладать минимумом побочных эффектов [1].
Одним из препаратов наиболее удовлетворяющим эти требования является Ламотриджин. Его противосудорожный эффект обусловлен главным образом двумя механизмами. Препарат стабилизирует пресинапти-ческую нейрональную мембрану, блокируя вольтажзависимые натриевые каналы [10, 11, 13, 14, 15]. Кроме того, он ограничивает высвобождение возбуждающих нейромедиаторов - глутамата и аспартата [12]. Эффек-
тивность данного препарата доказана применением его в зарубежных клиниках более 10 лет [5, 6, 7, 8, 9].
Длительность лечения и социальноэкономическая обстановка, сложившаяся в стране на протяжении последних 20 лет, делает немаловажным и экономический аспект терапии данного заболевания.
Наиболее перспективным направлением в этой области является создание отечественных генерических аналогов зарубежным наиболее удачным препаратам. Одной из попыток является создание отечественного про-тивоэпилептического препарата, активной субстанцией которого является Ламотри-джин.
В настоящей работе приведены результаты сравнительного исследования противосу-дорожной активности и токсикологических свойств отечественного противоэпилептиче-ского препарата "Трилам" с активной субстанцией ламотриджин производства ОАО "Фармстандарт-Лексредства" и препарата "Ламиктал" производства "ГлаксоСмитКляйн Фармасьютикалз СА" (Польша).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Противосудорожную активность препаратов исследовали на крысах Wistar массой 180220 г и оценивали по результатам проведенного теста максимального электрошока (МЭШ). Через краниальные электроды животные получали электрические стимулы в 220 V, 50 Н длительностью 0,1 с. Используемый показатель - максимальная тоническая экстензия задних конечностей. Для дальнейшего эксперимента отбирались животные с данным явлением. Их рандомизировали на 3 группы. Через 3 дня тест повторяли с животными, которым предварительно за 2 часа вводились препараты или 1% крахмальный клейстер (контрольная группа). Эффект оценивали по уменьшению количества животных с максимальной тонической экстензией задних конечностей.
Исследование острой токсичности проводили на беспородных мышах массой 18-22 г. Препараты вводились внутрижелудочно однократно в объеме 0,1 мл крахмального клейстера на 10 г веса животного в дозах 250 мг/кг, 200 мг/кг, 150 мг/кг. О токсическом действии препарата судили по общему состоянию животных, развитию картины токсических проявлений и смертности. Результаты учитывались в течение двух недель. ЬБ50 рассчитывали методом пробит-анализа.
Эксперименты по изучению субхрониче-ской токсичности проводили на обоеполых крысах Wistar. Масса животных к началу эксперимента составляла 180-220 г.
Через 14 дней после нахождения крыс в виварии в стандартных условиях содержания и кормления определяли массу тела, оценивали общее состояние животных (двигательную активность, поведение, состояние видимых слизистых, кожи, подкожной жировой ткани и волосяного покрова).
Отечественный препарат, как и зарубежный аналог, вводили утром натощак однократно внутрижелудочно в дозах 0,33 и 0,83 таб./кг. Межвидовой расчет доз проводили по Р.У. Хабриеву с соавт. [2], исходя из терапевтической дозы для человека.
Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток во время кормления и
14 суток во время "отсидки", регистрируя клиническую картину. Для характеристики функционального состояния внутренних органов после 14-дневного перорального применения препаратов и после последующей 2-недельной "отсидки" делали развернутый анализ крови и в сыворотке венозной крови определяли ряд биохимических параметров, используемых в токсикологии в качестве маркеров повреждения внутренних органов: общий белок сыворотки крови, мочевину, глюкозу, аспартатаминотрансферазу (АСТ), аланинаминотрансферазу (АЛТ).
Поведенческие реакции, двигательную активность и психоэмоциональное состояние животных оценивали при наблюдении за ними на протяжении всего эксперимента и при проведении теста "открытое поле" на 14 и 28 день. В течение 3 мин. регистрировались такие параметры, как количество пересеченных квадратов, акты дефекации.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При повторном проведении теста МЭШ у животных контрольной группы максимальная тоническая экстензия задних конечностей возникала в 100% случаев. При введении исследуемых препаратов в дозе 0,04 таб./кг (при пересчете соответствует начальной рекомендуемой дозе) количество животных с максимальной тонической экстензией в обеих группах составило 30% (табл. 1). При увеличении дозы вводимых препаратов до
0,16 таб./кг (максимальная рекомендуемая терапевтическая доза) максимальной тонической экстензии задних конечностей у животных обеих группах не наблюдалось.
Таким образом, оба исследуемых препарата обладают одинаковой противосудорожной активностью на модели максимального электрошока.
Проведенные исследования острой токсичности показали, что LD50 препарата "Ла-миктал" составило 233,72±16,8 мг/кг, что соответствует литературным данным. LD50 препарата "Трилам" составило 200±10,07 мг/кг. Результаты более детального анализа с использованием метода пробит-анализа представлены в табл. 2.
Таблица 1
Влияние препарата "Трилам" и "Ламиктал" на возникновение максимальной экстензии задних
конечностей (%, п=10)
^^■^^^.^^Дозировка Препарат ^ 0,04 таб./кг 0,16 таб./кг
Трилам 30* 0*
Ламиктал 30* 0*
Интактные 100 100
Примечание. * - при р<0,05 по сравнению с контролем.
Таблица 2
Исследование ЬБ50 препаратов "Трилам" и "Ламиктал"
Трилам Ламиктал
ЬБ50 200 мг/кг ЬБ50 233,72 мг/кг
Стандартная ошибка ЬБ50 10,07мг/кг Стандартная ошибка ЬБ50 16,8 мг/кг
Нижняя граница ЬБ50 179,4 мг/кг Нижняя граница ЬБ50 199,36 мг/кг
Верхняя граница ЬБ50 220,6мг/кг Верхняя граница ЬБ50 268,08 мг/кг
Таблица 3
Динамика токсических проявления при определении ЬБ50 препарата "Трилам" в сравнении
с препаратом "Ламиктал" (М±т, п=10)
Препарат Двигательные нарушения, (с) Потеря вертикального положения тела, (с) Летальность, (%)
Трилам 250 мг/кг 540±62 3302±571 90
Ламиктал 250 мг/кг 649±72 4635±586 60
Трилам 200 мг/кг 734±57 4253±262 50
Ламиктал 200 мг/кг 954±86 4768±256 30
Трилам 150 мг/кг 836±99 4844±437 10
Ламиктал 150 мг/кг 999±111 4827±407 10
При введении обоих препаратов у животных всех групп отмечались выраженные токсические явления: атаксия, тремор, гипокинезия и ригидность - явления обратимого изолированного паркинсонизма, связанного с угнетением высвобождения глутаминовой кислоты из пресинаптических окончаний нейронов. В дальнейшем животные утрачивали способность поддерживать естественную позу, наступала кома и гибель животного. Проявления интоксикации носили как
четко выраженный стадийный, так и дозозависимый характер (табл. 3).
Приведенные данные позволяют сделать вывод об отсутствии статистически значимой разницы между ЬБ50 препаратов, так как перекрываются не только доверительные интервалы, но и полученное значение ЬБ50 препарата "Трилам" находится в пределах доверительного интервала ЬБ50 препарата сравнения.
При 14-дневном пероральном введении препаратов "Трилам" производства ОАО
"Фармстандарт- Лексредства", "Ламиктал" производства "ГлаксоСмитКляйн Фармась-ютикалз СА" в 2- и 5-кратной терапевтических дозах наблюдается увеличение массы тела крыс, одинаковое во всех изучаемых группах (табл. 4). Более медленное увеличение масса тела животных в период введения препаратов объясняется некоторой травмати-зацией пищевода зондом.
Результаты ежедневного наблюдения за экспериментальными животными свидетельствуют о том, что 14-дневное пероральное введение препаратов "Трилам" и "Ламиктал" в обеих дозах не оказывает влияния на состояние интактных участков кожи, видимых слизистых, подкожной жировой ткани, волосяного покрова.
На протяжении всего эксперимента у крыс в опытах с исследуемыми препаратами, так же, как и у животных контрольной серии, видимые слизистые оставались бледнорозового цвета, были влажными, чистыми, без признаков воспаления. Отсутствовали симптомы бронхита, конъюнктивита и ринита. Шерсть была густой, гладкой и блестящей, признаков очаговой или общей алопеции не зарегистрировано. У всех животных (контрольной и опытных серий) в течение всего периода эксперимента визуально и пальпаторно изменений кожи и подкожной жировой ткани не выявлено. У небольшой части животных, получавших препараты в дозе, в 5 раз превышающей терапевтическую, наблюдались патологические изменения неврологического характера в виде нарушения походки и повышенного мышечного тонуса, что связано со специфическим действи-
ем препаратов. Данные явления стали наблюдаться с 11 дня кормления животных отечественным препаратом и с 12 дня кормления животных препаратом зарубежного производителя через 15 минут после введения.
При проведении теста " открытое поле" было выявлено, что через 14 дней после введения препаратов у животных контрольной группы и групп, получавших препараты в дозе, в 2 раза превышающей терапевтическую, происходит равнозначное снижение двигательной активности, что связано с повышенным внимание к экспериментатору (табл. 5). Более выраженное снижение исследовательской активности происходит у животных, получавших препараты в дозе, в 5 раз превышающей терапевтическую. Данное явление можно объяснить специфическим действием препаратов. К концу периода "отсидки" уровень двигательной активности животных приближается во всех группах к исходному уровню.
На протяжении всего эксперимента количество животных в группах с актами дефекации остается практически неизменным, поэтому можно предположить, что введение исследуемых препаратов в дозах, в 2 и 5 раз превышающих терапевтическую, на протяжении 14 дней и в последующий период " отсидки" не приводит к изменению вегетативных функций.
После 14-дневного перорального введения препаратов "Трилам" и " Ламиктал" в обеих дозах, а также в период "отсидки" не происходило изменения как абсолютных значений, так и относительных гематологических показателей.
Таблица 4
Динамика массы тела животных при исследовании субхронической токсичности препарата "Трилам" производства ОАО "Фармстандарт-Лексредства" (г, М±т, п=6)
Дни Группа І І4 28
Контроль 197,5±6,16 218,ЗЗ±9,97 25З,ЗЗ±8,2З
Трилам 0,ЗЗ таб./кг 200,8З±5,2З 217,5±6,02 248,ЗЗ±8,6З
Трилам 0,8З таб./кг 202,5±5,12 222,5±6,29 249,17±9,87
Ламиктал 0,ЗЗ таб./кг 197,5±5,44 219,17±4,55 256,67±9,01
Ламиктал 0,8З таб./кг 195,8З±6,11 217,5±9,01 25З,ЗЗ±5,4З
Примечание. * - при р<0,05 по сравнению с контролем.
Таблица 5
Показатели двигательной активности и вегетативных функций животных при исследовании субхронической токсичности препарата "Трилам" производства ОАО "Фармстандарт-
Лексредства" (тест "открытое поле") (п=6)
Кол-во пересеченных квадратов, (М±т) Кол-во животных с актом дефекации, %
Сутки ПрепараГ'\^^ І І4 28 І І4 28
Контроль 74,83±2,84 41,17±5,53 55,5±5,4 iGG iGG 83
Трилам 0,ЗЗ таб./кг 66,83+4,57 39,17±4,48 54,83+5,06 iGG 83 iGG
Трилам 0,8З таб./кг 68,83+4,47 * 22,67±3,68 53,5+4,79 83 iGG iGG
Ламиктал 0,ЗЗ таб./кг 69,83+9,68 36,83±4,35 50+5,57 iGG 83 iGG
Ламиктал 0,8З таб./кг 71,83+9,57 * 24,17+2,41 57,83+5,4 iGG 83 83
Примечание. * - при р<0,05 по сравнению с контролем.
Таблица 6
Содержание общего белка, глюкозы и мочевины при исследовании субхронической токсичности препарата "Трилам" производства ОАО "Фармстандарт-Лексредства" (М±т, п=6)
Общ. белок, г/л Глюкоза, тМ/л Мочевина, тМ/л
Дни Группа І4 28 І4 28 І4 28
Контроль 65,05±2,7З 64,42±1,72 4,4З±0,42 5,62±0,44 4,6З±0,З2 4,88±0,46
Трилам 0,ЗЗ таб./кг 66,58±1,08 67,4З±2,24 4,52±0,ЗЗ 5,42±0,9 4,З±0,27 4,98±0,68
Трилам 0,8З таб./кг 65,88±2,08 64,25±1,7З 5,12±0,5 5,ЗЗ±0,З7 4,87±0,48 5,4±0,4
Ламиктал 0,ЗЗ таб./кг 66,1±1,15 62,67±1,74 5,65±0,ЗЗ 5,82±0,42 5,17±0,49 4,8±0,З2
Ламиктал 0,8З таб./кг 68,0З±2,З4 6З,22±2,08 4,98±0,4 5,52±0,42 4,87±0,41 5,18±0,46
Примечание. * - при р<0,05 по сравнению с контролем.
Определение в крови биохимических показателей показало, что средние значения общего белка в сыворотке экспериментальных животных, получавших изучаемые препараты в обеих дозах, практически не отличаются от зарегистрированных в контрольных (табл. 6).
Во время проведения настоящего исследования у экспериментальных животных наблюдались колебания концентрации глюкозы крови, связанные с приемом пищи, однако за границы физиологических норм данный показатель не выходил. Статистически
значимых различий между животными, получавшими изучаемые препараты, и группой контрольных животных зарегистрировано не было (табл. 6).
Данные, приведенные в табл. 6, свидетельствуют о том, что уровень мочевины в крови экспериментальных животных, которым в течение 14-ти дней вводили препарат "Трилам" производства ОАО "Фармстандарт-Лексредства", а также препарат сравнения -"Ламиктал" производства "ГлаксоСмитКляйн Фармасьютикалз СА" в исследуемых дозах, не претерпевает существенных изменений
Таблица 7
Активность АСТ и АЛТ сыворотки крови животных при исследовании субхронической токсичности препарата "Трилам" производства ОАО "Фармстандарт-Лексредства"
(ед/л, М±т, п=6)
Ферменты
АСТ АЛТ
Группа І4 28 І4 28
Контроль 18З,17±8,11 181,67±12,15 112,58±11,52 105±9,29
Трилам 0,ЗЗ таб./кг 164,5±11,84 188±12 107±8,29 104,5±4,46
Трилам 0,8З таб./кг 175,8З±16,6 187,5±15,88 102,67±12,55 99,ЗЗ±6,З5
Ламиктал 0,ЗЗ таб./кг 189,8З±7,46 190,17±19,06 110,ЗЗ±1З,76 ІІ2,ЗЗ±9,99
Ламиктал 0,8З таб./кг 17З,5±1З,91 187±1З,45 109±9,75 104,8З±7,З6
Примечание. * - при р<0,05 по сравнению с контролем.
и находится в пределах физиологических норм.
Исследования активности АСТ и АЛТ показали, что в группах животных, получавших "Трилам" и препарат сравнения, статистически значимого увеличения активности ферментов по сравнению с контролем отмечено не было (табл. 7).
Данные исследования фармакологической активности "Трилам" производства ОАО "Фармстандарт-Лексредства" и "Ламиктал" производства "ГлаксоСмитКляйн Фармась-ютикалз СА" свидетельствуют о соответствии противосудорожной активности препарата отечественного производителя зарубежному аналогу.
Обобщая приведенные экспериментальные данные, можно сделать заключение о том, что при изучении как острой токсичности, так и при длительном пероральном введении (в течение 2-х недель) крысам обоего пола препарат "Трилам" производства ОАО "Фармстандарт-Лексредства" (г. Курск, Россия) проявляет одинаковые токсические свойства, как и препарат сравнения "Ламик-тал" производства "ГлаксоСмитКляйн Фар-масьютикалз СА" (Польша). Пероральное введение в течение 2-х недель крысам препаратов в дозах, в 2 и 5 раза превышающих терапевтическую, не оказывали отрицательного влияния на динамику массы тела, внутренних
органов, гематологические и биохимические показатели функционирования внутренних органов. При введении исследуемых препаратов в дозе, превышающей терапевтическую в 5 раз, были зарегистрированы однотипные нарушения в поведении животных как при тесте "открытое поле", так и при наблюдении во время кормления препаратами, связанные с их специфическим действием.
Таким образом, сравнительное изучение препаратов показало, что препарат "Трилам" производства ОАО "Фармстандарт-Лексредства" по своим токсическим качествам и про-тивосудорожной активности не отличается от препарата " Ламиктал" производства "ГлаксоСмитКляйн Фармасьютикалз СА". Принимая во внимание вышесказанное, можно говорить о том, что препарат "Трилам" производства ОАО "Фармстандарт-Лексредства" можно рекомендовать к использованию в качестве противосудорожного препарата.
ЛИТЕРАТУРА
1. Петрухин А.С., Бурд Г.С., Мухин К.Ю. и др. Ламиктал в лечении эпилепсии у детей // Социальная и клиническая психиатрия. - І99б. -Т. б, № 3. - С. І2І-І24.
2. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. чл.-корр. РАМН,
Іб
