CC BY
22
УДК 616.43/.45-008.9-056.7-053.2:576.316.24
ДЛИНА ТЕЛОМЕР ХРОМОСОМ У ДЕТЕЙ С МУКОВИСЦИДОЗОМ В РАЗЛИЧНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУППАХ
А.Б. Смолянинов 12, Ф.П. Романюк 1, Н.Д. Саймуродова 1, И.А. Пирожков 12 1 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова,
Санкт-Петербург, Россия 2 Покровский банк стволовых клеток, Санкт-Петербург, Россия
CHROMOSOME TELOMERE LENGTH IN CHILDREN WITH CYSTIC FIBROSIS
IN DIFFERENT AGE GROUPS
A.B. Smolyaninov 12, F.P. Romanyuk 1, N.D. Saimurodova 1, I.A. Pirozhkov 1 2 1 North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia 2 Stem cell bank «Pokrovsky», Saint-Petersburg, Russia
© Коллектив авторов, 2014
Теломеры укорачиваются при повторяющемся делении клеток. Их длина является показателем старения клеток. Хроническая активация иммунной системы и длительная тяжелая бактериальная инфекция при муковисцидозе у детей затрагивает все клеточные структуры. Поэтому в работе исследовали длину теломер хромосом у детей с муковисцидозом в трех возрастных группах. Длина теломер хромосом оценивалась методом проточной цитофлуориметрии. В результате проведенных исследований было обнаружено, что у детей с муковисцидозом в возрастной группе от 3 до 12 лет отмечалась меньшая длина теломер хромосом (0,8 тыс. п.н., p<0,05), по сравнению с детьми в возрастной группе от 13 до 17 лет.
Ключевые слова: муковисцидоз, дети, длина теломер хромосом.
Telomeres shorten during cell division. Their length is the marker of cell senescence. Chronic activation of the immune system and prolonged severe bacterial infection in cystic fibrosis in children affects all cellular structures. Therefore telomeres length in children with cystic fibrosis was investigated in three age groups. Chromosome telomere length was estimated by flow cytometry method. The research had showed that shorter telomeres length was in children with cystic fibrosis in age group from 3 to 12 years (0.8 thousand b.p., p<0,05) versus age group from 13 to 17 years.
Key words: cystic fibrosis, children, chromosome telomere length.
Введение
Муковисцидоз (МВ) - наиболее частое аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное мутациями в гене CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), характеризующееся клиническим полиморфизмом [1, 2]. Заболевание по-прежнему сохраняет свою высокую медико-социальную значимость, что связано с низкой продолжительностью жизни больных, ранней инвалидизацией, проблемами своевременной диагностики заболевания, необходимостью постоянного диспансерного наблюдения и с трудностями в его лечении [1, 2].
Теломеры - это специализированные структуры на концах хромосом эукариот. Теломеры выполняют защитную функцию, наподобие «шапочки» на концах хромосом, предотвращая распознавание механизмами репарации ДНК концов хромосом как разрывов двухцепочечной структуры. Эта «шапочка» защищает хромосомы от разрушения и блокирует рекомбинацию
и слияние концов хромосом. Теломеры состоят из гексамерных нуклеотидных последовательностей (у человека - TTAGGG), повторяющихся от сотен до тысяч раз на каждом концевом участке хромосомы и комплекса белков. Хромосома имеет два теломера. Длина ДНК в теломерах хромосом человека варьирует и в клетках зародышевой линии составляет 1000015000 п.н. После каждого цикла репликации ДНК последовательность теломер укорачивается на 50-150 п.н. [3, 4]. Теломеры укорачиваются при повторяющемся делении клеток. Их длина является показателем старения клеток. Длина теломер как маркер возрастных изменений и рисков развития болезней на клеточном уровне организма человека постоянно обновляется. Однако со временем клетки утрачивают способность к самовоспроизведению. Это явление получило название «лимит Хейфли-ка». Для большинства человеческих клеток предел Хейфлика составляет около 50 делений.
В настоящее время феномен «лимит Хейфлика» связывают с укорочением теломер при каждом клеточном делении [5]. Оказалось, что при каждом делении концевые участки хромосом воспроизводятся не до конца, и новые клетки содержат хромосомы с теломерами меньшей длины. Укорочение длины теломер с возрастом влияет на функциональную активность клетки, повышает риск развития различных патологий и в конечном итоге, при достижении критической величины, может привести либо к гибели клетки (через процессы самоликвидации - апоп-тоз), либо к переходу в так называемое «состояние ареста» с прекращением способности к росту и размножению клетки. В зависимости от ткани средняя длина теломерных участков составляет 10-20 п.н. [5] (рис. 2). Однако важно не столько среднее значение длины всех теломер, сколько количество хромосом с критически короткими теломерами [4, 6]. Соответственно, укорочение теломер хромосом и наличие патологии иммунной системы приводят к ускоренному старению клеток, а также к предрасположенности к инфекциям или заболеваниям иммунопатологической природы и в конечном счете влияют на продолжительность жизни [7, 8, 11].
Доказано, что при иммунопатологических заболеваниях, таких как ревматоидный артрит [4, 10], системная красная волчанка [12], атопи-ческий дерматит и псориаз, происходит быстрое укорочение теломер в клетках периферической крови. [5, 13]. Такое укорочение теломер связывают с повышенной пролиферативной активностью и клеточным обновлением иммуноком-петентных клеток в результате хронического воспаления. Это в свою очередь способствует раннему старению всей иммунной системы и нарушением иммунорегуляторных реакций организма [4, 5, 14].
Муковисцидоз - полиорганное заболевание, при котором поражаются не только органы дыхания, но и желудочно-кишечный тракт, эндокринная система с развитием органических необратимых изменений в паренхиме органов. Полиорганное поражение и тяжелая бактериальная легочная инфекция при муковисцидозе формируют патологический тип иммунного ответа организма, наблюдаются деградации иммунных и других клеток [3], а также нарушения их жизненного цикла.
Целью работы было исследование длины теломер хромосом у детей с муковисцидозом в различных возрастных группах для оценки про-
гноза течения заболевания и продолжительности жизни детей.
Материалы и методы исследования
Обследовано 30 детей: 15 мальчиков и 15 девочек в возрасте от 3 до 17 лет, страдающих му-ковисцидозом (мутация delta F508) и находившихся на лечении в детской городской больнице Святой Ольги (г. Санкт-Петербург) в течение 2011-2012 гг. У обследуемых детей была диагностирована смешанная (легочно-кишечная) форма - 27 человек (90%), преимущественно кишечная форма заболевания - у 2 детей (7%), легочная форма - у 1 ребенка (3%). Заболевание чаще всего начиналось в период новорож-денности у 53% наблюдаемых детей, на первом году жизни - у 35% больных, после года - у 12% исследованных. Для оценки степени тяжести течения заболевания была использована шкала Швахмана - Кульчинского, согласно которой 21 (70%) больной ребёнок имел среднетяжелое течение (средний показатель был - 55 баллов) и 9 (30%) больных тяжелое течение (средний показатель - 40 баллов). Дети были распределены на три возрастные группы: первую группу составили дети (n = 10) в возрасте от 3 до 7 лет, 2-я группа (n = 10) - от 8 до 12 лет, 3-я группа (n = 10) - от 13 до 17 лет. При обследовании детей родители подписывали информированное согласие.
Измерение длины теломер хромосом
методом проточной цитофлуориметрии
(Flow-FISH)
Анализ проводили с использованием набора DAKO Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometry (DAKO, Дания) согласно инструкции. В качестве внешнего контроля использовали специальную клеточную линию Т-лимфобластной лейкемии 1301 (HPA Culture Collections, Великобритания), которая характеризуется стабильной длиной теломер (Hultdin, 1998). Данную культуру поддерживали в среде RPMI с добавлением 10% бычьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина и пенициллин/стрептомицина 100 мкг/мл (HyClone, США).
Клетки исследуемого образца и контрольной линии 1301 выравнивали по количеству после отмывки в PBS с добавлением 0,1% BSA. Одну часть образца и 1301 ресуспензировали в 300 мкл гибридизационного раствора с пепти-до-нуклеиновым зондом, меченным флуорох-ромом FITC и комплементарным теломерной последовательности ДНК, другую - без зонда.
Далее проводили денатурацию ДНК при +82°С в течение 10 мин и гибридизацию в течение 12 часов при комнатной температуре в темноте. Затем дважды осуществляли отмывку клеток с инкубацией в отмывочном буфере DAKO при +40°С в течение 10 мин. На следующем этапе клетки ресуспендировали в растворе DAKO для окраски ДНК (буфер, содержащий пропидиум йодид и РНК-азу А) и выдерживали в течение 30 мин при +37°С в темноте.
Образцы периферической крови хранились при комнатной температуре и анализировались в течение 24-48 часов.
Оборудование: проточный цитометр FC500 (Beckman Coulter, США) с программным обеспечением CXР; анализатор жизнеспособности клеток Vi-CELLTM (Beckman Coulter, США); электронные дозаторы на 20 мкл, 100 мкл, 1 000 мкл, 5000 мкл и штатив для дозаторов (Biohit, Финляндия); контейнеры для жидких биологических отходов и твердых отходов; таймер; мешалка типа Вортекс; твердотельный термостат Bio RDB-120 (Biosan); микроцентрифуга 500 x g.
Реактивы: Набор Telomtr PNA Kit\FITC for Flow Cytometry (Dako, Дания) на 20 тестов, состоял из следующих реагентов: Vial 1 - буфер для гибридизации без зонда (Hybridization Solution-Vial1) - флакон на 12 мл, готовый к использованию, содержит 70% формамид; Vial 2 - буфер для гибридизации с зондом Telomtr PNA Kit\ FITC (Telomtr PNA Kit\FITC in hybridization solution-Vial 2) флакон на 12 мл, готовый к использованию, содержит 70% формамид; Vial 3 -отмывочный буфер (Wash Solution) флакон на 20 мл, перед использованием требуется 10-кратное разведение в дистиллированной воде. Vial 4 - ресуспензионный буфер для окрашивания ДНК (DNA-staining Solution), флакон на 4 мл, для использования требуется 10-кратное разведение в дистиллированной воде. Содержит про-пидиум йодид и РНКазу А. Реактивы хранятся при температуре +2...+8°С.
День 1. Подготовка. Предварительно нагревается термостат до +82°С. 1,5 мл клеточной суспензии контрольной линии 1301 промывается, анализируемые и контрольные клетки разводятся в PBS - с 0,1% BSA и подсчиты-ваются клетки с помощью анализаторов жизнеспособности клеток Vi-CELLTM (Beckman Coulter, США) с использованием протоколов для подсчета лимфоцитов и клеток линии 1301. Помещаются по 2x106 анализируемых клеток в 2 разных эппендорфа, маркированных: номер
пробы-контроль и номер пробы-зонд. Помещаются по 2х106 контрольных клеток в 2 разных эппендорфа, маркированных: 1301-контроль и 1301-зонд и добавляются во все пробирки PBSO, 1% BSA до 0,5 мл. Клеточная суспензия центрифугируется на скорости 500 g в течение 5 минут и сливается супернатант. Денатурация: добавляется в пробирки маркированные под контроль по 300 мкл Vial 1 (буфер для гибридизации без зонда). Инкубируются пробирки при +82°С в термостате в течение 10 мин. Гибридизация: после этого перемешиваются образцы на вортексе и инкубируются 2 часа или ставятся на 12 часов при комнатной температуре в темном месте для гибридизации.
День 2. Отмывка. Предварительно нагревается термостат до +40°С, добавляется в пробирки с клетками по 1мл отмывочного буфера (Vial 3 разведенного в 10 раз) и инкубируется в течение 10 мин, затем клеточная суспензия центрифугируется на скорости 500 g в течение 5 мин.
Окраска ДНК: Добавляется в пробирки с клетками по 500 мкл ресуспензионного буфера для окрашивания ДНК (Vial 4 разведенного в 10 раз). Клетки переносятся в стандартные 12х75 полистироловые пробирки для проточного цитометра и инкубируются при температуре +37°С в темноте в течение 30 мин.
Анализ образцов
Пробы анализировали на проточном цитоф-луориметре FC500 (Beckman Coulter, США) с длиной лазерной волны 488 нм. Для выделения клеток на стадии клеточного цикла G0/G1 использовали логарифмическую шкалу FL3. Относительную длину теломер (ОДТ) образца в процентах от длины теломер контрольной линии 1301 с учетом их тетраплоидности высчитывали следующим образом:
ОДT = (П - А)образец x (2 x 100)/(П - А)
1301'
где (П - А) - разница между средней интенсивностью флуоресценции по FL1 пробы с зондом и без зонда (автофлуоресценция) [15, 16].
Статистическая обработка данных
Статистическая обработка результатов проводилась в программе STATISTICA 6.0, StatSoft, Inc. Использовались методы непараметрической статистики критериев Манна - Уитни (U-статистика), медианного хи-квадрат, критерия и модуля ANOVA. Для расчета статистической взаимосвязи изменений рядов переменных был использован коэффициент ранговой
корреляции Спирмена, так как данный метод не требует нормальности распределения и может применяться как к количественным, так и к порядковым признакам. Статистически значимыми результаты считались при р<0,05 [17].
Результаты и их обсуждение
Результаты определения длины теломер хромосом у детей с муковисцидозом, представленные в таблице 1, показывают, что укорочение теломер хромосом среди детей муковисцидозом уменьшается с возрастом. У больных детей с му-ковисцидозом достоверные различия длины те-ломер хромосом отмечаются в возрастных группах 3-7 лет и 8-12 лет.
Длина теломер хромосом представлена в тысячах пар нуклеотидов, в формате среднее ± стандартная ошибка.
Зависимость величины длины теломер хромосом клеток R1301 от возраста у детей, больных муковисцидозом, не линейна (имеет параболический характер) и описывается регрессионным выражением:
R1301, т. п. н. = 364.6 - 0,048х(возраст, годы)2 R2 = 0,37; F = 13,20; р<0,002.
Снижение длины теломер хромосом клеток R1301 у детей, больных муковисцидозом, составляет в среднем 0,95 т.п.н. за 1 год жизни (на
интервале от 3 до 17 лет). Прогрессирующее с возрастом снижение длины теломер клеток R1301 представлено на рис. 1.
Оценка длины теломер хромосом становится всё более используемым методом в последние годы. Поскольку хроническая гиперреактивность иммунной системы и длительная тяжелая бактериальная инфекция при муковисцидозе у детей затрагивает все клеточные структуры, была исследована длина теломер хромосом для выбора групп детей, которым необходима регенеративная терапия при этом заболевании. Длина теломер хромосом является показателем уровня повреждения иммунной системы и косвенно свидетельствует о степени истощения компенсаторных гомеостатических процессов. В нашем исследовании установлено, что с возрастом у детей с муковисцидозом укорочение теломер хромосом происходит более интенсивно, по сравнению со средними значениями длины теломер. Так, показано, что в возрасте около 5 лет происходит стабилизация длины теломер на уровне 10000-12000 п.н., далее эта величина остаётся неизменной до 25-летнего возраста (см. рис. 3). Во всех исследуемых возрастных группах детей, больных муковисцидозом, отмечалось резко уменьшение длины теломер до значения около 8000 п.н. Данные исследования продемонстрированы на рисунке 1.
Таблица 1
Показатели длины теломер хромосом у детей больных муковисцидозом в зависимости
от возраста
Показатель Возраст, годы Н Р F Р
3-7 8-12 13-17
Концентрация, т.п.н. 4,45±0,64 1,79±0,38 2,57±0,27 9,72 0,007 9,67 0,001
FL1, т.п.н. 10,88±2,27 13,46±0,42 15,20±0,51 4,79 0,091 3,41 0,05
R1301, т.п.н. 357,28±2,72 360,07±0,57 346,21±2,03 10,61 0,005 17,05 0,001
Длина теломер, т.п.н. 8,18±0,66 8,01±0,21 8,39±0,11 2,95 0,22 0,21 0,81
Таблица 2
Зависимость показателей длины теломер хромосом от возраста у больных муковисцидозом
Показатель Возраст, годы Г Р Р
3-7 8-12 13-17
Концентрация, т.п.н. 4,45±0,64 1,79±0,38 2,57±0,27 -0,43 0,058 -0,20 0,39
FL1, т.п.н. 10,88±2,27 13,46±0,42 15,20±0,51 0,40 0,061 0,30 0,17
R1301, т.п.н. 357,28±2,72 360,07±0,57 346,21±2,03 -0,55 0,008 -0,60 0,003
Длина теломер, т.п.н. 8,18±0,66 8,01±0,21 8,39±0,11 -0,06 0,73 -0,14 0,46
Рис. 1. Зависимость величины длины теломер хромосом клеток R1301 от возраста детей больных муковисцидозом
Рис. 2. Изменение длины теломер хромосом с возрастом у здоровых детей [18]
Рис. 3. Длина теломер хромосом у детей с муковисцидозом в различных возрастных группах
Оказалось, что в возрасте 3-12 лет у детей со смешанной формой муковисцидоза достоверно отмечается укорочение теломер хромосом (p<0,05) по сравнению с нормой у детей этих же возрастных групп. Следует предположить наличие прямой связи между тяжестью поражения иммунной системы и клинической формой заболевания, а также тяжестью течения муковисцидоза. Результаты проведённого исследования могут служить важным прогностическим показателем продолжительности жизни для данных пациентов.
Таким образом, дальнейшее изучение длины теломер хромосом при муковисцидозе у детей позволит разработать современные подходы к совершенствованию лечения таких больных, в частности для применения регенеративной терапии с использованием мононуклеарной фракции пуповинной крови [8, 9]. По состоянию длины теломер хромосом врач может оценить прогноз течения и исход заболевания, а также проанализировать эффективность проводимого лечения.
Выводы
1. В результате исследования обнаружено статистически значимое уменьшение длины те-ломер у детей с муковисцидозом в возрастных группах 3-7 лет, 8-12 лет, 13-17, лет по сравнению со средними значениями в данных возрастных группах.
2. С возрастом длина теломер хромосом у детей больных муковисцидозом резко уменьшается.
3. Измерение длины теломер у детей с му-ковисцидозом может служить важным прогностическим показателем течения заболевания и продолжительности жизни таких детей.
4. Исследования длины теломер у пациентов с муковисцидозом создадут предпосылки для появления новых методов диагностики и лечения заболевания, в частности данный метод может найти применение при регенеративной терапии муковисцидоза.
Литература
1. Капранов, Н.И. Перспективы ранней диагностики и адекватного лечение больных муковисцидозом в РФ / Н.И. Капранов // Муковисцидоз у взрослых и детей : материалы IX Национального конгресса по муковисци-дозу. - М., 2009. - С. 7-13.
2. Сергиенко, Д.Ф. Особенности клинического течения и механизмы иммунной регуляции у детей с муковисцидозом (монография) // Д.Ф. Сергиенко, O.A. Башкина, Х.М. Галимзя-нов. - Астрахань: Изд-во АГМА, 2010. - С. 139.
3. Кондратьева, Е.И. Генетические и иммунологические маркеры воспалительного процесса при муковисцидозе у детей / Е.И. Кондратьева [и др.] // Лечащий врач. - 2008. - № 2. - С. 78-80.
4. Борисов, В.И. Особенности изменения средней длины теломер в лимфоцитах у больных бронхиальной астмой / В.И. Борисов [и др.] // Медицинская иммунология. - 2009. -Т. 11., № 6. - С. 523-530.
5. Борисов, В.И. Укорочение длины теломер хромосом моноцитов при ревматоидном артрите / В.И. Борисов, В.С. Кожевников, В.В. Сенюков // Мед. иммунология. - 2006. - Т. 8, № 1. - С. 87-90.
6. Hemann, M.T. The shortest telomere, not average telomere length, is critical for cell viability and chromosome stability / M.T. Hemann [et al.] // J. Allergy Clin. Immunol. - 2011. -Vol. 107, №1. - P. 67-77.
7. Hohensinner, P.J. Telomere dysfunction, autoimmune diseases and aging / P.J. Hohensinner [и др.] // Aging Dis. - 2011. - Vol. 2, №6. -Р. 524-537.
8. Selleri, S. In vivo T-cell dynamics during immune reconstitution after hematopoietic stem cell gene therapy in adenosine deaminase severe combined immune deficiency / S. Selleri [et al.] // J. Allergy Clin. Immunol. - 2011. - Vol. 127, № 6. - Р. 1368-1375.
9. Аверьянов, А.В. Перспективы регенеративной медицины при лечении болезней органов дыхания / А.В. Аверьянов // Consilium medicum : Журнал доказательной медицины для практикующих врачей. - 2011. - Т. 13. - С. 12-17.
10. Wang, G. Adult stem cells from bone marrow stroma differentiate into airway epithelial cells: potential therapy for cystic fibrosis / G. Wang [и др.] [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2005. -Vol. 102. - Р. 186-191.
11. Gomez, D.E. Telomere structure and telomerase in health and disease / D.E. Gomez [et al.] // International Journal of Oncology. -2012. - Vol. 41, №5. - Р. 1561-1569.
12. Thilagavathi, J. Telomere length in reproduction / J. Thilagavathi, S. Venkatesh, R. Dada // Andrologia. - 2013. - Vol. 45, № 5. -Р. 289-304.
13. Westin, E.R. Telomere restoration and extension of proliferative lifespan in dyskeratosis congenital fibroblasts / E.R. Westin, E. Chavez, A.J. Klingelhutz // Aging Cell. - 2007. - Vol. 6, № 3. - Р. 283-394.
14. Weng, N.P. Telomeres and immune competency / N.P. Weng // Current Opinion in Immunology. - 2012. - Vol. 4. - Р. 470-475.
15. Hultdin, M. Telomere analysis by fluorescence in situ hybridization and flow cytometry / M. Hultdin [et al.] // Nucleic Acids Res. - 1998. -Vol. 26, № 16. - P. 3651-3656.
16. Schmid, I. Simultaneous flow cytometric analysis of two cell surface markers, telomere length, and DNA content / I. Schmid [et al.] // Cytometry. - 2002. - Vol. 49, № 3. - P. 96-105.
17. Гланц, С. Медико-биологическая статистика // С. Гланц ; пер. с англ. под ред. Н.Е. Бу-зикашвили и Д.В. Самойлова. - М. : Практика. -1999. - C. 460.
18. Frenck, R.W. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age / R.W. Frenck, E.H. Blackburn, K.M. Shannon // Proc Natl Acad Sci USA. - 1998. - V. 95. -P. 5607-5610.
Тел.: 8-964-376-05-06 e-mail: [email protected]
