CC BY
35
Доклиническая аттестация специфической активности и подлинности отечественной вакцины-кандидата против ВИЧ-инфекции КомбиВИЧвак
К.А. Саркисян1 ([email protected]), М.С. Воробьева1 ([email protected]), И.В. Борисевич1 ([email protected]), Л.И. Карпенко2, М.П. Богрянцева2, О.Н. Каплина2, А.А. Ильичев2
1 ФГБУ «НЦ экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России, Москва ([email protected])
2 ФБУН «ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, р.п. Кольцово Новосибирской области ([email protected])
Резюме
Статья посвящена разработке и применению лабораторных методов для определения показателей «специфическая активность»и«подлинность»вакцины-кандидата против ВИЧ-инфекции КомбиВИЧвак, созданной в ФБУН «ГНЦ ВБ «Вектор». Для контроля качества вакцины в части специфической активности предложена и аттестована схема иммунизации мышей линии BALB/c. Показана возможность применения коммерческого набора для ИФА «ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ-УНИФ» для определения титра антител к ВИЧ-1 в сыворотках иммунизированных мышей. С помощью иммуноблоттинга было показано, что сыворотка мышей, иммунизированных Ком-биВИЧвак, распознает нативные вирусные белки на стрипах тест-системы New LAV Blot I. Данный подход обеспечивает способ определения подлинности рекомбинантного белка TBI-recA - В-клеточного компонента исследуемой вакцины. Ключевые слова: вакцина, аттестация, специфическая активность, иммунизация, подлинность, ИФА, иммунный блоттинг, сыворотка мышей
Preclinical Validation of Specific Activity and Authenticity of the National Vaccine Candidate against HIV Infection КоmbiHIVvак
K.A. Sarkisyan1 ([email protected]), M.S. Vorobjeva 1 ([email protected]), I.V. Borisevich1 ([email protected]), L.I. Karpenko2, M.P. Bogryantseva2, O.N. Kaplina2, A.A. Ilichev2
1 The Federal Government Budget Institution «Scientific Center of Examination of Medical Means Applications», Moscow ([email protected])
2 The State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», the working village Kolcovo of Novosibirsk region (vector@ vector.nsc.ru)
Abstract
Article is devoted working out and application of laboratory methods of definition of parameters «specific activity» and «authenticity» of Russian vaccine candidate against HIV KombiHIVvak created in The State research Center of Virology and Biotechnology «Vector». For quality assurance of a vaccine regarding specific activity the scheme of immunization of mice of line BALB/c is offered and certificed. Possibility of application of a commercial russian set for ELISA «DS-IFA-ANTI-HIV-UNIF» for definition titer of antibodies for HIV-1 in sera of immunized mice is shown. Using immunoblotting, it was shown that the serum of mice immunized KombiHIVvak, recognize native viral proteins on the strip, test kits «New LAV Blot I». This approach provides a method for determining the authenticity of the recombinant protein TBI-recA - B-cell component of the study vaccine.
Key words: vaccine, validation, specific activity, immunization, authenticity, ELISA, immune blotting, mice serum
Введение
^ времени выявления первых больных СПИДом (1981 г.), по оценке ВОЗ, в мире официально зарегистрировано около 60 млн ВИЧ-инфицированных, из них более половины умерло. Ежегодно около 2,7 млн человек инфицируется ВИЧ и около 2,5 млн из них умирает [2]. Россия по скорости прироста новых случаев ВИЧ-инфекции входит в тройку наиболее неблагополучных тер-
риторий (вместе со странами Юго-Восточной Азии и Африки).
В 2009 году число зарегистрированных ВИЧ-инфицированных лиц в нашей стране превысило 500 тыс., при том что в 2006 году ВОЗ оценивала это число почти в 1 млн [1].
С момента обнаружения возбудителя (1983 г.) научным мировым сообществом проделана большая работа по изучению эпидемиологии инфекции,
этиопатогенеза, генетической структуры вируса, разработаны методы диагностики и химиотерапии заболевания. Однако, несмотря на это, пандемию ВИЧ-инфекции остановить не удается. Известно, что наиболее перспективное направление контроля инфекционных заболеваний - разработка и применение профилактических препаратов. Вакцинация служит наиболее эффективным методом борьбы с распространением эпидемических инфекций. По оценке экспертов организации «Международная инициатива по вакцине против СПИДа» (International AIDS Vaccine Initiative), создание и использование вакцины против ВИЧ-инфекции могли бы снизить число новых случаев инфицирования ВИЧ на 20 - 80% (около 30 - 70 млн новых случаев в течение 15 лет) [2, 3].
В настоящее время более 30 вакцин-кандидатов против ВИЧ-инфекции включены в клинические исследования, проводимые в разных странах мира.
В России разработаны три варианта вакцин против ВИЧ-инфекции (КомбиВИЧвак, ВИЧРЕПОЛ, ДНК-4), которые находятся в 1-й и 2-й фазах клинических исследований [4].
Клиническим исследованиям отечественных вакцин против ВИЧ предшествовало обширное и глубокое доклиническое изучение их безопасности, специфической активности, подлинности и других не менее важных характеристик, без определения которых ни один препарат не допускается к назначению людям [3].
Новые препараты, основанные на генно-инженерных технологиях, требуют и новых подходов и методов их аттестации. Специфическая активность и подлинность вакцины на лабораторном уровне - один из основных параметров, определяющих возможность применения препарата добровольцами [5, 8]. Цель нашего исследования - разработка наиболее информативных и доступных методов определения специфической активности и подлинности вакцины-кандидата против ВИЧ-инфекции КомбиВИЧвак для ее аттестации.
Материалы и методы
1. КомбиВИЧвак - отечественная вакцина-кандидат против ВИЧ-инфекции - представляет собой оригинальную конструкцию в виде вирусоподобных частиц, на поверхности которых экспонирован рекомбинантный белок TBI-recA, конъюгированный с декстраном и спермидином. Внутри вирусоподобной частицы находится рекомбинантная плазмида pcDNA-TCI. Таким образом, вирусоподобная частица одновременно является T- и B-клеточным ВИЧ-1-иммуногеном [6].
В работе использованы:
1. Девять серий вакцины (получены из ФБУН «ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора).
2. Мыши инбредной линии BALB/с массой 16 - 18 граммов.
3. Наборы реагентов для иммуноферментного выявления антител к ВИЧ-1, 2 отечественного производства:
«ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ-УНИФ» (НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород); «Эколаб-ВИЧ-1, 2 АТ» (ЗАО «Эколаб», г. Элек-трогорск);
«ВИЧ-1-, ВИЧ-2-ИФА-Авиценна» (МЦ «Авиценна», Москва);
«АмерКард Анти-ВИЧ-1/2 К» («АмерКард», Москва);
«Рекомбинант ВИЧ-1, 2» («Медико-биологический союз», г. Новосибирск); «Пептоскрин-2» («АмерКард», Москва).
4. Набор реагентов для выявления антител к ВИЧ-1 методом иммунного блоттинга New LAV Blot I - на вирусном культуральном лизате (BioRad, Франция).
5. Конъюгат антител кролика против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена (разведение 1:4000) (Sigma, США).
6. Стандартная панель сывороток крови человека, содержащих антитела к ВИЧ-1 в различных концентрациях (получена на основе сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов), - ОСО42-28-212 - аттестована и утверждена в ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича».
Протокол иммунизации включал двукратное (0 и 28 сут) введение животным вакцины Ком-биВИЧвак. В опытной группе вводили одну дозу препарата (50 мкг рекомбинантного белка TBI и 75 мкг плазмиды pcDNA3.1), в контрольной - физиологический раствор.
Постановку ИФА и иммуноблоттинга проводили согласно инструкциям производителей, заменив в тест-системах конъюгат против IgG человека на конъюгат против IgG мыши.
Результаты и обсуждение
В наших исследованиях (2004 - 2006 гг.) была показана эффективность иммунизации мышей ре-комбинантными антигенами, входящими в состав вакцины-кандидата ВИЧРЕПОЛ. Использование для этой цели мышей линейных или гибридов F1 позволяет получать стандартные и воспроизводимые результаты [5, 7].
Изучение однократной иммунизации мышей линии BALB/с экспериментальной вакциной ВИЧРЕ-ПОЛ при различных способах введения антигена продемонстрировало ее недостаточную антигенную активность. Один из путей повышения активности антигена - изменение схемы иммунизации путем увеличения кратности введения вакцины. При двукратной прививке мышей в доклиническом изучении специфической активности вакцины Ком-биВИЧвак использовали три способа введения вакцинного антигена: подкожный, внутримышечный и внутрибрюшинный (интервал между двумя иммунизациями - 28 сут, забор крови - через 7 сут после второй прививки). Для определения активности в ИФА мышиных иммунных сывороток использовали в качестве иммуносорбента антиген,
входящий в состав вакцины КомбиВИЧвак, и конъ-югат кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена. Результаты исследования трех серий вакцины-кандидата представлены в таблице 1.
Показано, что при всех трех способах (лучше при внутримышечном и внутрибрюшинном) введения вакцинного антигена мышам BALB/с в сыворотках привитых мышей регистрировались титры специфических антител от 1:2560 до 1:10 240, что значительно превышало титры антител к ВИЧ-1 при однократной иммунизации.
Полученные данные свидетельствуют, что выбранная схема иммунизации - две инъекции с интервалом 28 суток - позволяет получать достоверные и информативные результаты при лабораторном контроле вакцины-кандидата против ВИЧ-инфекции.
Для упрощения методики определения в ИФА титра антител к ВИЧ-1 в сыворотках иммунизированных вакциной мышей использовались коммерческие наборы реагентов с различными характеристиками антигенов ВИЧ, сорбированных в лунках планшета-иммуносорбента. Конъюгат против ^ человека с пероксидазой хрена, входящий в состав набора реагентов, заменяли на соответствующий конъюгат против ^ мыши. Результаты представлены в таблице 2.
Наиболее высокие и стабильные титры антител (1:1280) наблюдали при исследовании иммунных сывороток мышей в коммерческом наборе реагентов для ИФА «ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ-УНИФ», титры антител к ВИЧ-1 при анализе в других наборах реагентов для ИФА были значительно ниже. Это, по-видимому, связано с различной степенью сходства рекомбинантных антигенов вакцины и имму-
носорбента из набора реагентов для ИФА. Состав рекомбинантных антигенов (белков ВИЧ-1, 2) в наборе реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ-УНИФ» представлен более широким набором антигенных ре-комбинантных белков ВИЧ-1: р15, р17, р24, gp41, gp120, gp160. При использовании наборов реагентов, основанных на синтетических пептидных эпи-топах ВИЧ-1 («Пептоскрин-2», «ВИЧ-1, ВИЧ-2-ИФА-Авиценна»), реактивность антител к ВИЧ не была выявлена, по-видимому в связи с различием набора эпитопов в белках, используемых в пептидных тест-системах и в вакцине КомбиВИЧвак.
Для доказательства целесообразности применения коммерческого набора реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ-УНИФ» с целью определения активности вакцины КомбиВИЧвак при двукратной иммунизации мышей нами были проведены дополнительные исследования. Использовалось шесть серий вакцины, приготовленных в разные годы (с 2008 по 2010 г.). Результаты представлены в таблице 3.
Показано, что коммерческий набор «ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ-УНИФ» позволяет дифференцировать различные серии вакцины КомбиВИЧвак по активности специфических к ВИЧ мышиных антител при их применении для иммунизации мышей линии BALB/с. Метод также позволяет определить возможные критерии активности вакцины КомбиВИЧвак по уровню титра антител у привитых двукратно мышей.
Однако окончательное суждение о приемлемости устанавливаемых критериев активности ВИЧ-вакцины может быть сформулировано после проведения клинических испытаний препарата и при сопоставлении полученных нами данных с результатами оценки гуморального иммунного ответа людей на иммунизацию вакциной-кандидатом против ВИЧ.
Таблица 1.
Определение активности в ИФА вакцины КомбиВИЧвак по показателям титров специфических антител в сыворотках крови двукратно иммунизированных мышей
(в качестве иммуносорбента для ИФА применялся планшет с сорбированным вакцинным антигеном, конъюгат c пероксидазой хрена против IgG мыши)
№ серии вакцины КомбиВИЧвак Способ иммунизации титр антител (разведение сыворотки в ИфА с оп более опкрит)
опытная группа мышей контрольная группа мышей
010404 в/м (п = 15) 1:5120 1:10
в/бр (п = 35) 1:10 240 1:10
п/к (п = 30) 1: 5120 1:10
111201 в/м (п = 15) 1:2560 1:10
в/бр (п = 35) 1:10 240 1:10
п/к (п = 30) 1:2560 1:10
111201 в/м (п = 15) 1:2560 1:10
в/бр (п = 35) 1:10 240 1:10
п/к (п = 30) 1:2560 1:10
Примечание: п - количество мышей в каждой группе.
Таблица 2.
Определение активности в ИФА вакцины КомбиВИЧвак по показателям титров специфических антител в сыворотках крови иммунизированных двукратно мышей
(для постановки ИФА были использовались коммерческие наборы реагентов для выявления антител к ВИЧ-1,2 различных отечественных производителей. Конъюгат заменен на конъюгат c пероксидазой хрена против IgG мыши)
Наименования коммерческих наборов реагентов для иммуноферментного выявления антител к ВИЧ-1, 2 Титр специфических антител к ВИЧ (разведение сыворотки в ИФА с ОП более ОПкрит )
опытная группа мышей контрольная группа мышей
АмерКард-анти-ВИЧ-1/2 1:80 1:10
ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ-УНИФ 1:1280 1:10
Эколаб-ВИЧ-1, 2 АТ 1:320 1:10
Рекомбинант-ВИЧ-1, 2 1:160 1:10
ВИЧ-1-, ВИЧ-2-ИФА-Авиценна 1:10 1:10
Пептоскрин-2 1:10 1:10
Примечание: Изучены пулы сывороток крови 30 мышей опытной группы и 35 - контрольной. Таблица 3.
Определение показателя «специфическая активность» различных серий вакцины КомбиВИЧвак по уровню титров сывороток иммунизированных различными сериями вакцины мышей линии BALB/с (для постановки ИФА использовался коммерческий набор для выявления антител к ВИЧ-1,2 « ИФА-АнтиВИЧ-Униф» и конъюгат c пероксидазой хрена против IgG мыши )
Серии вакцины-кандидата КомбиВИЧвак Титр антител (разведение сыворотки мышей с ОП более ОП )
опытная группа контрольная группа
041008 1:1280 1:10
050309 1:1280 1:10
060309 1:1280 1:10
070409 1:600 1:10
120110 1:600 1:10
130110 1:600 1:10
Примечание: Исследовали пул сывороток от 30 мышей на каждую серию вакцины.
Подлинность, то есть соответствие антигенного (белкового) состава вакцины-кандидата заданным параметрам, является одним из основополагающих показателей при оценке качества вирусных вакцин, особенно вакцин против ВИЧ-инфекции.
Для подтверждения подлинности вакцины КомбиВИЧвак использовали два метода:
Первый - сорбция вакцинного антигена на план-шете-иммуносорбенте и постановка ИФА с применением этого иммуносорбента для выявления антител к ВИЧ в сыворотках ВИЧ-позитивных пациентов. Для этой цели использовали стандартную панель сывороток крови человека, аттестованную на наличие специфических антител к ВИЧ-1, - 0С042-28-212-02П.
Было показано, что вакцинный антиген, сорбированный на планшете для ИФА, проявляет высокую степень реактивности со специфическими ВИЧ-антителами, содержащимися в сыворотках стандартной панели.
Второй - постановка подтверждающего теста иммунного блоттинга с сыворотками мышей, иммунизированных вакциной КомбиВИЧвак, на наборе New LAV Blot I с заменой конъюгата, входящего в состав набора, на антимышиный конъюгат с щелочной фосфатазой. Результаты представлены в таблице 4. На стрипах для иммунного блоттинга New LAV Blot I сорбированы отдельные белки лизата ВИЧ-1 от gp160/120 до р17. Выявлена реактивность антител в сыворотках мышей, иммунизированных вакциной КомбиВИЧвак, со специфическими белками ВИЧ-1: р55, р40, р24, р17 - при отсутствии таковой с контрольными сыворотками неиммунных мышей. Эпитопы из указанных белковых антигенов ВИЧ-1 входят в состав рекомбинантного белка TBI-recA (ответствен за гуморальный иммунный ответ на введение вакцины), формирующего поверхностный слой вирусоподобной частицы. Таким образом, в проведенных экспериментах показана достаточно
Таблица 4.
Изучение спектра специфических антител к различным белкам ВИЧ-1 в сыворотках крови мышей, иммунизированных вакциной КомбиВИЧвак (использовался метод иммунного блоттинга - набор реагентов «НьюЛавБлот», конъюгат со щелочной фосфатазой против IgG мыши )
Серия вакцины 050309 060309 070409
Опытная группа мышей р55, p 40, р25/24, р18/17 р55, p 40, р25/24, р18/17 р55, p 40, р25/24, р18/17
Контрольная группа мышей Отсутствие специфических полос
выраженная реализация гуморального звена иммунитета на введение вакцины КомбиВИЧвак.
Выводы
1. Разработаны и аттестованы методы доклинической оценки:
• специфической активности вакцины-кандидата КомбиВИЧвак;
• подлинности кандидатной вакцины КомбиВИЧвак.
2. Внесены в проект нормативной документации (ФСП) на вакцину-кандидат против ВИЧ-инфекции КомбиВИЧвак метод иммунофер-
ментного анализа с применением коммерческого набора реагентов для ИФА, аттестованный для оценки специфической активности, и метод иммунного блоттинга, аттестованный для оценки подлинности вакцины.
3. Показана возможность регистрации гуморального иммунного ответа при введении лабораторным животным вакцины-кандидата против ВИЧ-инфекции КомбиВИЧвак при использовании двукратной схемы иммунизации мышей линии BALB/с и применения методов иммунофермент-ного анализа и иммунного блоттинга. Ш
Литература
1. Онищенко Г.Г. Основные направления деятельности по противодействию эпидемии ВИЧ/СПИД в РФ // Иммунология. 2006. Т. 27. № 14. С. 356 - 361.
2. Хаитов Р.М., Решетников В.А., Сидорович И.Г. и др. Клинические испытания первой отечественной анти-ВИЧ/СПИД-вакцины. - М., 2009. - 672 с.
3. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Иванов В.Т. и др. Выявление антител против НМ-1 и Н^-2 с помощью синтетических антигенных детерминант // Иммунология. 1990. Т. 2. С. 21 - 25.
Карпенко Л.И., Бажан А.И., Лебедев Л.Р. и др. Заявка № 2006100808 от 10.01.2006 г. «Рекомбинантная вакцина против вируса иммунодефицита первого типа».
Чеканова Т.А., Воробьева М.С., Николаева И.А. и др. Разработка информативных методов контроля на доклиническом уровне новых отечественных вакцин против ВИЧ/СПИД // Физиология и патология иммунной системы. 2006. № 3. С. 21 - 28.
Cotch F., Holmes H. Imami N. The importance of standardization of laboratory evaluation in HIV vaccine trials // Microbes and Infection. 2005. V. 7 (14). P. 1424 - 1432.
WHO/UNAIDS Report on the global AIDS epidemic. 2008. International AIDS Vaccine Initiative, IAVI Policy Brief. IAVI, 2008.
КОРОТКОЙ СТРОКОЙ
Рекомбинант Mycobacterium smegmatis индуцирует сильный иммунный ответ против Mycobacterium tuberculosis
Ученые Медицинского института Говарда Хьюза и Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна (США) установили, что esx-3-локус гена микобакте-рии определяет ее способность ускользать от врожденного иммунитета. Введение внутривенно мышам высоких доз Mycobacterium smegmatis, несущих неповрежденный esx-3-локус, вызывало у животных смерть, а при инъекции этой же микобактерии, но с мутантным локусом (обозначен как штамм IKE) возникал MyD88-зависимый иммунный ответ. При внедрении в ортологичный Mycobacterium tuberculosis штамма IKE возникает мутантный штамм, обозначенный как IKEPLUS. Этот штамм способен индуцировать иммунный ответ, стимулируя активность цитокинов и Т-клеток памяти.
Таким образом, выявлена роль esx-3-локуса гена в вирулентности микобактерии, а также показана
возможность использования штамма IKE в качестве вектора для вакцины-кандидата против туберкулеза M. tuberculosis.
По данным Всемирной организации здравоохранения, туберкулез убивает около 1,7 миллиона человек каждый год и поражает каждого третьего жителя Земли. С распространением лекарственно-устойчивых штаммов туберкулеза создание высокоэффективной вакцины против этой инфекции стало острой необходимостью.
Источник:
Sweeney K.A., Dao D.N., Goldberg M.F. et all. «A recombinant Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidal immunity against Mycobacterium tuberculosis». http://www.nature.com/
