CC BY
598
УДК 604:615.371 ШИФР СПЕЦИАЛЬНОСТЬ
https://doi.org/10.30895/2221-996X-2019-19-2-72-80 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
ДНК- и РНК-вакцины: современное состояние, требования к качеству и особенности проведения доклинических исследований
А. А. Горяев1*, М. В. Савкина1, Ю. И. Обухов1, В. А. Меркулов1,2, Ю. В. Олефир1
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051, Российская Федерация
2Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Трубецкая ул., д. 8, стр. 2, Москва, 119991, Российская Федерация
Обзор посвящен ДНК- и РНК-вакцинам, возможность использования которых была показана еще в конце XX века. При этом до сих пор ни одна вакцина, основанная на использовании бактериальных плазмид и мРНК, не нашла применения в практике здравоохранения для профилактики инфекционных заболеваний. Но, несмотря на это, интерес к вакцинам, действующим веществом которых являются рекомбинантные нуклеиновые кислоты, сохраняется из-за возможности их быстрой разработки, малозатратного производства, безопасности технологии и возможности активации клеточного и гуморального иммунитета. Последние технологические достижения в значительной степени преодолели проблемы низкой иммуногенности, нестабильности и трудности доставки при применении ДНК- и РНК-вакцин у человека. Цель работы — изложение основных стратегий создания ДНК- и РНК-вакцин, предназначенных для профилактики инфекционных заболеваний, обобщение требований к оценке их качества и проведению доклинических исследований. Представлены общие принципы создания плазмидных векторов, кодирующих протективные антигены. Описаны новые технологии создания ДНК-вакцин, плазмиды которых кодируют геном аттенуированного вируса ^ЫА и РР_Ж). Приведены стратегии создания РНК-вакцин на основе мРНК и самоамплифициру-ющихся РНК. Представлены современные регуляторные требования к выбору необходимых показателей качества и общим принципам проведения доклинических исследований ДНК- и РНК-вакцин. Ключевые слова: вакцина; ДНК-вакцина; плазмида; мини-кольцевые ДНК; РНК-вакцина; мРНК; РНК-репликон; самоамплифицирующиеся РНК; иммунизационная ДНК; РР_АУ
Для цитирования: Горяев АА, Савкина МВ, Обухов ЮИ, Меркулов ВА, Олефир ЮВ. ДНК- и РНК-вакцины: современное состояние, требования к качеству и особенности проведения доклинических исследований. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2019;19(2):72-80. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2019-19-2-72-80
*Контактное лицо: Горяев Артем Анатольевич; [email protected]
DNA and RNA Vaccines: Current Status, Quality Requirements and Specific Aspects of Preclinical Studies
A. A. Goryaev1*, M. V. Savkina1, Yu. I. Obukhov1, V. A. Merkulov12, Yu. V. Olefir1
1Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products, 8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation 2I. M. Sechenov First Moscow State Medical University, 8/2 Trubetskaya St, Moscow 119991, Russian Federation
This review focuses on DNA and RNA vaccines whose potential use was first considered at the end of the 20th century. However, not a single bacterial plasmid-based or mRNA vaccine has been used since that time in public healthcare for the prevention of infectious diseases. Nevertheless, vaccines containing recombinant nucleic acids as the active ingredient still attract interest due to the possibility of rapid development, low-cost production, safety of the technology and the potential to activate cellular and humoral immunity. Recent technological advances have largely overcome the problems of low immunogenicity, instability, and difficulties with the delivery of DNA and RNA vaccines in humans. The aim of this review was to present the main strategies of development of DNA and RNA vaccines designed to prevent infectious diseases, and to summarise requirements for the quality control and preclinical studies. The article examines the general principles of creation of plasmid vectors encoding protective antigens. It describes new technologies used in the creation of DNA vaccines with plasmids encoding an attenuated virus genome (iDNA and PPLAV), and RNA vaccines based on mRNA and self-amplifying RNAs. The article presents current regulatory requirements for the choice of quality parameters to be tested and the general principles of preclinical studies of DNA and RNA vaccines.
Key words: vaccine; DNA vaccine; plasmid; mini-circle DNA; RNA vaccine; mRNA; RNA replicon; self-amplifying RNA; iDNA; PPLAV
(CC) ]
For citation: Goryaev AA, Savkina MV, Obukhov YuI, Merkulov VA, Olefir YuV. DNA and RNA vaccines: current status, quality requirements and specific aspects of preclinical studies. BIOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie = BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2019;19(2):72-80. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2019-19-2-72-80
Corresponding author: Artem A. Goryaev; [email protected]
Сокращения: АПК — антигенпрезентирующая клетка (antigen presenting cell, APC); дцДНК — двухце-почечная ДНК (double-stranded DNA, dsDNA); кДНК — комплементарная ДНК; BAC — бактериальная искусственная хромосома (bacterial artificial chromosome); IRES — участок внутренней посадки рибосомы (internal ribosome entry site); MHC — главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex); PAMP — патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (pathogen-associated molecular patterns); TLR — Toll-подобные рецепторы (Toll-like receptor); UTR — нетранслируемые области (untranslated regions); VEGF — фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor).
Возможность использования плазмидной ДНК и мРНК для индуцирования клеточного и гуморального иммунного ответа была показана еще в начале 1990-х годов [1-5]. Применение данных технологий представлялось очень перспективным для профилактики инфекционных заболеваний в силу простоты создания подобных векторов, кодирующих протективные антигены. Но, несмотря на проведение более 500 различных клинических исследований1 за более чем 25 лет, ни одна ДНК- или РНК-вакцина не была зарегистрирована и разрешена к применению у людей для профилактики инфекционных заболеваний [5-9]. В настоящее время лицензированы только три препарата в ветеринарии (Apex-IHN, LifeTide® SW5, ONCEPT) и один ге-нотерапевтический лекарственный препарат для медицинского применения (Неоваскулген®)2, действующим веществом которых являются плазмиды, что может свидетельствовать о безопасности данной технологии [10, 11].
Основными проблемами применения ДНК-вакцин, выявленными в ходе клинических исследований, являлись низкая трансфекция клеток человека in vivo, слабая иммуногенность и необходимость повторных бустерных вакцинаций высокими дозами ДНК. Главными проблемами использования мРНК были нестабильность молекулы и неэффективность ее доставки. Но, несмотря на это, ДНК- и РНК-вакцины продолжают вызывать значительный интерес из-за возможности активации гуморального и клеточного иммунитетов, простоты их производства, стабильности при высоких температурах по сравнению с традиционными вакцинами, что позволит отказаться от соблюдения холодовой цепи.
Цель работы — изложение основных стратегий создания ДНК- и РНК-вакцин, предназначенных для профилактики инфекционных заболеваний, обобщение требований к оценке их качества и проведению доклинических исследований.
В работе не рассматриваются вопросы использования плазмид и РНК для создания препаратов, направленных для профилактики и/или лечения неинфекционных заболеваний, в качестве векторов в генной или клеточной терапиях, а также ДНК- и РНК-вакцины, полученные путем химического синтеза.
ДНК-вакцины
В связи с отсутствием общепринятого определения под ДНК-вакцинами в статье будут пониматься вакцины, действующим веществом которых являются рекомбинантные плазмиды, содержащие ген или гены, кодирующие один или несколько протективных антигенов, и способные стимулировать иммунный ответ против инфекционного заболевания.
Как правило, в плазмидах помимо трансгена содержатся эукариотические промоторы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии протективных антигенов, энхансеры транскрипции (например, интрон А или SV40), сайты полиаденилирования
1 https://clinicaltrials.gov
2 http://grls.rosminzdrav.ru
и терминации транскрипции. Кроме того, плазмиды содержат гены резистентности к антибиотикам, являющиеся селектируемыми маркерами, и сайты репликации, обеспечивающие увеличение копийности в бактериальной клетке [4, 7, 9, 11, 12].
ДНК-вакцины, содержащие несколько трансгенов в одной плазмиде, получают путем создания полицистронных векторов, обеспечивающих коэкспрессию трансгенов в цис-положении [5]. Достижение мультигенной коэкспрессии в таких плазмидах может достигаться путем использования независимых промоторов для каждого трансгена, IRES, трансляционных/посттрансляционных модификаций, «саморасщепляющихся» пептидов или получения гибридного (слитого) белка [12, 13].
Общий механизм действия ДНК-вакцин представлен на рисунке 1. Считается, что презентация антигена может происходить тремя возможными механизмами:
1) плазмидная ДНК экспрессируется в соматических клетках (например, миоцитами) и представляется их MHC класса I CD8+ Т-клеткам;
2) АПК (например, дендритные клетки), привлеченные к месту инъекции, трансфицируются плазмидной ДНК, и экс-прессированные антигены представляются Т-клеткам через МНС класса I и МНС класса II;
3) АПК фагоцитируют трансформированные соматические клетки, что приводит к перекрестному праймированию и презентации антигена как CD4+, так и CD8+ T-клеткам. Поскольку соматические клетки не способны представлять антиген через MHC класса II Т-хелперным клеткам, прямое или косвенное представление АПК является наиболее вероятным путем [12].
Также введение ДНК-вакцин может приводить к активации врожденного иммунитета за счет распознания PAMP, например неметилированные CpG-мотивы или дцДНК [12, 14]. Еще одним из возможных способов повышения эффективности ДНК-вакцин является включение в плазмиду генов цитокинов, хемокинов, иммуностимулирующих молекул или ингибиторов иммуносупрессивных путей [12].
Мини-кольцевые ДНК
Одна из стратегий модификаций плазмид направлена на исключение «ненужных» бактериальных последовательностей (маркеры селекции и ori сайты) в клетке человека, но с сохранением экспрессируемой конструкции за счет образования мини-кольцевой ДНК. Мини-кольцевые ДНК получают из исходной плазмиды с использованием различных ре-комбиназных систем (фаговая интеграза, рЬЮ31-рекомбиназа, Flp-рекомбиназа, ParA-резолваза и Cre-рекомбиназа) или посредством сайт-специфической рекомбинации. Считается, что применение мини-кольцевых ДНК позволит упростить доставку в клетки человека за счет меньшего размера вектора, повысить экспрессию антигена, так как в некоторых случаях ori сайты способны к сайленсингу трансгена, увеличить персистенцию
Рис. 1. Схематическое изображение механизма действия ДНК- и РНК-вакцин:
—>■ механизм действия ДНК-вакцин: в ядре трансформированных клеток происходит транскрипция с образованием мРНК, кодирующая последовательность антигена. мРНК транспортируется в цитоплазму, в которой происходит трансляция. Синтезированный белок может секретироваться через аутокринные, паракринные или эндокринные механизмы из клетки либо процессироваться с последующим связыванием и представлением белками MHC I (всеми клетками) и MHC II (только АПК);
—► механизм действия ДНК-вакцин, кодирующих аттенуированный вирус: в ядре трансформированных клеток происходит транскрипция с образованием инфекционной вирусной РНК, способной инициировать ограниченную репликацию аттенуированного вируса;
—>■ механизм действия РНК-вакцин: экзогенная РНК проникает в клетку за счет клеточно-специфических механизмов (например, макропиноцитоз в незрелых дендритных клетках), в которой происходит ее трансляция c использованием клеточного механизма синтеза белка. Синтезированный белок может секретироваться через аутокринные, паракринные или эндокринные механизмы из клетки либо процессироваться с последующим связыванием и представлением белками MHC I (всеми клетками) и MHC II (только АПК).
Fig. 1. Schematic presentation of the mechanism of action of DNA and RNA vaccines:
—>■ mechanism of action of DNA vaccines: transcription that takes place in the nucleus of transformed cells results in the formation of mRNA encoding the antigen sequence. The mRNA is transported to the cytoplasm where translation takes place. The synthesised protein may be secreted from the cell via autocrine, paracrine, or endocrine mechanisms, or be processed with subsequent binding and presentation by MHC I proteins (all cells) and MHC II proteins (only APCs);
—>■ mechanism of action of DNA vaccines encoding an attenuated virus: transcription that takes place in the nucleus of transformed cells results in the formation of infectious viral RNA which is capable of initiating limited replication of the attenuated virus;
—>■ mechanism of action of RNA vaccines: exogenous RNA penetrates into the cell by means of cell-specific mechanisms (e. g. macropinocytosis in immature dendritic cells), then the RNA translation takes place with the aid of the cell mechanism of protein synthesis. The synthesised protein may be secreted from the cell via autocrine, paracrine, or endocrine mechanisms, or be processed with subsequent binding and presentation by MHC I proteins (all cells) and MHC II proteins (only APCs).
в организме человека. Также это повысит безопасность применения за счет уменьшения потенциальной возможности интеграции вектора в геном, снижения возможной иммуно-токсичности и риска горизонтального переноса генов антибио-тикорезистентности в клетки микробиоты человека [5, 15-17].
Технология мини-кольцевых ДНК активно используется в разработке новых методов лечения неинфекционных заболеваний, но для профилактики инфекционных заболеваний не получила широкого развития. В настоящее время ведется разработка только одной перспективной вакцины для профилактики и лечения лейшманиоза — LEISHDNAVAX [18].
ДНК-вакцины, плазмиды которых кодируют геном
аттенуированного вируса
Еще одним из направлений совершенствования ДНК-вакцин является использование плазмид для in vivo доставки в клетки человека кДНК генома аттенуированных
одноцепочечных (+/-)РНК вирусов. Так, компания Medigen, Inc. (США) разработала технологию «иммунизационной» ДНК (iDNA, immunization DNA) на основе рекомбинантной BAC, которая кодирует полноразмерную геномную РНК аттенуированного вируса под промотором цитомегаловируса и фланкированную цис-регуляторными элементами [19]. После введения в клетку iDNA происходит транскрипция с образованием геномной РНК аттенуированного вируса. Вирусная РНК инициирует ограниченную репликацию вируса в клетке с последующей сборкой, созреванием и выходом вируса (рис. 1). В настоящее время данная технология применяется для разработки вакцин для профилактики различных вирусных инфекций, вызываемых альфавирусами (вирусы Чикунгунья и венесуэльского энцефаломиелита лошадей) и флавивиру-сами (вирусы Денге, Зика, японского энцефалита и желтой лихорадки) [19, 20].
Еще одной подобной технологией является PLLAV3 (plasmid launched live attenuated virus), разрабатываемая исследовательской группой проф. J. Neyts из Левенского католического университета (Бельгия). Как и в iDNA, в PLLAV в качестве вектора используется BAC [21]. Возможность применения технологии PLLAV была показана на примере клонирования аттенуированного вируса желтой лихорадки штамма 17D. Индуцированный иммунный ответ на введение PLLAV-YFV17D оказался сопоставим с ответом на введение лицензированной вакцины Stamaril® на различных видах животных4. Отличительной особенностью PLLAV от iDNA является возможность создания химерных конструкций вирусной кДНК, в которую могут быть встроены гетерологичные последовательности других вирусов [21]. Доказательство данной концепции уже продемонстрировано на нескольких видах животных с использованием химерных PLLAV, содержащих антигены вирусов японского энцефалита, гепатита В, Зика и бешенства. Разрабатываемая гибридная вакцина RABYD-VAX5 против бешенства и желтой лихорадки финансируется программой «Horizon 2020» (Восьмая рамочная программа Европейского союза по развитию научных исследований и технологий). Еще одним возможным применением подобных технологий является их использование в производстве традиционных живых вирусных вакцин, что, возможно, позволит сократить материально-технические затраты и повысить стабильность получения вакцин.
Преимуществами вакцин, плазмиды которых кодируют геном аттенуированного вируса, являются: 1) высокая имму-ногенность, сопоставимая с применением живых вирусных вакцин; 2) генетическая стабильность; 3) быстрая разработка подобных вакцин; 4) возможность введения целевых мутаций для повышения безопасности и иммуногенности; 5) масштабируемость производства, основанного на культивировании E. coli, и отсутствие необходимости использования клеточных культур или куриных эмбрионов; 6) возможность хранения без использования холодовой цепи; 7) безыгольное применение. Недостатками же являются отсутствие вакцинных штаммов многих патогенных вирусов, трудности в получении полноразмерных кДНК из-за их нестабильности в клетках E. coli, использование плазмид, транскрипция которых происходит в ядре эукариотических клеток, что может привести к деградации или инактивации инфекционной геномной РНК в ядре, возможным проблемам при транспорте РНК в цитоплазму, а также отсутствие данных о длительности персистенции инфекционных геномных РНК.
РНК-вакцины
В настоящее время для создания РНК-вакцин применяются два основных подхода: 1) использование нереплицирующейся мРНК, кодирующей, как правило, только один антиген; 2) получение самоамплифицирующегося РНК-репликона из одно-цепочечных (+/-)РНК вирусов, в геноме которых структурные гены заменены на гены, кодирующие необходимые антигены и РНК-полимеразу [8, 22, 23].
мРНК-вакцины
Вакцины на основе мРНК получают путем транскрипции in vitro из линейной ДНК-матрицы, в качестве которой выступает плазмида, с использованием различных РНК-полимераз бактериофагов. Синтезированная мРНК помимо кодирующей последовательности должна содержать кэп-структуру на 5'-конце, UTR и полиаденилирование на З'-конце (рис. 2), необходимые для эффективной трансляции, защиты мРНК от экзонуклеаз и правильного сплайсинга транскрипта.
Существуют два основных подхода к добавлению кэп-структуры на 5'-конец мРНК. Первый основан на использовании ферментов вируса коровьей оспы, один из которых добавляет m7GpppN, а второй — 2-О-метильную группу к предпоследнему нуклеотиду, в результате формируется 5'-кэп, идентичный по структуре эукариотическим мРНК. Второй, наиболее часто используемый подход, заключается во включении синтетических аналогов (например, антиреверсные ARCAs или m27 3-OGpppG) при транскрипции in vitro [24-27].
Добавление UTR, содержащих различные регуляторные элементы, используется для повышения эффективности трансляции и повышения стабильности мРНК. Например, введение 3'-UTR гена а-глобина или 5'-, 3'-UTR гена р-глобина стабилизирует мРНК [24, 26, 28]. В случаях необходимости быстрой деградации мРНК в 3'-UTR могут включаться элементы, богатые аденин-урацил последовательностями [29]. Поли(А)-хвост может быть сконструирован путем введения последовательностей тими-на в ДНК, что является более предпочтительным подходом, так как использование рекомбинантной поли(А)-полимеразы для удлинения транскрибированной РНК in vitro после транскрипции часто приводит к образованию поли(А)-хвостов различной длины.
Еще одним способом «улучшить» свойства мРНК-вакцин является использование химически модифицированных ну-клеотидов. Например, включение модифицированного псев-доуридина повышает стабильность и трансляцию РНК, также включение химически модифицированных нуклеотидов приводит к снижению иммуногенности векторов [28].
Ьааааа„ 3'
asp! а nsp2 а ЕзрЗ
I—AAAAA. 3'
Рис. 2. Структурные элементы РНК-вакцин [30, 31]: a — мРНК вакцина состоит из кэп-структуры на 5'-конце, 5'-UTR, открытой рамки считывания (ORF), кодирующей протективный антиген, 3'-UTR и полиаденилированный З'-конец; b — самоамплифицирующиеся РНК-вакцины, как правило, создаются из генома альфавирусов, в котором остаются неструктурные гены (nsp), а структурные гены (капсида и E2/E1) заменены на чужеродный ген (GOI). Fig. 2. Structural elements of RNA vaccines [30, 31]: a — an mRNA vaccine consists of a cap structure at the 5'-end, 5'-UTR, open reading frame (ORF) encoding the protective antigen, 3'-UTR, and polyadenylated 3'-end; b — self-amplifying RNA vaccines are generally created from an alphavirus genome which contains nonstructural genes (nsp), and in which structural genes (capsid and E2/E1) were replaced by a foreign gene (GOI).
3 https://rega.kuleuven.be/cmt/jn/viruses/pllav-a-plasmid-based-live-attenuated-vaccine-technology
4 https://www.who.int/immunization/research/forums_and_initiatives/gvirf/Johan_Neyts_2018.pdf?ua=1
■ https://rabyd-vax.eu
a
b
Самоамплифицирующиеся РНК-вакцины (РНК-репликоны)
РНК-репликоны получают путем замены структурных генов на гены, кодирующие антигены, и сохранением неструктурных генов, отвечающих за репликацию вируса. Также самоамплифицирующиеся РНК-вакцины содержат основные элементы мРНК-вакцин: кэп, 5'-UTR, 3'-UTR и поли(А)-хвост (рис. 2). Наиболее изученные РНК-репликоны были получены из геномов альфавирусов, таких как вирусы Синдбиса, леса Сем-лики и Венесуэльского энцефаломиелита лошадей [25, 30, 31]. После введения в эукариотические клетки РНК-репликон самоам-плифицируется с использованием комплекса РНК-полимеразы репликона, при этом образование вирусных частиц невозможно из-за отсутствия структурных генов [25, 30]. Главным преимуществом применения технологии самоамплифицирующихся РНК является их способность к образованию большого количества антигена, и, соответственно, получение более сильного иммунного ответа, что позволит уменьшить вводимую дозу вакцины.
Регуляторные требования к ДНК- и РНК-вакцинам
Как уже было отмечено, в настоящее время в мире не лицензирована ни одна ДНК- и РНК-вакцина для профилактики инфекционных болезней, вместе с тем Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и некоторыми национальными ре-гуляторными органами опубликованы руководящие принципы и руководства, рассматривающие требования и подходы к обеспечению качества ДНК- и РНК-вакцин и проведению их доклинических исследований. Руководящие принципы ВОЗ, опубликованные в 2007 г., содержат информацию и рекомендации для национальных регуляторных органов и производителей относительно контроля качества и доклинических исследований ДНК-вакцин6. Многие аспекты руководящих принципов могут применяться и к РНК-вакцинам, за исключением подходов к доклиническим исследованиям.
В США в 2005 г. Управление по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств (FDA) разработало руководство «Considerations for plasmid DNA vaccines for infectious disease indications»7 («Вопросы, связанные с плаз-мидными ДНК-вакцинами, применяемыми для профилактики инфекционных заболеваний»), в котором содержатся рекомендации по описанию производственного процесса, тестированию и объему проведенных доклинических исследований, необходимых для получения разрешения на проведение клинических исследований [32].
В Европейском союзе на сегодняшний момент отсутствуют руководства для оценки качества и проведению доклинических и клинических исследований ДНК- и РНК-вакцин, за исключением документа Европейского агентства по лекарственным средствам (EMA) «Concept paper on guidance for DNA vaccines»8 («Документ-концепция для руководства по ДНК-вакцинам»), в котором содержится информация о необходимости разработки такого руководящего документа. Некоторые вопросы оценки качества и проведения доклинических исследований, которые могут быть применены к ДНК- и РНК-вакцинам, рассмотрены в «Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products»9 («Руководство по качеству, докли-
ническим и клиническим аспектам разработки генотерапевтиче-ских препаратов»), но необходимо отметить, что в Европейском союзе согласно директиве комиссии 2009/120/ЕС10 от 14 сентября 2009 г. вакцины против инфекционных заболеваний не относятся к генотерапевтическим лекарственным препаратам.
В Российской Федерации также отсутствуют специализированные руководства и рекомендации по исследованию ДНК-и РНК-вакцин. Основные требования к качеству ДНК-вакцин отражены в Государственной фармакопее Российской Федерации (ГФ РФ) XIV издания11.
Специализированных требований к качеству и доклиническим исследованиям безопасности и иммуногенности РНК-вакцин в настоящее время не разработано ни в одной стране мира. Частично это связано с тем, что многие подходы, применяемые для ДНК-вакцин, можно использовать и для РНК-вакцин, но создание новых технологий и увеличение количества клинических исследований РНК-вакцин, возможно, приведет к разработке такого специализированного документа.
Требования к оценке качества
Выбор показателей качества ДНК- и РНК-вакцин необходимо проводить с учетом используемого вектора, метода доставки, трансгена, физико-химических свойств вакцин, способа/пути введения, технологического процесса, а также требований ГФ РФ XIV издания. Нормы и аналитические методики, используемые для контроля качества вакцин, должны быть обоснованными, в том числе и валидационными данными.
В таблице 1 представлены показатели и методы, необходимые для оценки качества ДНК- и РНК-вакцин. Необходимо учитывать, что для оценки качества вакцины могут потребоваться дополнительные показатели качества, например для лиофилиза-тов необходима оценка потери в массе при высушивании, время растворения (диспергирования), для растворов — прозрачность, цветность, извлекаемый объем, механические включения и т. д.
Описание должно отражать характеристику вакцины с учетом ее физико-химических свойств, например для растворов для инъекций приводится характеристика прозрачности и цветности раствора, а для лиофилизатов — описание лиофилизи-рованной массы и описание восстановленного раствора.
Выбор метода для определения подлинности должен зависеть от свойств и характеристик вакцины. Например, могут использоваться рестрикционный анализ (при этом выбор используемых рестриктаз будет зависеть от ДНК-конструкции), ПЦР, секвенирование, ВЭЖХ, капиллярный электрофорез, биологические in vivo или in vitro методы, позволяющие определить экспрессию антигена. Если в состав вакцины входят липиды, липоплексы или другие системы доставки, то их подлинность также должна подтверждаться соответствующими методами.
Специфическую активность можно оценить с помощью различных in vivo и/или in vitro методов с учетом предполагаемого применения, экспрессируемого антигена и его биологической активности. При наличии релевантной биологической модели предпочтительным методом является определение иммуногенности вакцины. Применение биологических методов in vitro, например методов измерения экспрессируемого антигена, должно коррелировать с иммуногенностью вакцины12. Для
6 Guidelines for assuring the quality and nonclinical safety evaluation of DNA vaccines. WHO; 2007.
7 Guidance for industry: considerations for plasmid DNA vaccines for infectious disease indications. FDA; 2007.
8 Concept paper on guidance for DNA vaccines (EMEA/CHMP/308136/2007). EMA; 2007.
9 Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products (EMA/CAT/80183/2014). EMA; 2018.
10 Commission Directive 2009/120/EC. https://ec.europa.eu/health/sites/health/files/files/eudralex/vol-1/dir_2009_120/dir_2009_120_en.pdf
11 Общая фармакопейная статья 1.7.1.0013.18 ДНК-вакцины. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 2; 2018.
12 Guidelines for assuring the quality and nonclinical safety evaluation of DNA vaccines. WHO; 2007. Guidance for industry: considerations for plasmid DNA vaccines for infectious disease indications. FDA; 2007.
Таблица 1. Перечень показателей и методов, необходимых для оценки качества ДНК- и РНК-вакцин Table 1. Test parameters and test methods used for the quality control of DNA and RNA vaccines
ДНК-вакцины DNA vaccines РНК-вакцины RNA vaccines
Показатель Test parameter Метод Test method Показатель Test parameter Метод Test method
Описание Appearance Визуальный Visual method Описание Appearance Визуальный Visual method
Подлинность: •плазмиды • системы доставки (в случае использования) Identification: • plasmids • delivery systems (if used) рестрикционный анализ, ПЦР, секвениро-вание, капиллярный электрофорез, ВЭЖХ, ИФА, биологический и др.; в зависимости от системы доставки restriction analysis, PCR, sequencing, capillary electrophoresis, HPLC, EIA, biological analysis, etc.; dependinq on the delivery system used Подлинность: •плазмиды • системы доставки (в случае использования) Identification: • plasmids • delivery systems (if used) ПЦР, ВЭЖХ, капиллярный электрофорез, биологическии и др.; в зависимости от системы доставки PCR, HPLC, capillary electrophoresis, biological analysis, etc.; dependinq on the delivery system used
Специфическая активность: • количество действующего вещества в одной дозе • иммуногенность Specific activity: • amount of the active ingredient in one dose • immunoqenicity ВЭЖХ, капиллярный электрофорез, спек-трофлуориметрия и др.; биологический, ИФА и др. HPLC, capillary electrophoresis, spectrofluorom-etry, etc.; bioloqical analysis, EIA, etc. Специфическая активность: • количество действующего вещества в одной дозе • иммуногенность Specific activity: • amount of the active ingredient in one dose • immunoqenicity QuantiGene, спектрофлуориметрия и др.; биологический, ИФА и др. QuantiGene, spectrofluorometry, etc.; bioloqical analysis, EIA, etc.
Чистота: • остаточные белки клетки-хозяина • остаточная ДНК штамма-продуцента • остаточная РНК • родственные примеси (конформационная форма плазмиды) • примеси (антибиотики, остаточные органические примеси и др.) Purity: • residual host cell proteins • residual host cell DNA • residual RNA • related substances (plasmid conformational form) • impurities (antibiotics, residual organic impurities, etc.) ИФА и др.; Threshold, количественная ПЦР и др.; ВЭЖХ и др.; ВЭЖХ или капиллярный электрофорез; в зависимости от примесей EIA, etc.; Threshold, quantitative PCR, etc.; HPLC, etc.; HPLC or capillary electrophoresis; depending on the type of impurity Чистота: • остаточные белки (клетки-хозяина, ДНК-азы, РНК-полимеразы) • остаточная ДНК • примеси (РНК-полимераза, антибиотики, остаточные органические примеси и др.) Purity: • residual proteins (of the host cell, DNase, RNA polymerase) • residual DNA • impurities (RNA polymerase, antibiotics, residual organic impurities, etc.) ИФА и др.; Threshold, количественная ПЦР и др.; в зависимости от примесей EIA, etc.; Threshold, quantitative PCR, etc.; depending on the type of impurity
Стерильность Sterility Метод прямого посева или мембранной фильтрации Direct inoculation method or membrane filtration Стерильность Sterility Метод прямого посева или мембранной фильтрации Direct inoculation method or membrane filtration
Пирогенность или Бактериальные эндотоксины Pyroqenicitv or Bacterial endotoxins Биологический или ЛАЛ-тест Bioloqical analysis or LAL test Пирогенность или Бактериальные эндотоксины Pyroqenicitv or Bacterial endotoxins Биологический или ЛАЛ-тест Bioloqical analysis or LAL test
Аномальная токсичность Abnormal toxicity Биологический Bioloqical analysis Аномальная токсичность Abnormal toxicity Биологический Bioloqical analysis
ш о о
ш «
CD
СЛ Ш
Ш >2"
CD
3
CD
CO CD
s g
' CD
со =n
ДНК-вакцин, плазмиды которых кодируют геном аттенуированного вируса, возможно определение показателя биологической активности методами титрования на культурах клеток либо при постановке ПЦР.
Для определения количественного содержания плазмиды или РНК в вакцине наиболее часто используются спектрофо-тометрические методы (по отношению поглощения при длинах волн 260/280 нм для ДНК и 260/230 нм для РНК). Однако использование различных систем доставок будет затруднять применение таких методов, поэтому потребуется разработать способы, обеспечивающие разрушение используемых систем доставки.
Для ДНК-вакцин важным является определение конфор-мационной формы плазмиды, так как плазмидная ДНК может присутствовать в трех формах (суперскрученная, открытая кольцевая и линейная), и данные об их относительной активности in vivo недостаточны. Считается, что содержание супер-скрученной формы должно быть не менее 80 % относительно всех форм, но выбор нормы должен быть обоснован с учетом возможного влияния на эффективность.
В ДНК- и РНК-вакцинах основными примесями будут являться остаточные ДНК, РНК и белки клеток хозяина, антибиотики, добавляемые в питательную среду, ферменты (РНК-полимеразы, РНК-азы, ДНК-азы и др.), специфические химические примеси, связанные с системой доставки, и остаточные органические примеси. Выбор испытаний и методик для оценки чистоты может быть основан на анализе рисков (например, высокое содержание остаточной ДНК или РНК будет приводить к иммунотоксичности) и способности к последовательному удалению примесей в процессе производства. Возможно проведение испытаний на определенных этапах производства и при контроле фармацевтической субстанции.
Для обеспечения единообразия и минимизации возможных отклонений, в первую очередь при определении подлинности и специфической активности (иммуногенности) ДНК- и РНК-вакцин, необходимо использование стандартных образцов. В настоящее время отсутствуют специализированные международные стандартные образцы для данных типов вакцин, поэтому в качестве стандартного образца рекомендуется использовать стандартный образец предприятия (СОП), в качестве которого могут быть использованы образцы одной серии вакцины либо промежуточного продукта вакцины. Кан-дидатный образец в СОП должен быть охарактеризован по составу, чистоте, специфической активности и другим характеристикам для обеспечения целей испытаний13.
Особенности проведения доклинических исследований
Целью доклинических исследований ДНК- и РНК-вакцин является исследование безопасности и иммунологических свойств на соответствующих in vivo и in vitro моделях. По возможности следует использовать релевантные виды животных, иммунобиологический ответ которых на вводимый вектор и экспрессируемый антиген будет аналогичен ответу у людей. Доклинические исследования ДНК- и РНК-вакцин должны соответствовать общим требованиям и принципам доклиниче-
ских исследований вакцин с учетом используемой технологии создания вектора, выбранной конструкции вектора, системы доставки и способа введения14.
Потенциальные проблемы безопасности ДНК- и РНК-вакцинации связывают с: 1) возможной интеграцией плазмид-ной ДНК в хромосомы клеток человека, тем самым увеличивая риск канцерогенеза или других генетических аномалий; 2) развитием иммунопатологических реакций и рисков, связанных с образованием аутоантител против плазмидной ДНК, потенциально вызывая или ускоряя развитие системных аутоиммунных заболеваний (таких как системная красная волчанка), либо индуцированием местного воспалительного ответа против трансформированных клеток, экспрессирующих кодируемый вакциной антиген, способствуя развитию органоспеци-фического аутоиммунного заболевания, либо экспрессией цитокинов или костимуляторных факторов, используемых как адъюванты; 3) развитием толерантности к секретируемому антигену; 4) продолжительностью экспрессии антигена; 5) рисками, связанными с экспрессией других последовательностей гена в клетках млекопитающих или бактерий15 [33].
Исследования по изучению распределения и длительности присутствия сконструированных плазмид или РНК в организме животных необходимо проводить в различных тканях и нескольких временных точках в диапазоне от нескольких суток до нескольких месяцев после введения. Как правило, биораспределение оценивается в крови, сердце, мозге, печени, почках, легких, костном мозге, половых железах, лимфатических узлах, селезенке, кишечнике и месте введения. Выбор временных интервалов определения количественного содержания векторов должен быть обоснован с учетом того, что в эктопических местах персистенция плазмид редко бывает длительной, в то время как в месте введения они могут обнаруживаться до 2 месяцев, а иногда и до 6 месяцев16 [33]. Для РНК-вакцин длительность персистенции часто не превышает нескольких суток [34]. Также может потребоваться исследование продолжительности экспрессии, фармакокинетики антигенов и распределения, выведения системы доставки17.
В случае использования системы доставки, направленной на определенную ткань или орган за счет использования специфических лигандов и/или использования тканеспецифи-ческих промотеров, необходимо оценивать желаемый тропизм и целевую селективность.
Необходимо отметить, что ДНК-вакцины, сходные по структуре вектора и отличающиеся только трансгенами, имеют схожий профиль биораспределения. Следовательно, возможно использование данных ранее проведенных исследований. В случае изменения вектора, системы доставки, способа введения или любых других модификаций, влияющих на поглощение клеткой и/или биораспределение, необходимо проводить новые исследования18.
Методики, используемые для определения биораспределения и перситенции, должны быть валидированными, обладать необходимой чувствительностью и специфичностью. Согласно рекомендациям FDA чувствительность метода количественной
13 Там же.
14 Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты). Ч. 2. М.: Гриф и К; 2012.
WHO guidelines on nonclinical evaluation of vaccines. WHO; 2005.
Guidelines on the nonclinical evaluation of vaccine adjuvants and adjuvanted vaccines. WHO, 2013. Guideline on clinical evaluation of new vaccines (EMEA/CHMP/VWP/164653/2005). EMA; 2006.
15 Guidelines for assuring the quality and nonclinical safety evaluation of DNA vaccines. WHO; 2007.
16 Там же.
17 Там же.
18 Guidance for industry: considerations for plasmid DNA vaccines for infectious disease indications. FDA; 2007.
ПЦР должна быть не менее 100 копий плазмид на 1 мкг ДНК19. Для определения концентрации РНК могут использоваться наборы Quant¡Gene (ThermoFisher, США) или аналогичные.
Вероятность встраивания плазмид в хромосому очень низкая, и на сегодняшний день имеется мало доказательств интеграции [33, 35]. Однако включение в конструкцию вектора гомологичных последовательностей, длительная персистенция плазмиды и ее высокая концентрация, использование электростимуляции для доставки или одновременное введение с плаз-мидой, кодирующей фактор роста, могут привести к увеличению риска интеграции плазмидной ДНК в хромосому. В случае выявленных рисков необходимо проведение исследований, подтверждающих отсутствие интеграции плазмиды в хромосому20.
Токсикологические исследования должны проводиться с учетом предполагаемой дозы, схемы введения, состава и способа введения препарата. Количество доз должно соответствовать или превышать предполагаемое их количество в клинических исследованиях. Исследования необходимо проводить на иммуночувствительных видах животных. Включение приматов, трансгенных мышей или других видов животных может потребоваться при ожидаемой видоспецифич-ной токсичности и при наличии в векторе ДНК-вакцины генов цитокинов21.
Исследования генотоксичности могут потребоваться при наличии специфических примесей или нового химического компонента (например, нового компонента системы доставки), которые не были изучены ранее22. При обнаружении ДНК- или РНК-вакцин в тканях гонад может потребоваться изучение фертильности и общей репродуктивной функции. Кроме того, могут потребоваться исследования эмбриофетальной и перинатальной токсичности в случае включения в целевую популяцию клинического применения женщин с детородным потенциалом23.
Оценку иммуногенности ДНК- и РНК-вакцин необходимо проводить на релевантных видах животных. Выбор конкретного вида животного, помимо его чувствительности к патогену, может также зависеть от типа вектора, наличия адъюванта, типа предполагаемого иммунного ответа (клеточный или гуморальный), способа введения или наличия в плазмиде генов, кодирующих белки человека (например, цитокины или факторы роста). В отдельных случаях возможно проведение дополнительных исследований с использованием «гомологичного препарата», то есть с использованием ДНК-вакцины, в плазмиде которой гены, кодирующие белки человека, заменены на аналогичные гены, кодирующие белки выбранного вида животного. Оценка иммуногенности в зависимости от индуцированного иммунного ответа может быть основана на определении средних геометрических титров антител, факторе сероконверсии, титров вируснейтрализующих антител и/или клеточного ответа. При использовании гетерологичной «прайм-буст» вакцинации оценку иммуногенности необходимо проводить с учетом предполагаемой схемы вакцинации.
Заключение
Использование рекомбинантных ДНК и РНК все еще представляет собой относительно новый способ создания вакцин. И, несмотря на неудачи проведенных клинических исследований ДНК-вакцин, а также то, что многие РНК-вакцины все еще
находятся на стадии разработки, данные технологии имеют высокий потенциал. В первую очередь, это связанно с простотой и универсальностью создания плазмид/РНК и технологического процесса, как правило, основанного на культивировании E. coli. В последние годы возрождение интереса к ДНК- и РНК-вакцинам связано с успехами применения плазмид и РНК в генной терапии, а также созданием более эффективных генетических конструкций, улучшением технологий доставки и появлением новых перспективных технологий (iDNA, PPLAV, самоамплифицирующиеся РНК). Таким образом, подходы, основанные на применении ДНК- и РНК-вакцин, в случае решения проблемы их низкой иммуногенности у людей являются реальной альтернативой для будущего развития медицины в профилактике инфекционных заболеваний.
Благодарности. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00154-19-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР AAAA-A18-118021590046-9).
Acknowledgments. The study reported in this publication was carried out as part of a publicly funded research project No. 056-00154-19-00 and was supported by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products (R&D public accounting No. AAAA-A18-118021590046-9).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.
Conflict of interest. Authors declare no conflict of interest requiring disclosure in this article.
Литература/References
1. Tang DC, DeVit M, Johnston SA. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 1992;356(6365):152-4. https://doi.org/10.1038/356152a0
2. Ulmer JB, Donnelly JJ, Parker SE, Rhodes GH, Felgner PL, Dwarki VJ, et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science. 1993;259(5102): 1745-9. https://doi.org/10.1126/sci-ence.8456302
3. Donnelly JJ, Ulmer JB, Shiver JW, Liu MA. DNA vaccines. Annu Rev Immunol. 1997;15:617-48. https://doi.org/10.1146/ annurev.immunol.15.1.617
4. Gurunathan S, Klinman DM, Seder RA. DNA vaccines: immunology, application, and optimization. Annu Rev Immunol. 2000;18:927-74. https://doi.org/10.1146/annurev. immunol.18.1.927
5. Hobernik D, Bros M. DNA vaccines — how far from clinical use? Int JMolSci. 2018;19(11):3605. https://doi.org/10.3390/ ijms19113605
6. Liu MA, Ulmer JB. Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet. 2005;55:25-40. https://doi. org/10.1016/S0065-2660(05)55002-8
7. Weniger BG, Anglin IE, Tong T, Pensiero M, Pullen JK, Nucleic Acid Delivery Devices for HIV Vaccines Workshop Group. Workshop report: nucleic acid delivery devices for HIV vaccines: workshop proceedings, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, Maryland, USA, May 21, 2015. Vaccine. 2018;36(4):427-37. https://doi. org/10.1016/j.vaccine.2017.10.071
8. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA vaccines — a new era in vaccinology. Nat Rev Drug Discov. 2018;17(4):261-79. https://doi.org/10.1038/nrd.2017.243
19 Там же.
20 Guidelines for assuring the quality and nonclinical safety evaluation of DNA vaccines. WHO; 2007.
21 Там же.
Guidance for industry: considerations for plasmid DNA vaccines for infectious disease indications. FDA; 2007.
22 Guidelines for assuring the quality and nonclinical safety evaluation of DNA vaccines. WHO; 2007.
23 Guidance for industry: considerations for plasmid DNA vaccines for infectious disease indications. FDA; 2007.
9. Kumaragurubaran K, Kaliaperumal K. DNA vaccine: the miniature miracle. Vet. World. 2013;6(4):228-32. https://doi. org/10.5455/vetworld.2013.228-232
10. Cranenburgh R. Development of the ideal DNA vaccine requires the optimization of delivery strategies and plasmid vectors. BioPharm International. 2011;2011 Suppl.(7). http:// www.biopharminternational.com/dna-vaccine-delivery
11. Garmory HS, Brown KA, Titball RW. DNA vaccines: improving expression of antigens. Genet Vaccines Ther. 2003;1:2. https://doi.org/10.1186/1479-0556-1-2
12. Li L, Petrovsky N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Rev Vaccines. 2016;15(3):313-29. https://doi.org/10.1586/14760584.2016.1124762
13. Liu Z, Chen O, Wall JBJ, Zheng M, Zhou Y, Wang L, et al. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci Rep. 2017;7(1):2193. https://doi.org/10.1038/s41598-017-02460-2
14. Li L, Petrovsky N. Molecular adjuvants for DNA vaccines. Curr Issues Mol Biol. 2017;22:17-40. https://doi.org/10.21775/ cimb.022.017
15. Darquet AM, Cameron B, Wils P, Scherman D, Crouzet J. A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: super-coiled minicircle. Gene Ther. 1997;4:1341-9. https://doi. org/10.1038/sj.gt.3300540
16. Hardee CL, Arevalo-Soliz LM, Hornstein BD, Zechied-rich L. Advances in non-viral DNA vectors for gene therapy. Genes (Basel). 2017;8(2):65. https://doi.org/10.3390/ genes8020065
17. Stenler S, Blomberg P, Smith CE. Safety and efficacy of DNA vaccines: plasmids vs. minicircles. Hum Vaccin Immunother. 2014; 10(5): 1306-8. https://doi.org/10.4161/ hv.28077
18. Riede O, Seifert K, Oswald D, Endmann A, Hock C, Winkler A, et al. Preclinical safety and tolerability of a repeatedly administered human leishmaniasis DNA vaccine. Gene Therapy. 2015;22(8):628-35. https://doi.org/10.1038/gt.2015.35
19. Pushko P, Ишмухаметов АА, Bredenbeek PP, Lukashevich IS. Экспериментальные живые аттенуиро-ванные вакцины против желтой лихорадки на основе инфекционных ДНК. Эпидемиология и вакцинопрофилак-тика. 2019; 18(1): 18-25. [Pushko P, Ishmukhametov АА, Bredenbeek PP, Lukashevich IS. Experimental DNA-launched live-attenuated vaccines against yellow fever. Epidemiologie i vakcinoprofilaktika = Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2019;18(1):18-25 (In Russ.)] https:// doi.org/10.31631/2073-3046-2019-18-1-18-25
20. Pushko P, Lukashevich IS, Weaver SC, Tretyakova I. DNA-launched live-attenuated vaccines for biodefense applications. Expert Rev Vaccines. 2016; 15(9): 1223-34. https://doi.org/10.1080/14760584.2016.1175943
21. Dallmeier K, Neyts J. Bacterial artificial chromosomes. Patent WIPO N WO2014174078; 2014.
22. Ulmer JB, Mason PW, Geall A, Mandl CW. RNA-based vaccines. Vaccine. 2012;30(30):4414-8. https://doi.org/10.1016/j. vaccine.2012.04.060
23. Lundstrom K. RNA-based drugs and vaccines. Expert Rev Vaccines. 2015;14(2):253-63. https://doi.org/10.1586/1476 0584.2015.959932
24. Sahin U, Kariko K, Türeci Ö. mRNA-based therapeutics — developing a new class of drugs. Nat Rev Drug Discov. 2014;13(10):759-80. https://doi.org/10.1038/nrd4278
25. Geall AJ, Mandl CW, Ulmer JB. RNA: the new revolution in nucleic acid vaccines. Semin Immunol. 2013;25(2): 152-9. https://doi.org/10.1016Zj.smim.2013.05.001
26. Weissman D. mRNA transcript therapy. Expert Rev Vaccines. 2015;14(2):265-81. https://doi.org/10.1586/1476058 4.2015.973859
27. Youn H, Chung JK. Modified mRNA as an alternative to plasmid DNA (pDNA) for transcript replacement and vaccination therapy. Expert Opin Biol Ther. 2015;15(9):1337-48. https:// doi.org/10.1517/14712598.2015.1057563
28. Lundstrom K. Latest development on RNA-based drugs and vaccines. Future Sci OA. 2018;4(5):FS0300. https://doi. org/10.4155/fsoa-2017-0151
29. Eberhardt W, Doller A, Akool el-S, Pfeilschifter J. Modulation of mRNA stability as a novel therapeutic approach. Pharmacol Ther. 2007;114(1):56-73. https://doi.org/10.1016/j.phar-mthera.2007.01.002
30. Atkins GJ, Fleeton MN, Sheahan BJ. Therapeutic and prophylactic applications of alphavirus vectors. Expert Rev Mol Med. 2008;10:e33. https://doi.org/10.1017/S1462399408000859
31. Brito LA, Kommareddy S, Maione D, Uematsu Y, Giovani C, Berlanda Scorza F, et al. Self-amplifying mRNA vaccines. Adv Genet. 2015;89:179-233. https://doi.org/10.1016/ bs.adgen.2014.10.005
32. Klinman DM, Klaschik S, Tross D, Shirota H, Steinhagen F. FDA guidance on prophylactic DNA vaccines: analysis and recommendations. Vaccine. 2010;28(16):2801-5. https:// doi.org/10.1016/j.vaccine.2009.11.025
33. Klug B, Reinhardt J, Robertson J. Current status of regulations for DNA vaccines. In: Thalhamer J, Weiss R, Scheiblhofer S, eds. Gene Vaccines. New York: Springer; 2012. P. 285-95. https://doi.org/10.1007/978-3-7091-0439-2_14
34. Bahl K, Senn JJ, Yuzhakov O, Bulychev A, Brito LA, Hassett KJ, et al. Preclinical and clinical demonstration of immunogenicity by mRNA vaccines against H10N8 and H7N9 influenza viruses. Mol Ther. 2017;25(6):1316-27. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.03.035
35. Ledwith BJ, Manam S, Troilo PJ, Barnum AB, Pauley CJ, Griffiths TG 2nd. Plasmid DNA vaccines: assay for integration into host genomic DNA. Dev Biol. 2000;104:33-43.
Об авторах / Authors
Горяев Артем Анатольевич, канд. биол. наук. Artem A. Goryaev, Cand. Sci. (Biol.). ORCID: http://orcid.org/0000-0003-1620-6233
Савкина Мария Владимировна, канд. биол. наук. Maria V. Savkina, Cand. Sci. (Biol.). ORCID: http://orcid.org/0000-0002-8527-2157
Обухов Юрий Иванович. Yuri I. Obukhov. ORCID: http://orcid.org/0000-0002-7729-9800
Меркулов Вадим Анатольевич, д-р мед. наук, проф. Vadim A. Merkulov, Dr. Sci. (Med.), Professor. ORCID: http://orcid. org/0000-0003-4891-973X
Олефир Юрий Витальевич, д-р мед. наук, ст. науч. сотр. Yuri V. Olefir, Dr. Sci. (Med.), Senior Research Associate. ORCID: http://orcid.org/0000-0001-7652-4642
Поступила 01.04.2019 Received 1 April 2019
После доработки 16.05.2019 Revised 16 May 2019
Принята к публикации 16.05.2019 Accepted 16 May 2019
