CC BY
4
https://doi.org/10.33647/2074-5982-20-2-32-44
(ССУ
BY 4.0
ДОКАЗАТЕЛЬСТВО НАЛИЧИЯ ЦЕЛЕВЫХ БЕЛКОВ — ß2m hom И HLA У ГУМАНИЗИРОВАННЫХ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ ЛИНИЙ HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 И HLA-C*07:02
В.Н. Каркищенко, А.Г. Берзина*, Н.В. Петрова, И.А. Помыткин, Е.С. Глотова, Д.В. Петров, Л.А. Табоякова, Л.А. Болотских, Н.А. Ларюшина
ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России» 143442, Российская Федерация, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1
Человеческий лейкоцитарный антиген играет первостепенное значение в формировании иммунного ответа и патогенезе заболеваний различной этиологии, в т.ч. при развитии негативных побочных эффектов на фармакологические препараты. Современные стандарты фармакобезопасности требуют совершенствования существующих тест-систем для проведения качественных доклинических исследований. В НЦБМТ ФМБА России был разработан и создан ряд гуманизированных трансгенных линий мышей, несущих гибридные молекулы HLA I класса на поверхности клеток, которые соответствуют аллельным вариантам человека HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 и HLA-C*07:02. В данной статье представлены экспериментальные данные по количественному определению белка р2-микроглобулина человека и результаты определения HLA «сэндвич»-методом ИФА у мышей, несущих разные аллели генов HLA I класса. Полученные данные подтверждают наличие целевых функциональных белков (трансгенность) у гуманизированных трансгенных мышей, что согласуется с данными, полученными нами при определении первичной последовательности трансгена методом секвенирования по Сэнгеру. Кроме того, в работе рассматривается научно-практическая значимость таких биомоделей и область их применения.
Ключевые слова: иммунопероксидазный конъюгат, ИФА, «сэндвич»-метод, гуманизированные
трансгенные мыши, р2-микроглобулин, HLA A-, B-, C-
Конфликт интересов: авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование: государственное задание по теме «Получение новой линии гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-A*pX человека и нокаут комплекса H-2K мыши» (шифр: «Транснокаут-2024») ФГБУН НЦБМТ ФМБА России.
Для цитирования: Каркищенко В.Н., Берзина А.Г., Петрова Н.В., Помыткин И.А., Глотова Е.С., Петров Д.В., Табоякова Л.А., Болотских Л.А., Ларюшина Н.А. Доказательство наличия целевых белков — ß2m hom и HLA у гуманизированных трансгенных мышей линий HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 и HLA-C*07:02. Биомедицина. 2024;20(2):32-44. https://doi.org/10.33647/2074-5982-20-2-32-44
Поступила 04.03.2024
Принята после доработки 20.05.2024
Опубликована 10.06.2024
EVIDENCE FOR THE PRESENCE OF p2m hom TARGET PROTEINS AND HLA IN HUMANIZED TRANSGENIC MICE OF HLA-A*02:01, HLA-B*07:02, AND HLA-C*07:02 LINES
Vladislav N. Karkischenko, Asya G. Berzina*, Nataliya V. Petrova, Igor A. Pomytkin, Elena S. Glotova, Dmitry V. Petrov, Lidiya A. Taboyakova, Lubov' A. Bolotskih, Nadezhda A. Laryushina
Каркищенко В.Н., Берзина А.Г., Петрова Н.В., Помыткин И.А., Глотова Е.С., Петров Д.В., Табоякова Л.А., Болотских Л.А., Ларюшина Н.А. «Доказательство наличия целевых белков — ß2m hom и HLA у гуманизированных трансгенных мышей линий HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 и HLA-C*07:02»
Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia 143442, Russian Federation, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1
Human leukocyte antigen plays a primary role in the formation of immune response and pathogenesis of diseases of various etiologies, including the development of negative side effects induced by pharmacological agents. Modern pharmacosafety standards require improvement of existing test systems to conduct high-quality preclinical studies. A number of humanized transgenic mouse lines with hybrid HLA I class molecules on the cell surface, which correspond to the human allelic variants HLA-A*02:01, HLA-B*07:02, and HLA-C*07:02, were developed at the Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia. In this article, we present experimental data on quantitative determination of p2-microglobulin protein and HLA by the "sandwich" ELISA method in mice with different alleles of HLA I class genes. The results obtained confirm the presence of target functional proteins (transgenicity) in humanized transgenic mice, which is consistent with our previous data obtained when determining the primary sequence of the transgene using Sanger sequencing. We also discuss the scientific and practical significance of such biomodels, as well as the scope of their application.
Keywords: immunoperoxidase conjugate, ELISA, sandwich method, humanized transgenic mice, p2-mi-croglobulin, HLA A-, B-, C-
Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.
Funding: the research topic "Generation of a new line of humanized transgenic mice carrying the human HLA-A*pX gene and knockout of the mouse H-2K complex" (code: "Transknockout-2024") of state assignment of Scientific Center of Biomedical Technologies of FMBA of Russia.
For citation: Karkischenko V.N., Berzina A.G., Petrova N.V., Pomytkin I.A., Glotova E.S., Petrov D.V., Taboyakova L.A., Bolotskih L.A., Laryushina N.A. Evidence for the Presence of P2m hom Target Proteins and HLA in Humanized Transgenic Mice of HLA-A*02:01, HLA-B*07:02, and HLA-C*07:02 Lines. JournalBiomed. 2024;20(2):32-44. https://doi.org/10.33647/2074-5982-20-2-32-44
Submitted 04.03.2024 Revised 20.05.2024 Published 10.06.2024
Введение
С момента открытия технологии направленного редактирования генома исследователи получили мощный инструмент для решения широкого круга фундаментальных и прикладных задач, начиная от исследований на молекулярно-генетическом уровне до создания живых организмов с заданными свойствами. Манипуляции с геномом позволили ученым выйти на новый уровень планирования и проведения исследований, что способствовало созданию биомоделей, удовлетворяющих условиям каждого отдельно взятого эксперимента. Особое место заняли т.н. гуманизированные модели — биомодели со встроенным в геном организма животного геном человека. Исследования, проведённые на гуманизированных организмах, позволяют получить
наиболее полное представление об особенностях нормального строения и работы отдельных генов, регуляции их экспрессии и сигнальных путях, проследить роль генов в филогенезе и онтогенезе, а также патогенезе заболеваний и пр. Использование гуманизированных биомоделей на сегодня — важный инструмент в арсенале трансляционной медицины, являясь кратчайшим и наиболее корректным способом экстраполяции результатов научных изысканий на человека.
Однако при создании трансгенных биомоделей необходима система контроля и валидации используемых методов. Манипуляции с генами могут приводить к возникновению многих побочных эффектов, в т.ч. таких, как встраивание трансгена в транскрипционно неактивную область,
утрата функциональных частей исходной генно-инженерной конструкции, нарушение транскрипции и сборка нефункционального продукта. Оценить активность трансгена на каждом уровне реализации генетической информации (ДНК, мРНК, белок) позволяют методы молекулярной биологии, биохимии, иммунологии и многие другие.
В НЦБМТ ФМБА России были созданы гуманизированные трансгенные линии мышей, несущих ген главного комплекса ги-стосовместимости (MHC) человека I класса (HLA I класса) на поверхности клеток. Данный комплекс стабилизируется молекулой р2-микроглобулина человека, «сшитого» глицин-сериновым линкером с а1-доменом HLA. Созданные биомодели демонстрируют аллельные варианты HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 и HLA-C*07:02 человека.
Особую важность для многих исследований имеет необходимость не только качественно оценить наличие трансгена, но и количественно измерить генный продукт. Для каждой созданной линии мышей с геном HLA (A*02:01, B*07:02, C*07:02) в НЦБМТ ФМБА России были разработаны методики детекции целевого трансгена с помощью ПЦР в реальном времени, которые позволяют быстро произвести скрининг поголовья животных. Кроме того, методом секвенирования по Сэнгеру было показано отсутствие химеризма и полное соответствие трансгена заявленной генно-инженерной конструкции и исходному гену человека [2]. Однако отсутствие зависимости транскрипционной активности региона (т.е. количества мРНК) и содержания продуктов генов (в нашем случае, белка HLA и р2-микроглобулина человека) не позволяет констатировать наличие искомых белков, что требует применения эффективных и высокочувствительных методов детекции.
Перспективным направлением работы в данной области является разработка им-мунохимических методов, позволяющих
не только качественно показать наличие белкового продукта, но и количественно оценить его содержание в биологических образцах. На сегодня таким требованиям наиболее полно отвечает «сэндвич»-вариант иммунофер-ментного анализа (ИФА). При постановке данного метода на твердой фазе — поверхности лунок полистирольных планшетов — иммобилизуют первичные антитела с их последующей блокировкой. Далее в лунки вносят исследуемое вещество, содержащее антиген, и инкубируют. Образовавшийся на твердой фазе комплекс антиген-антитело отмывают от несвязавшегося антигена и добавляют меченные ферментом антитела, специфичные к определяемому антигену. Затем вносят субстрат и проводят детекцию путем измерения оптической плотности окрашенного продукта ферментативной реакции. «Сэндвич»-вариант ИФА позволяет с высокой точностью определить наличие целевых молекул в различных биологических жидкостях и экстрактах из клеток и тканей. Измерение оптической плотности в результате реакции позволяет произвести расчет количества определяемого белка в пробах, поскольку его концентрация прямо пропорциональна количеству фермента, присутствующего в лунке. Для выполнения таких расчетов в эксперимент необходимо включать калибровочную кривую, которая создается путем сопоставления измеряемой оптической плотности (ОП) с известными концентрациями целевого белка [13].
Стадия «узнавания» анализируемого соединения специфическим к нему антителом происходит в строго количественном соотношении, которое зависит от аффинности, концентрации компонентов и условий проведения реакции. Для доказательства наличия белков Р2т ^т и ^А в биоматериале, полученном от трансгенных мышей, нами были разработаны тест-системы для определения этих белков «сэндвич»-методом ИФА. С применением коммерческого препарата рекомбинантного белка Р2т Ьют удалось количественно опреде-
Каркищенко В.Н., Берзина А.Г., Петрова Н.В., Помыткин И.А., Глотова Е.С., Петров Д.В., Табоякова Л.А., Болотских Л.А., Ларюшина Н.А. «Доказательство наличия целевых белков — р2т Ьют и HLA у гуманизированных трансгенных мышей линий HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 и HLA-C*07:02»
лить искомый белок в сыворотках крови трансгенных мышей по калибровочной кривой. Использование в работе коммерческих препаратов моноклональных антител к HLA ABC дало возможность достоверно идентифицировать эти белки в экстрактах селезенки гуманизированных мышей.
Обнаружение искомых белков в биоматериале, полученном от животных линий, несущих гены человека — ген HLA и ген ß2-микроглобулина человека, является прямым доказательством не только экспрессии трансгена и трансляции целевых белков (т.е. трансгенности), но и их соответствия по антигенным свойствам исходным белкам человека (т.е. гуманизированности).
Целью настоящей работы явилось определение белков HLA-A*02:01, HLA-B*07:02, HLA-C*07:02 в экстрактах селезенки трансгенных мышей и количественное определение белка ß2m hom в сыворотках крови соответствующих трансгенных линий, полученных в НЦБМТ ФМБА России, с применением «сэндвич»-метода ИФА.
Материалы и методы
Экспериментальные животные
В работе использовались мыши трёх гуманизированных трансгенных линий с интегрированными генами HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 и HLA-C*07:02, представляющих аллели человеческого MHC I класса HLA A-, B- и C- соответственно, полученные в ФГБУН НЦБМТ ФМБА России [1, 3, 4], а также гибриды Fl CBA/lac х C57BL/6, полученные из филиала «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России, которые являются генетическим фоном для всех анализируемых в данной работе трансгенных линий (для удобства чтения в тексте обозначены как WT или Fl). Для получения F2 и следующих поколений племядра формировали из подтверждённых особей предыдущего поколения по технологии инбредного скрещивания. Животные соот-
ветствовали категории улучшенных конвенциональных. Группы формировались методом пар-аналогов, по 6 особей в каждой. Сформированные группы содержались в системе индивидуальных вентилируемых клеток при световом режиме 12/12, со свободным доступом к пище и воде, по 2 мыши в клетке. Условия содержания соответствовали стандартным зоотехническим нормам, применяемым для лабораторных мышей. Биоматериал для анализа В качестве источника антигенов использовали сыворотку крови, а также биоптат селезенки экспериментальных животных — подтверждённых (по данным ПЦР-РВ) носителей трансгена HLA A-, B-, и C-. «Сэндвич»-вариант ИФА для определения HLA А-, В-, С-
Разработку тест-системы («сэндвич»-вариант ИФА) для определения HLA А-, В-, С- проводили с использованием коммерческих моноклональных антител — mAb to HLA Classl к HLA ABC ab 155381 ("Abcam", Китай), а также набора для определения MHC методом ИФА (человек) ("Cloud-Clone Corp.", Китай). Конъюгацию антител с пероксидазой хрена ("Sigma-Aldrich", США) проводили периодатным методом [18].
«Сэндвич»-вариант ИФА для количественного определения ß2-микроглобулина человека (ß2mg hom)
Тест-систему для количественного определения ß2m hom разрабатывали с применением поликлональных антител к ß2m hom, полученных от морских свинок, иммунизированных коммерческим препаратом рекомбинантного белка ß2m hom ("Cloud-Clone Corp.", Китай) по схеме, представленной в работе [28]. Титр антител к ß2m hom в сыворотках крови морских свинок определяли непрямым методом ИФА с применением антивидового иммунопероксидазного конъюгата AntiGuinea Pig+Ph ("Sigma-Aldrich", США).
Получение иммунопероксидазного конъ-югата осуществлялось периодатным методом.
Оптимизация условий постановки ИФА
Определение оптимальных концентраций раствора антител, применяющегося для сенсибилизации полистирольных планшетов, а также для оптимального разведения конъюгатов антител с ферментом осуществлялось в каждом конкретном случае экспериментально методом «шахматного» титрования. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку крови неиммунных мышей, а также экстракт селезёнки контрольных мышей WT (F1). С целью исключения ложноположи-тельной реакции в ИФА осуществлялась экспериментальная подборка разведений экстрактов и сывороток крови. Блокировка неспецифической реакции осуществлялась раствором 0,3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в фосфатно-солевом буфере с Твин-20 (PBST) в стандартных условиях.
Регистрация результатов анализа ИФА
В качестве субстрата пероксидазы использовали р-р тетраметилбензидина (ТМБ,
000 «Абисенс», Россия). Оптическую плотность окрашенного продукта ферментативной реакции измеряли на планшетном мультимодальном ридере Feyond-A400 ("Allsheng", Китай) при длине волны 450 нм. Полученные значения оптической плотности (ОП450) представлены в оптических единицах (о.е.). Стандартизацию разработанных иммуноферментных тест-систем для определения ß2m hom и HLA (А-, В-, С-) проводили с использованием тестов для проверки надежности, точности, специфичности и воспроизводимости, используя критерии, принятые для иммунофермент-ного анализа [17].
Иммунизации трансгенных мышей
В эксперименте участвовали 4 группы (n=6) мышей в возрасте 2 мес.:
1 (HLA-A*02:01), II (HLA-B*07:02), III
(HLA-C*07:02) группы — трансгенные мыши, IV группа — контроль (WT, гибриды F1 CBA/lac х C57BL/6, генетический фон для всех анализируемых в данной работе трансгенных линий). Животные содержались в одинаковых условиях по 2 особи в каждой клетке. С целью активации иммунной системы мыши получали одну подкожную инъекцию антигена — коммерческого препарата IgG horse ("Sigma-Aldrich", США) в дозе 25 мкг на мышь. Антиген вводили в физ. р-ре в смеси 1:1 с полным адъ-ювантом Фрейнда ("Sigma Aldrich", США). Объем инъекции суммарно составил 0,1 мл. На 7-й день после иммунизации у всех животных производился прижизненный забор крови из ретроорбитального сплетения в объеме 0,2 мл. Образцы сыворотки крови
Кровь брали в пробирки с активатором свёртывания, затем выдерживали 30 мин при комнатной температуре. Сыворотку крови для определения р2-микроглобу-лина человека «сэндвич»-методом ИФА у мышей отделяли центрифугированием при 3000 об./мин в течение 15 мин, после чего супернатанты использовали немедленно: в двукратном разведении вносили в лунки полистирольных планшетов ("Dynatech", Швейцария) для проведения ИФА. Экстракты ткани селезенки для определения HLA А-, В-, С-
Перед анализом ткань селезенки промывали ледяным р-ром PBS для тщательного удаления крови. 100-150 мг ткани измельчали на стекле лезвием на мелкие кусочки и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с добавлением PBS в соотношении 1:5. Полученную суспензию подвергали двум циклам замораживания оттаивания для дальнейшего разрушения клеточных мембран, затем гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 1500 g (или 5000 об./мин). Супернатант немедленно использовали для анализа или делали али-квоты для длительного хранения при -80°С.
Каркищенко В.Н., Берзина А.Г., Петрова Н.В., Помыткин И.А., Глотова Е.С., Петров Д.В., Табоякова Л.А., Болотских Л.А., Ларюшина Н.А. «Доказательство наличия целевых белков — ß2m hom и HLA у гуманизированных трансгенных мышей линий HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 и HLA-C*07:02»
Обработка данных
Статистический анализ результатов проводили параметрическими и непараметрическими методами с использованием пакета программ ANOVA.
Результаты и обсуждение
Содержание Р2ш hom в сыворотке крови
Иммунизация морских свинок коммерческим препаратом Р2т 1от позволила получить моноспецифическую антисыворотку с титром антител 1:200 000 (по данным непрямого метода ИФА). На основе поликло-нальных антител морской свинки к Р2т 1ют был получен иммунопероксидазный конъю-гат для количественного определения Р2т 1от с помощью «сэндвич»-метода ИФА.
В результате подбора условий для проведения эксперимента была выбрана оптимальная концентрация антител для сенсибилизации полистирольных планшетов — 2 мкг/мл и оптимальная концентрация меченных ферментом антител — 2,5 мкг/мл. На рис. 1 представлена калибровочная кривая для ИФА определения Р2т 1от в коммерче-
ском препарате Р2т 1от. Чувствительность теста составила 10 нг/мл.
По калибровочной кривой (рис. 1) на основе полученных данных в результате анализа сывороток крови экспериментальных мышей была определена концентрация Р2т 1от (средняя для каждой группы). Так, для группы I (^А-А*02:01) эта величина составила 1750 нг/мл, в группах II (^А-В*07:02) и Ш (^А-С*07:02) — 1000 и 1500 нг/мл соответственно. Апосте-риорный тест Сидака для множественных сравнений показал статистически значимое отличие для всех указанных трансгенных линий (р<0,001—0,0001) по сравнению с контрольными мышами во всем диапазоне разведений сыворотки крови мышей. Полученные данные явно показывают наличие функционально активного белка Р2-микроглобулина человека в сыворотке крови у анализируемых линий гуманизированных трансгенных мышей Н^А-А*02:01 (рис. 2А), ^А-В*07:02 (рис. 2Б) и ^А-С* 07:02 (рис. 2В), т.е., трансгенность.
Специфичность реакции с полученными нами антителами к коммерческому
Рис. 1. Калибровочная кривая для ИФА определения «сэндвич»-методом белка @2m hom в коммерческом препарате в2т hom. Контроль — в2-микроглобулин мыши @2m mus.
Fig. 1. Calibration curve for determination ofв2т hom protein using the ELISA sandwich method in a commercial в2т hom preparation. Control — mouse e2-microglobulin e2m mus.
Рис. 2. Определение в2-микроглобулина человека в сыворотке крови «сэндвич»-методом ИФА у мышей линий HLA-A*02:01 (А), HLA-B*07:02 (Б) и HLA-C*07:02 (В). Среднее ± стандартное отклонение (n=6). ** — p<0,01, **** — p<0,0001 (двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA, апостериорный тест Сидака). Примечание: на оси абсцисс показаны разведения сыворотки крови.
Fig. 2. Determination of human e2-microglobulin in the blood serum of mice of the HLA-A*02:01 (А), HLA-B*07:02 (Б), and HLA-C*07:02 (В) lines by the "sandwich" ELISA method. Mean ± standard deviation (n=6). ** — p<0.01, **** — p<0.0001 (two-way ANOVA, Sidakpost hoc test). Note: x-axis shows blood serum dilutions.
Рис. 3. Определение HLA-A в экстрактах селезенки трансгенных мышей линии HLA-A*02:01 «сэндвич»-методом ИФА. Среднее ± стандартное отклонение (n=6). **** — p<0,0001 (двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA, апостериорный тест Сидака). Примечание: на оси абсцисс показаны разведения экстракта селезёнки.
Fig. 3. Determination of HLA-A in spleen extracts of HLA-A*02:01 transgenic mice by the "sandwich" ELISA method. Mean ± standard deviation (n=6). **** — p<0.0001 (two-way ANOVA, Sidak post hoc test). Note: x-axis shows the dilutions of spleen extract.
Р2ш Ьош доказывает полное соответствие трансгена Р2ш Ьош по антигенным свойствам исходному гену Р2-микроглобулина человека, т.е. гуманизированность животных по гену в2т hom. Содержание HLA (А-, В-, С-) в экстрактах селезёнки
Для определения ИЬА (А-, В-, С-) был получен иммунопероксидазный конъюгат на основе моноклональных антител к соответствующему типу ИЬА.
На рис. 3 представлены результаты количественного определения содержания белка ИЬА А- у трансгенных мышей линии ИЬА-А*02:01 в сравнении с мышами F1 (WT). Из полученных данных следует, что ОП450 в опытных образцах существенно превышает аналогичные показатели в контроле — селезенке мышей дикого типа. Так, при разведении экстракта 1:50, ОП450 у трансгенных мышей линии ИЬА-А*02:01 составила 1,10 о.е., в то время как в контроле средние значения ОП450 составили 0,05 о.е., что соответствует фоновым значениям для данного метода.
Каркищенко В.Н., Берзина А.Г., Петрова Н.В., Помыткин И.А., Глотова Е.С., Петров Д.В., Табоякова Л.А., Болотских Л.А., Ларюшина Н.А. «Доказательство наличия целевых белков — ß2m hom и HLA у гуманизированных трансгенных мышей линий HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 и HLA-C*07:02»
Рис. 4. Определение HLA-B в экстрактах селезенки трансгенных мышей линии HLA-B*07:02 «сэндвич»-методом ИФА. Среднее ± стандартное отклонение (n=6). **** — р<0,0001 (двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA, апостериорный тест Сидака). Примечание: на оси абсцисс показаны разведения экстракта селезёнки.
Fig. 4. Determination of HLA-B in spleen extracts of HLA-B*07:02 transgenic mice by the "sandwich" ELISA method. Mean ± standard deviation (n=6). **** — p<0.0001 (two-way ANOVA, Sidakpost hoc test). Note: x-axis shows the dilutions of spleen extract.
Рис. 5. Определение HLA-C в экстрактах селезенки трансгенных мышей линии HLA-C*07:02 «сэндвич»-методом ИФА. Среднее ± стандартное отклонение (n=6). **** — p<0,0001 (двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA, апостериорный тест Сидака). Примечание: на оси абсцисс показаны разведения экстракта селезёнки.
Fig. 5. Determination of HLA-C in spleen extracts of HLA-C*07:02 transgenic mice by the "sandwich" ELISA method. Mean ± standard deviation (n=6). **** — p<0.0001 (two-way ANOVA, Sidak post hoc test). Note: x-axis shows the dilutions of spleen extract.
Аналогичные данные были получены при исследовании образцов селезёнки, полученных от мышей линии HLA-B*07:02: при разведении гомогената 1:50 ОП450 у трансгенных мышей линии HLA-ß*07:02 составила 0,45 о.е., в то время как в контроле средние значения ОП450 оставались на уровне фона — 0,05 о.е. (рис. 4). Достоверность полученных результатов подтверждается двухфакторным дисперсионным анализом ANOVA с достоверностью p<0,0001.
При исследовании образцов селезёнки, полученных от гуманизированных трансгенных животных линии HLA^*07:02, экспериментальные данные также подтвердили высокое содержание белка HLA-С и его отсутствие у особей WT (рис. 5), ОП450 в опытных образцах существенно превышает аналогичные показатели в контроле: при разведении гомогената 1:50 ОП450
у трансгенных мышей линии HLA-С*07:02 составила 0,80 о.е. против 0,05 о.е.
Проведённые нами исследования наглядно подтверждают наличие линии специфических белков HLA у мышей новых гуманизированных трансгенных линий HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 и HLA-C*07:02. Апостериорный тест Сидака для множественных сравнений показал статистически значимое отличие для всех указанных трансгенных линий ф<0,0001) по сравнению с мышами WT во всем диапазоне разведений экстрактов селезенки. Использование качественных коммерческих моноклональ-ных антител к аллелям HLA при разработке тест-системы ИФА, а также подбор оптимальных условий для постановки реакции позволили с высокой степенью надёжности и достоверности доказать наличие у экспериментальных животных заявленных ха-
рактеристик — трансгена HLA и его полное соответствие по антигенным свойствам исходному гену человека, т.е. трансгенность и гуманизированность по соответствующему линии гену HLA.
Заключение
Биомоделирование является неотъемлемой частью прогресса во многих областях, включая фармакологию, изучение иммунных реакций и исследования в области токсичности и безопасности. Адекватный выбор биомодели определяет возможность получения интересующих данных, а также их корректность и транслируемость на другие биологические виды, включая человека. Несмотря на существенный прогресс в использовании альтернативных методов, ни один из них не позволяет даже приблизиться к результатам, которые можно получить на живых организмах. Рациональный подход и грамотный подбор биомодели определяют ход всего исследования, возможность использования инструментальных методов и тестов.
Потребности различных отраслей науки в биомоделях всё расширяются, а экспертам нужны биомодели нового уровня — максимально воспроизводящие особенности патологии, заболевания и пр., но при этом экономически эффективные и простые в поддержании. Наиболее популярным объектом в лабораториях всего мира является мышь: физиолого-анатомически и биохимически близка к человеку, быстро размножается и даёт до 6-10 поколений за год, удобна для содержания и исследования. Однако с открытием процесса гомологичной рекомбинации и получением первых нокаутных и трансгенных животных возможности учёных в плане биомоделирования существенно возросли. Более того, исследования в области популяционной медицины и появление фар-макогенетики обосновали необходимость использования гуманизированных биомоделей, воспроизводящих особенности генотипов различных групп населения при иссле-
дованиях в области фармакобезопастности и тестировании эффективности новых препаратов. Особую роль играют гены главного комплекса гистосовместимости, которые определяют возможности иммунного ответа организма и участвуют в формировании ответа организма на лекарственные агенты.
Полиморфизм системы ИЬА, свойственный конкретной популяции, служит отправным моментом в комплексном изучении многих заболеваний. У людей гены ИЬЛ I класса играют решающую роль в реакции отторжения трансплантата органа и реакции «трансплантат против хозяина» после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [25, 31]. Также была показана связь между ИЬА I класса и различными аутоиммунными заболеваниями [7, 9, 21, 24], а также инфекционными заболеваниями [26] и развитием негативных побочных эффектов на приём лекарственных препаратов [12, 16]. Помимо первостепенной роли ИЬЛ в формировании адаптивного иммунного ответа, была показана роль МИС класса I в качестве регулятора при поддержании беременности, выборе партнера и распознавании родственников [30], а также при выборе полового партнёра и предотвращении инбридинга [14]. Кроме того, гены ИЬЛ I класса оказывают влияние на развитие и пластичность центральной нервной системы [6, 8, 11, 19, 29], взаимодействие нервных клеток [15, 22], синаптические функции и поведение [10, 27], в т.ч. формирование некоторых неврологических и психических расстройств [5, 20, 23]. Эти особенности ИЬЛ I класса показывают особое положение этих генов и необходимость детального их изучения, что приводит нас к актуальности создания и поддержания биомоделей, несущих аллельные варианты классических и неклассических генов НЬЛ I класса.
В связи с нестабильной геополитической обстановкой возможность получения интересующих линий животных из зарубежных источников сильно ограничена как слож-
Каркищенко В.Н., Берзина А.Г., Петрова Н.В., Помыткин И.А., Глотова Е.С., Петров Д.В., Табоякова Л.А., Болотских Л.А., Ларюшина Н.А. «Доказательство наличия целевых белков — ß2m hom и HLA у гуманизированных трансгенных мышей линий HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 и HLA-C*07:02»
ностями в логистике, так и запредельно высокой стоимостью генно-модифициро-ванных животных, что приводит нас к необходимости обеспечения технологического суверенитета и развитию собственных центровполученияиподдержанияживотных-биомоделей.
В ФГБУН НЦБМТ ФМБА России был создан ряд линий мышей, гуманизированных и трансгенных по генам классического HLA I класса (А-, В- и С-). Данные животные несут в геноме генетическую конструкцию, кодирующую химерную молекулу главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I на поверхности клеток, состоящую из al-, а2-доменов HLA человека и а3-домена комплекса H-2K мыши, стабилизированную ß2-микроглобулином человека, соединённым глицин сериновым линкером с al-доменом HLA.
В данной работе нами проведены исследования, доказывающие состоятельность созданных биомоделей и их соответствие заявленным характеристикам по наличию функционально активного HLA I класса, стабилизированного ß2-микроглобулином человека. Определение ß2m hom в сыворотках крови трансгенных мышей, предварительно иммунизированных иммуноглобулином лошади с целью активации иммунной системы, показало наличие ß2m hom в концентрациях от 1000 до 1750 нг/мл, а результаты определения HLA A-, B- и C- в селезенке трансгенных мы-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES
1. Каркищенко В.Н., Болотских Л.А., Капанадзе Г.Д., Каркищенко Н.Н., Колоскова Е.М., Макси-менко С.В., Матвеенко Е.Л., Петрова Н.В., Рябых В.П., Ревякин А.О., Станкова Н.В., Семёнов Х.Х. Создание линий трансгенных животных-моделей с генами человека NAT1 и NAT2. Биомедицина. 2016;1:74-84. [Karkischenko V.N., Bolotskih L.A., Kapanadze G.D., Karkischenko N.N., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Matveyenko E.L., Petrova N.V., Ryabyh V.P., Revyakin A.O., Stankova N.V., Semenov H.H. Sozdanie linij trans-gennyh zhivotnyh-modelej s genami cheloveka NAT1
шей линий ^А-А*02:01, ^А-В*07:02, ^А-С*07:02 соответственно методом «сэндвич» ИФА наглядно подтвердили наличие белка ^А (А-, В- или С-) в экстрактах селезёнки всех трех групп экспериментальных животных. Полученные нами данные согласуются с результатами определения первичной последовательности трансгена, полученными методом секвенирования по Сэнгеру (см. статью «Доказательства трансгенности и гуманизированности у мышей, полученных в НЦБМТ ФМБА России, методом секвенирования по Сэнгеру» в этом номере журнала), т.е. доказывают наличие функционально активного трансгена не только на уровне транскрипции (мРНК), но и на уровне целевого белка.
Таким образом, созданные на базе НЦБМТ ФМБА России гуманизированные трансгенные линии мышей HLA-A*02:01, ^А-Б*07:02, ^А-С*07:02 отвечают заявленным характеристикам и могут быть использованы для исследований, направленных на решение широкого спектра научно-практических задач, включая исследования иммунных реакций, инфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний, разработку и тестирование вакцин и исследования в области фармако-безопасности и иммуногенности, а также для создания мультитрансгенных животных, несущих несколько разных аллелей HLA I класса, для обеспечения качественных исследований на новом уровне.
i NAT2 [Creation of lines of transgenic animal models with human NAT1 and NAT2 genes]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2016;1:74-84. (In Russian)].
2. Каркищенко Н.Н., Глотова Е.С., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Ларюшина Н.А., Петров Д.В., Васильева И.А., Дерябин К.Е. Генетический скрининг новой трансгенной гуманизированной по HLA-A*02:01:01:01 и hp2m линии мышей. Биомедицина. 2023;19(3E):10-24. [Karkischenko N.N., Glotova E.S., Petrova N.V., Slobodenyuk V.V., Laryu-shina N.A., Petrov D.V., Vasil'eva I.A., Deryabin K.E. Geneticheskij skrining novoj transgennoj gumanizirovan-
noj po HLA-A*02:01:01:01 i hß2m linii myshej [Genetic Screening of a New Transgenic Mice Line Humanized for HLA-A*02:01:01:01 and hß2m]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2023;19(3E):10-24. (In Russian)].
3. Каркищенко Н.Н., Лазарев В.Н., Манувера В.А., Бобровский П.А., Петрова Н.В., Колоскова Е.М., Глотова Е.С. Принципы создания генно-инженерной конструкции для получения гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-C*07:02:01:01, как прообраз инновационных трансгенно-нокаутных биомоделей. Биомедицина. 2024;20(1):8-20. [Karkischenko N.N., Lazarev V.N., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Petrova N.V., Koloskova E.M., Glotova E.S. Principy sozdaniya genno-inzhenernoj konstrukcii dlya polucheniya gu-manizirovannyh transgennyh myshej, nesushchih gen HLA-S*07:02:01:01, kak proobraz innova-cionnyh transgenno-nokautnyh biomodelej [Principles of Creation of a Genetic Engineering Construction for Obtaining Humanized Transgenic Mice with HLA-C*07:02:01:01, as a Promote of Innovative Transgenic and Knockout Biomodels]. Biomedicina [JournalBiomed]. 2024;20(1):8-20. (In Russian)].
4. Савченко Е.С., Огнева Н.С., Каркищенко Н.Н. Эмбриологические аспекты создания новой гуманизированной трансгенной линии мышей с интегрированным геном человека HLA A*02:01:01:01. Биомедицина. 2022;18(4):10-23. [Savchenko E.S., Ogneva N.S., Karkischenko N.N. Embriologicheskie aspekty sozdaniya novoj gumanizirovannoj transgen-noj linii myshej s integrirovannym genom chelove-ka HLA A*02:01:01:01 [Embryological Aspects of Creation a New Humanized Transgenic Mice with Integrated human HLA A*02:01:01:01 gene]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2022;18(4):10-23. (In Russian)].
5. Bailey S.L., Carpentier P.A., McMahon E.J., Begol-ka W.S., Miller S.D. Innate and Adaptive Immune Responses of the Central Nervous System. CRI. 2006;26(2). DOI: 10.1615/CritRevImmunol.v26.i2.40.
6. Boulanger L.M., Shatz C.J. Immune signalling in neural development, synaptic plasticity and disease. Nat. Rev. Neurosci. 2004;5(7):521-531. DOI: 10.1038/ nrn1428.
7. Cotsapas C., Voight B.F., Rossin E., et al. Pervasive Sharing of Genetic Effects in Autoimmune Disease. PLoS Genet. 2011;7(8):e1002254. DOI: 10.1371/jour-nal.pgen.1002254.
8. Cullheim S., Thams S. The microglial networks of the brain and their role in neuronal network plasticity after lesion. Brain Research Reviews. 2007;55(1):89-96. DOI: 10.1016/j.brainresrev. 2007.03.012.
9. Fernando M.M.A., Stevens C.R., Walsh E.C., et al. Defining the Role of the MHC in Autoimmunity: A Review and Pooled Analysis. Fisher EMC, ed. PLoS Genet. 2008;4(4):e1000024. DOI: 10.1371/journal. pgen.1000024.
10. Goddard C.A., Butts D.A., Shatz C.J. Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I. Proceedings of the
National Academy of Sciences. 2007;104(16):6828-6833. DOI: 10.1073/pnas.0702023104.
11. Huh G.S., Boulanger L.M., Du H., Riquelme P.A., Brotz T.M., Shatz C.J. Functional Requirement for Class I MHC in CNS Development and Plasticity. Science. 2000;290(5499):2155-2159. DOI: 10.1126/ science.290.5499.2155.
12. Illing P.T., Vivian J.P., Dudek N.L., et al. Immune self-reactivity triggered by drug-modified HLA-pep-tide repertoire. Nature. 2012;486(7404):554-558. DOI: 10.1038/nature11147.
13. Jagarlamudi K.K., Moreau L., Westberg S., Rönnberg H., Eriksson S. A New Sandwich ELISA for Quantification of Thymidine Kinase 1 Protein Levels in Sera from Dogs with Different Malignancies Can Aid in Disease Management. PLoS ONE. 2015;10(9):e0137871. DOI: 10.1371/journal.pone. 0137871.
14. Jones J.S., Partridge L. Population genetics: Tissue rejection: the price of sexual acceptance? Nature. 1983;304(5926):484—485. DOI: 10.1038/304484a0.
15. Matsuo R., Asada A., Fujitani K., Inokuchi K. LIRF, a Gene Induced during Hippocampal Long-Term Potentiation as an Immediate-Early Gene, Encodes a Novel RING Finger Protein. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2001;289(2):479-484. DOI: 10.1006/bbrc.2001.5975.
16. McCormack M., Alfirevic A., Bourgeois S., et al. HLA-A*3101 and Carbamazepine-Induced Hypersensitivity Reactions in Europeans. New England Journal of Medicine. 2011;364(12):1134-1143. DOI: 10.1056/NEJMoa1013297.
17. Nagami K., Matsumoto H., Maki E., et al. Experimental methods for immunization and challenge in antigenicity studies in guinea pigs. J. Toxicol. Sci. 1995;20(5):579-594. DOI: 10.2131/jts.20.5_579.
18. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974;22(12):1084-1091. DOI: 10.1177/22.12.1084.
19. Ohtsuka M., Inoko H., Kulski J.K., Yoshimura S. Major histocompatibility complex (Mhc) class Ib gene duplications, organization and expression patterns in mouse strain C57BL/6. BMC Genomics. 2008;9(1):178. DOI: 10.1186/1471-2164-9-178.
20. O'Keefe G.M., Nguyen V.T., Benveniste E.N. Regulation and function of class II major histocom-patibility complex, CD40, and B7 expression in macrophages and microglia: Implications in neurological diseases. Journal of NeuroVirology. 2002;8(6):496-512. DOI: 10.1080/13550280290100941.
21. Pandit L., Ban M., Sawcer S., et al. Evaluation of the established non-MHC multiple sclerosis loci in an Indian population. Mult. Scler. 2011;17(2):139-143. DOI: 10.1177/1352458510384011.
22. Patino-Lopez G., Hevezi P., Lee J., et al. Human class-I restricted T cell associated molecule is highly expressed in the cerebellum and is a marker for activated NKT and CD8+ T lymphocytes. Journal of Neuroimmunology. 2006;171(1-2):145-155. DOI: 10.1016/j.jneuroim.2005.09.017.
Каркищенко В.Н., Берзина А.Г., Петрова Н.В., Помыткин И.А., Глотова Е.С., Петров Д.В., Табоякова Л.А., Болотских Л.А., Ларюшина Н.А. «Доказательство наличия целевых белков — ß2m hom и HLA у гуманизированных трансгенных мышей линий HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 и HLA-C*07:02»
23. Raha-Chowdhury R., Andrews S.R., Gruen J.R. CAT 53: A protein phosphatase 1 nuclear targeting subunit encoded in the MHC Class I region strongly expressed in regions of the brain involved in memory, learning, and Alzheimer's disease. Molecular Brain Research. 2005;138(1):70-83. DOI: 10.1016/j.mol-brainres.2005.04.001.
24. Raychaudhuri S., Sandor C., Stahl E.A., et al. Five amino acids in three HLA proteins explain most of the association between MHC and seropositive rheumatoid arthritis. Nat. Genet. 2012;44(3):291-296. DOI: 10.1038/ng.1076.
25. Sasazuki T., Juji T., Morishima Y., et al. Effect of Matching of Class I HLA Alleles on Clinical Outcome after Transplantation of Hematopoietic Stem Cells from an Unrelated Donor. N. Engl. J. Med. 1998;339(17):1177-1185. DOI: 10.1056/NEJM 199810223391701.
26. The International HIV Controllers Study. The Major Genetic Determinants ofHIV-1 ControlAffect HLA Class I Peptide Presentation. Science. 2010;330(6010):1551-1557. DOI: 10.1126/science. 1195271.
27. Tonelli L.H., Postolache T.T., Sternberg E.M. Inflammatory genes and neural activity: involvement of immune genes in synaptic function and behavior. FBL. 2005;10(1):675-680. DOI: 10.2741/1562.
28. Wright P. F., Nilsson E., Van Rooij E.M.A., Lelenta M., Jeggo M.H. Standardisation and validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease diagnosis: -EN- -FR- -ES-. Rev. Sci. Tech. OIE. 1993;12(2):435-450. DOI: 10.20506/rst.12.2.691.
29. Xiao B.G., Link H. Immune regulation within the central nervous system. Journal of the Neurological Sciences. 1998;157(1):1-12. DOI: 10.1016/S0022-510X(98)00049-5.
30. Ziegler A., Kentenich H., Uchanska-Ziegler B. Female choice and the MHC. Trends in Immunology. 2005;26(9):496-502. DOI: 10.1016/j.it.2005.07.003.
31. Zinkernagel R.M., Doherty P.C. The discovery of MHC restriction. Immunology Today. 1997;18(1):14-17. DOI: 10.1016/S0167-5699(97) 80008-4.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ | INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Каркищенко Владислав Николаевич, д.м.н., проф., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Vladislav N. Karkischenko, Dr. Sci. (Med.), Prof., Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Берзина Ася Григорьевна*, к.б.н., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Asya G. Berzina*, Cand. Sci. (Biol.), Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Петрова Наталья Владимировна, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Помыткин Игорь Анатольевич, к.х.н., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Глотова Елена Сергеевна, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»;
e-mail: [email protected]
Nataliya V. Petrova, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Igor A. Pomytkin, Cand. Sci. (Chem.), Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Elena S. Glotova, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Петров Дмитрий Валерьевич, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»;
e-mail: [email protected]
Табоякова Лидия Александровна, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Болотских Любовь Александровна, к.с.-х.н., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Ларюшина Надежда Андреевна, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Dmitry V. Petrov, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Lidiya A. Taboyakova, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Lubov' A. Bolotskih, Cand. Sci. (Agricult.), Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Nadezhda A. Laryushina, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
* Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
