CC BY
74
ДНКАЗНАЯ И ОКСИДОРЕДУКТАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ПРИ СЕРОНЕГАТИВНЫХ СПОНДИЛОАРТРОПАТИЯХ
КУНДЕР Е.В.*. ГЕНЕРАЛОВ И.И. **.
ЛИТВЯКОВ А.М. *. ВОЛКОВА М.В.
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский
универститет»;
*кафедра госпитальной терапии,
**кафедра клинической микробиологии
Резюме. В работе изучена ДНКазная и оксидоредуктазная (каталазная, пероксидазная. супероксиддисмутазная) активность препаратов
поликлональных IgG из сыворотки крови больных серонегативными спондилоартропатиями (псориатическим артритом. анкилозирующим
спондилоартритом. реактивным урогенным артритом) и здоровых доноров крови. Уставновлено. что уровни ДНКазной. каталазной и
супероксиддисмутазной активности при всех изучаемых заболеваниях
достоверно превышали аналогичные показатели у доноров. Пероксидазная активность иммуноглобулинов. выделенных от здоровых доноров превышала аналогичный показатель у больных изучаемыми заболеваниями. что может быть связано с принадлежностью пероксидазной активности к областям молекулы ИГ. мало зависящим от их специфичности. Уровни
супероксиддисмутазной активности IgG коррелировали с показателями клеточного и гуморального иммунитета. Выявление у больных серонегативными спондилоартропатиями повышенных уровней ДНКазной. каталазной и супероксиддисмутазной активности подтверждает принадлежность данной патологии к аутоиммунным заболеваниям. указывает на роль каталитически активных иммуноглобулинов в их иммунопатогенезе. а определение уровней абзимной активности при различных заболеваниях этой группы может иметь дополнительное диагностическое значение.
Ключевые слова: серонегативные спондилоартропатии. поликлональные IgG. ДНК-азная. пероксидазная. каталазная. супероксиддисмутазная активность.
Abstract. Polyclonal IgG catalytic (DNAse. oxyreductase: catalase.
peroxydase and superoxydismutase) activity in patients with seronegative spondyloarthropathies (psoriatic arthritis. ankylosing spondyloarthritis. reactive arthritis) and healthy donors was evaluated. The levels of DNAse. catalase and superoxydismutase activities were significantly higher in seronegative spondyloarthropathy patients in comparison with healthy controls. The peroxydase IgG activity was more increased in donors than in patients with sponloarthropathies. that may by explaned of this activity to belong to non-specific IgG molecule regions. The superoxydismutase IgG activity showed correlation with the cellular and humoral indices of immune system. The detection of high IgG catalitic activity levels
in patients with seronegative spondyloarthropathies confirms autoimmune origin of these diseases. as well as indicates the role of abzymes in their immunopathogenesis; thus the evaluaton of catalitic activity levels may be of additional diagnostic significance in patients with seronegative spondyloarthropathies.
Адрес для корреспонденции: Республика
Беларусь. 210035. г. Витебск. пр. Победы. д.2.. кв. 48. тел. 80212215941. - Кундер Е.В.
К серонегативным спондилоартропатиям относят заболевания, характеризующиеся воспалительной болью в спине, поражением позвоночника, сакроилеальных сочленений, ассиметричным моно- или олигоартритом нижних конечностей, развитием энтезитов, семейной предрасположенностью, разнообразными экстраартикулярными проявлениями. Типичными представителями являются псориатический артрит (ПА), реактивные артриты (РеА) и анкилозирующий спондилоартрит (АС). Клиническое течение основных вариантов серонегативных спондилоартропатий имеет специфические особенности. Увеличивается число случаев раннего артрита, плохо поддающихся верификации с использованием доступных методов лабораторной и инструментальной диагностики. Клиническая картина поражения суставов отличается значительной гетерогенностью. Тяжелыми в диагностике случаями являются ранние стадии болезни с преобладанием артралгий без выраженных экссудативных и пролиферативных явлений, без характерных рентгенологических признаков поражения суставов. Таким образом, особенности современного течения серонегативных
спондилоартропатий определяют необходимость дальнейшего изучения вопросов их патогенеза, диагностики и лечебных мероприятий. Несмотря на то, что серонегативные спондилоартропатии рассматриваются как аутоиммунные заболевания с нарушением клеточных и гуморальных звеньев иммунитета, вопросы, связанные с каталитическими свойствами иммуноглобулинов (ИГ), появляющимися в организме в ходе поликлонального иммунного ответа, при данных заболеваниях не изучались.
Материалы и методы
Для исследования рандомизированным методом отобрано 30 больных (10
- с псориатическим артритом, 9 - с реактивным артритом и 11 - с анкилозирующим спондилоартритом) и 30 доноров крови. Доноры были обследованы и не имели в анамнезе никаких хронических, в том числе ревматологическиих заболеваний. Принадлежность заболеваний серонегативным спондилоартропатиям устанавливалась в соответствии с классификационными критериями спондилоартропатий Amor B. et al. [6].
В группе больных мужчин было 24 (80%), женщин - 6 (20%). Средний возраст пациентов составил 41,8±2,5, мужчин 38,4±2,5, женщин - 54,6±4,8 лет. Средняя продолжительность болезни была 7,2±1,3 лет. Все получали
предшествующее лечение. средняя длительность которого равнялась 3.4±0.6 лет.
Диагноз псориатического артрита выставлялся согласно критериям ММЫеБ [7] и диагностическим критериям Института ревматологии РАМН (1989) [5]. Из всех больных мужчин было 4 (40%). женщин - 6 (60%). Средний возраст мужчин составил 45.8±7.5. женщин - 54.3±4.9 лет. Средняя длительность заболевания равнялась 8.4±2.2 лет. Активность заболевания (по совокупности клинических и лабораторных данных) 1 степени имели 2 больных. 2 степени - 3. 3 степени - 5 больных. Рентгенологические стадии артрита имели следующее распределение: 1 стадия - 1 больной. 2 стадия - 4. 3 стадия - 4. 4 стадия - 1 больной. Недостаточность функций суставов 1 степени была установлена у 3 больных. 2 степени - у 7 больных. Ревматоидный фактор у всех больных был отрицательный. Продолжительность предшествующего лечения больных в данной группе составила 4.2±0.9 лет.
Группа больных реактивными артритами состояла из 9 мужчин. средний возраст которых составил 31 ±3.1 год. Средняя длительность заболевания равнялась 1.0±0.37 год. При рентгенологическом исследовании суставов полиартрит суставов стоп выявлен у 1 больного. коксит 2 степени - у 1 больного. сужение рентгенсуставных щелей крестцово-подвздошных сочленений у 2 больных. отсутствие их визуализации - у 1 больного. У одного больного выявлены остеофиты пяточных костей. Для диагностики урогенитальной инфекции у больных данной группы использовались методы микроскопии. бактериологические методы. а также РИФ и ПЦР. У 3 больных констатировано наличие хламидийной инфекции. у 1 больного - сочетание хламидийной инфекции и трихомониаза. у 1 - сочетание хламидийной. уреаплазменной инфекции и трихомониаза. у 3 - изолированная
уреаплазменная инфекция. Из внесуставных проявлений заболевания в данной группе выявлены следующие: баланит - у 1 больного. уретрит - у 4 больных. орхит - у 1 больного. конъюнктивит - у 1 больного. кератодермия стопы -также у 1 больного. Средняя длительность предшествующего лечения в данной группе больных составила 0.8±0.3 лет.
Группа больных анкилозирующим спондилоартитом была представлена 11 мужчинами. средних возраст которых составил 41.1 ±3.2 лет. Средняя длительность болезни в данной группе равнялась 10.6±2.1 лет При рентгенологическом исследовании позвоночника. крестцово-подвздошных сочленений. а также суставов (тазобедренных. коленных. суставов кистей и стоп) выявлены: двухсторонний сакроилеит 2-3 степени у 7 больных. полная облитерация данных суставов. их анкилоз - у 4 больных. признаки спондилита
- у 4 больных. синдесмофитоз позвоночника с формированием картины «бамбуковой палки» - у 4 пациентов. Рентгенологическая стадия 1 была констатирована у 1 больного. 2 стадия - также у 1 больного. 3 стадия - у 4 и 4 -также у 4 пациентов. Центральную форму заболевания имели 6 больных. Четверо больных демонстрировали ризомелический вариант с характерной клиникой поражения корневых суставов. у двух пациентов выявлена периферическая форм заболевания с вовлечение в патологический процесс
суставов кистей. Активность процесса 2 степени выявлена у 9 пациентов. активность 3 степени - у 3 человек. В 8 случаях течение заболевания признано медленно прогрессирующим. в 3 - медленно прогрессирующим с периодами обострения. Средняя продолжительность предшествующего лечения в данной группе составила 4.6±1.1 лет.
Доноры Витебской областной станции переливания крови были представлены мужчинами (17 человек - 57%). средний возраст которых составил 35±2.04 лет и женщинами (13 человек - 43%). средний возраст которых равнялся 38.7±2.0 лет.
Материалом для исследования послужили 1^0 подклассов 1. 2 и 4. Кровь инкубировали в течение 2 часов при температуре 4оС до образования сгустка. Затем центрифугировали 10-15 мин в центрифужных пробирках в центрифуге с бакетным ротором (1500 об/мин). Аккуратно забирали чистую сыворотку. К ней прибавляли охлажденный до 4оС 0.75 % раствор риванола в соотношении 1 объем риванола к 2 объемам сыворотки. Смесь инкубировали при температуре 4оС не менее 2 часов. Осадок отбрасывали. риванол из надосадочной жидкости удаляли адсорбцией на активированном угле. Далее проводили аффинную хроматографию. пропуская препарат через колонку с агарозой. конъюгированной с протеином А золотистого стафилококка. уравновешенную 0.1М фосфатным буфером со скоростью 6-7 капель в минуту. После этого колонку последовательно промывали 0.1М фосфатным буфером рН 7.4 с 1% раствором тритона Х-305. а затем без детергента в количестве 5-6 объемов колонки до исчезновения белка в элюенте. Далее колонку последовательно отмывали 0.3М раствором №С1 и 0.1М раствором цитрата. рН 5.0. Элюцию связавшихся иммуноглобулинов класса 0 (01.02.04) вели 0.1М глицин-НС1 буфером рН 2.8 до исчезновения белка в элюенте. Отбирали аликвоты. содержащие максимальное количество белка (определяли по разработанной нами микромодификации метода Бредфорд). Эти пробы объединяли. Их нейтрализовали 1М раствором Трис. рН 9.0 до рН 7.0-7.5. Препараты диализовали против изотонического раствора хлорида натрия. Полученный иммуноглобулины после диализа осветляли. центрифугируя в центрифуге с бакетным ротором при 3000 об/мин в течение 10 минут. Концентрацию белка в препарате определяли спектрофотометрически на длине волны 280 нм. Контроль чистоты полученных ИГ проводили с помощью электрофореза в полиакриаламидном геле в системе буферов по ЬаешшН с использованием 10% или 12% разделяющего геля в присутствии додецилсульфата натрия по методам. изложенным в [1]. Исходно гель окрашивали Кумасси Я250. По результатам электрофореза обнаруживалась одна белковая полоса. мигрирующая в зоне гамма-глобулинов (см. рисунок 1А). Увеличение белковой нагрузки на трек (см. рисунок 1В). а также окрашивание гелей нитратом серебра дополнительных полос не выявило. что свидетельствовало о гомогенности полученных 1^0.
А (5 мкг белка на трек) В (25 мкг белка на трек)
Рис.1. Электрофорез выделенных препаратов IgG в 12% ПАГ в присутствии SDS-Na, окраска Coomassie R250.
Изучались следующие виды каталитической активности полученных препаратов ИГ : ДНК-азная. каталазная. пероксидазная. супероксиддисмутазная.
Постановка реакции ДНКазной активности осуществлялась согласно методике. разработанной нами и апробированной на различных биологических моделях [2]. Использовались ИГ в концентрации 1 мг/мл в 0.1 мл пробы. В состав реакционной смеси кроме препаратов ИГ входили 0.1мл 0.02М трис-HCl буферного раствора pH 7.4. содержащего 0.002М раствор хлорида магния. а также 0.2 мл раствора ДНК в концентрации 700 мкг/мл. Реакция ставилась в дублях. Инкубация реакционной системы проводилась при 37оС 20 часов. Учет реакции производился визуально после добавления в пробы по 20 мкл 0.75% раствора риванола по величине образовавшихся сгустков нераспавшейся ДНК. В контрольных пробах в состав реакционной смеси вместо иммуноглобулинов вносили 0.1 мл ФР. Количественный учет производился в баллах. Сгусток оценивался как 0 баллов. рыхлый сгусток - 2 балл. рыхлый сгусток. хлопья. нити - 2 балла. хлопья. нити - 3 балла. хлопья. нити. распад - 4 балла. полный распад - 5 баллов.
Постановка реакции каталазной активности осуществлялась в планшетах для ИФА. В опытные лунки вносили: 0.05 мл раствора ИГ в концентрации 1 мг/мл. 0.05 мл ФР. 0.05 мл субстратно - буферной смеси (0.25 мл 3% перекиси водорода в 7.5 мл трис- HCl БР pH 7.4. После 2-х часовой инкубации реакционной системы при 37оС в термостате производилась остановка реакции 0.05 мл 10% раствора молибдата аммония. Реакция ставилась в дублях. В контрольные лунки вместо антител вносили 0.1 мл ФР. Остановка реакции производилась внесением 0.05 мл 10% раствора молибдата аммония. Количественный учет результатов реакции проводили путем регистрации
оптической плотности с помощью мультискана АИФ М/340 (длина волны 405 нм).
Постановка реакции пероксидазной активности осуществлялась в планшетах для ИФА. Пробы содержали по 0.1 мл каждого образца ИГ концентрации 1 мг/мл и 100 мкл индикаторной смеси. состоящей из 10 мл трис-НС1 БР pH 7.4 с 0.2 мл 3% перекиси водорода и 8 мг ОФД. В контрольные пробы вместо антител вносили ФР в объеме 0.1мл. После внесения ингредиентов осуществляли инкубацию при 37оС в термостате в течение 20 часов. Регистрацию оптической плотности осуществляли с помощью мультискана АИФ М/340 (длина волны 450 нм).
Постановка реакции супероксиддисмутазной активности осуществлялась в планшетах для ИФА с использованием модифицированной нами методики [4]. Пробы содержали по 0.15 мл раствора НСТ в концентрации 0.0004М на 0.15М фосфатном буфере. рН 7.8; 0.05 мл раствора ИГ в концентрации 1 мг/мл;
0.01 мл ФМС и 0.01 мл 0.00166М НАДН (конечная концентрация в реакционной смеси 70 мкМ). В контрольные лунки вместо раствора ИГ вносили
0.05 мл ФР. После перемешивания пробы инкубировали при 37оС в термостате в течение 10 минут. По окончании инкубации проводили учет реакции на мультискане АИФ М/340. определяя оптическую плотность образующегося из НСТ формазана при длине волны 570 нм.
Для каталазной и супероксиддисмутазной реакций формула расчета активности препарата ИГ имела следующий вид: А = (Ек - Ео)/ Ек*100%,
где А - активность препарата. Ек - средняя оптическая плотность контрольных проб. Ео - средняя оптическая плотность опытных проб.
для пероксидазной реакции формула расчета активности препарата ИГ имела следующий вид: А = Ео - Ек,
где А - активность препарата. Ек - средняя оптическая плотность контрольных проб. Ео - средняя оптическая плотность опытных проб.
Полученные результаты обрабатывались статистически на персональном компьютере АМБ Бешргои 2600+ с использованием пакета прикладных программ Statgгaphics 5.1.
Результаты
ДНК-азная активность антител. выделенных от всех больных ССА. достоверно (р<0.001) превышала таковую от доноров (2.43±0.25; 30
наблюдений. по сравнению с 0.83±0.24; 24 наблюдения). ДНК-азная активность ИГ при ПА достоверно (р<0.001) отличалась от донорского уровня (2.9±0.5; 10 наблюдений. по сравнению с 0.83±0.24; 24 наблюдения). ДНК-азная активность ИГ у больных РеА была несколько ниже. чем при псориатическом артрите. однако также достоверно (р<0.05) отличалась от величины данного вида активности среди здоровых доноров крови (1.88±0.035; 9 наблюдений. по сравнению с 0.83±0.24; 24 наблюдения). Уровень ДНК-азной активности у больных АС достоверно (р<0.001) отличался от донорского значения (2.45±0.35; 11 наблюдений. по сравнению с 0.83±0.24; 24 наблюдения). Уровни
ДНК-азной активности при изучаемых заболеваниях не различались между собой (р>0.05).
Уровень каталазной активности ИГ при ССА достоверно (р<0.001) отличался от величины данного вида активности у доноров крови (8.8±0.59; 21 наблюдение. по сравнению с 4.5±1.1; 17 наблюдений). Каталазная активность ИГ у больных ПА достоверно (р<0.05) превышала донорские значения (8.94±1.29; 8 наблюдений. по сравнению с 4.5±1.1; 17 наблюдений). Каталазная активность ИГ при РеА также достоверно (р<0.05) превышала таковую у здоровых лиц (8.91±0.95; 6 наблюдений. по сравнению с 4.5±1.1; 17 наблюдений). Каталазная активность ИГ у пациентов с АС имела значения. отличающиеся достоверно (р<0.05) от донорских значений (8.5±0.74; 7 наблюдений. по сравнению с 4.5±1.1; 17 наблюдений). Среди обследованных групп больных уровни каталазной активности между собой статистически не различались (р>0.05).
Пероксидазная активность ИГ у больных ССА была сопоставима с данной активностью у здоровых доноров крови (р>0.05) (0.0086±0.003; 30 наблюдений. по сравнению с 0.015±0.0029; 30 наблюдений). Уровень пероксидазной активности ИГ при ПА достоверно не отличался от такового у доноров крови (0.01±0.006; 10 наблюдений. по сравнению с 0.015±0.0029; 30 наблюдений). Значение пероксидазной активности ИГ у больных с РеА статистически не отличалась от донорского уровня (р>0.05) (0.011±0.0077; 9 наблюдений. по сравнению с 0.015±0.0029; 30 наблюдений). Уровни
пероксидазной активности ИГ у больных АС и доноров также статистически достоверно не различались (р>0.05) (0.0046±0.0016; 11 наблюдений. по сравнению с 0.015±0.0029; 30 наблюдений). При сравнении уровней
пероксидазной активности среди больных статистически достоверных различий между группами получено не было р>0.05).
Супероксиддисмутазная активность у больных ССА достоверно (р<0.001) превышала донорские значения данного вида активности (18.55±1.4; 30 наблюдений. по сравнению с -4.9±1.23; 28 наблюдений). СОД активность ИГ при ПА достоверно (р<0.001) отличалась от донорского уровня (18.05±2.38; 10 наблюдений. по сравнению с -4.9±1.23; 28 наблюдений). СОД активность ИГ у больных РеА была выше. чем при псориатическом артрите. а также достоверно (р<0.001) отличалась от величины данного вида активности среди здоровых доноров крови (20.7±2.13; 9 наблюдений. по сравнению с -4.9±1.23; 28 наблюдений). Уровень СОД активности у больных АС достоверно (р<0.001) отличался от донорского значения (17.2±2.8; 11 наблюдений. по сравнению с -4.9±1.23 ; 28 наблюдений). Уровни СОД активности при изучаемых
заболеваниях достоверно не различались между собой (р>0.05).
Проведено сопоставление величин абзимной активности с клиническими проявлениями заболеваний. данными лабораторных и инструментальных обследований. Численные показатели корреляционных соотношений
представлены в таблице.
Таблица
Результаты корреляционного анализа показателей абзимной активности и некоторых признаков серонегативных спондилоартропатий
Коррелирующие признаки Показатели корреляции
Коэффициент корреляции, r Уровень значимости, р
СОД-активность ИГ и Т-лимфоциты 0.97 Q.QQ57
СОД-активность ИГ и количество В-лимфоцитов 0.95 Q.Q42
СОД-активность и фагоцитарный индекс Q.97 Q.QQ42
СОД-активность ИГ и ЦИК Q.95 Q.QQ435
Каталазная активность ИГ и пульс-терапия медролом 0.66 Q.QQ17
Каталазная активность ИГ и доза медрола Q.74 Q.QQQ2
Обсуждение
Обнаружение ДНКазной активности ИГ при серонегативных спондилоартропатиях доказывает принадлежность данных заболеваний к аутоиммунным процессам. Факт преобладания данной активности при псориатическом артрите и болезни Бехтерева может свидетельствовать в пользу того. что при указанных заболеваниях выраженность аутоиммунной агрессии представлена в большей степени. чем при реактивных урогенных артритах. Обладающие ДНКазной активностью ИГ при серонегативных спондилоартритах могут оказывать непосредственное повреждающее воздействие на ткани. реализуя свои цитотоксические эффекты Фрагменты антител могут непосредственно влиять на внутриклеточный метаболизм [3]. Окислительно-восстановительная активность может иметь как патологическое. так и протективное значение. Среди исследованных нами видов каталитической активности наиболее вероятным протективным действием обладает каталазная активность. Косвенным доказательством этой гипотезы является факт корреляции между каталазной активностью и проводимым при изучаемых заболеванием лечением (дозой медрола и количеством проведенных сеансов и дозой препарата при пульс-терапии глюкокортикостероидными препаратами). Образование под действием антител большого количества метаболитов кислорода приводит к повреждению тканей. По мнению исследователей [8] антитела существенно влияют на протекание дыхательного взрыва в макрофагах. Взаимосвязь уровней СОД-активности ИГ при изучаемой патологии и показателей клеточного. гуморального иммунитета. и особенно фагоцитарной активности свидетельствует о содружественных изменениях в различных иммунопатологических и воспалительных звеньях развития данных заболеваний. а также о прямом участии каталитически активных антител в патогенезе серонегативных спондилоартропатий.
Преобладание пероксидазной активности ИГ у здоровых доноров крови может быть объяснено в связи с принадлежностью пероксидазной активности к
некоторым областям молекулы ИГ (в частности Fc-фрагментам). мало зависящим от их специфичности и отсутствием принадлежности данной активности к вариабельным участкам молекулы ИГ.
Выводы
1. При серонегативных спондилоартропатиях и артритах в крови пациентов циркулируют иммуноглобулины. обладающие собственной ДНКазной. каталазной. супероксиддисмутазной и пероксидазной активностью. Абзимы с указанными видами активности участвуют в патогенетических механизмах при данных заболеваниях.
2. Супероксиддисмутазная активность тесно связана при данных заболеваниях с показателями клеточного и гуморального иммунитета. а также фагоцитарной активностью клеток иммунной системы.
Литература
1. Генералов. И.И. Абзимная активность иммуноглобулинов/И.И. Генералов. - Витебск. 2000. - 167с.
2. Генералов. И.И. Абзимная активность препаратов IgG у больных ревматоидным артритом и системной красной волчанкой /И.И. Генералов. Е.В. Сидорская //Иммунология. - 1998. - №3. - С.54-56.
3. Иммунологическая регуляция клеточных функций: сб. науч. тр./ред. А.Ш. Зайчик;-Ленингр. педиатр. мед. ин-т. - Л.. 1988.-134с.
4. Методические подходы к определению окислительновосстановительной активности антител /И.И. Генералов. Т.Н. Борисевич. Е.В. Кундер [и др.] //Вестник ВГМУ. - 2005. - №3. - С.16-21.
5. Разработка и апробация диагностических критериев псориатического артрита /Э.Р. Агабабова. В.В. Бадокин. Ш. Эрдес [и др.]//Тер.архив.-1989.-№12.-С.117-121.
6. Amor. B. Les criteries de spondyloarthropathies criteries de classification et/ou daide au diagnostic? /B. Amor. M. Dougados. V. Listrat //Rev. Rheumatol.-1995.-Vol.62.-P.11-16.
7. Mathies. H. Psoriatic arthritis/H. Mathies//Acta Med. Austriaca.-1974.-Vol.1.-P.3-12.
8. Wentworth. P. Antibody design by man and nature/P. Wentworth//Science.-2002.- Vol.296.-P.2247-2249.
