CC BY
39
УДК 577.1 12.6:615.214.31
Дипептидный миметик мозгового нейротрофического фактора обладает свойствами антидепрессанта при пероральном введении
П. Ю. Поварнина*, Т. Л. Гарибова, Т. А. Гудашева, С. Б. Середенин
Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова, 125315, Москва,
ул. Балтийская, 8
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 05.07.2017
Принята к печати 06.06.2018
РЕФЕРАТ Участие BDNF в регуляции нейропластичности и нейрогенеза в гиппокампе, нарушение которой лежит в основе патофизиологии депрессии, позволяет рассматривать этот эндогенный белок как перспективный объект для разработки нового поколения антидепрессантов с нейрофизиологически обоснованным механизмом действия. В НИИ фармакологии им. В.В. Закусова сконструирован и синтезирован низкомолекулярный миметик BDNF ГСБ-106, представляющий собой замещенный димерный дипептид, гексаметилендиамид бис^-моносукцинил-Ь-серил-Ь-лизина). Установлено, что ГСБ-106 активирует специфические для BDNF рецепторы TrkB и их основные пострецепторные сигнальные пути MAPK/ERK и PI3K/AKT. ГСБ-106 проявил выраженную антидепрессивную активность в батарее тестов на грызунах при внутрибрюшинном введении в дозах 0.1-1.0 мг/кг. Поскольку при депрессии предпочтительной является пероральная лекарственная форма, что обусловлено длительностью курса фармакотерапии и проведением ее во внебольничных условиях, нами изучены антидепрессивные свойства ГСБ-106, перорально вводимого в виде фармацевтической субстанции и таблетированной лекарственной формы (ЛФ). В тесте вынужденного плавания по Порсолту проведено сравнительное исследование ГСБ-106 и классического антидепрессанта амитриптилина у крыс. Установлено, что антидепрессивная активность ГСБ-106 сохраняется при пероральном введении и проявляется в дозах 0.5-5.0 мг/кг для фармацевтической субстанции и 0.01-5.0 мг/кг для таблетированной формы. Таблетированная форма была активна в 50 раз более низких дозах, чем фармацевтическая субстанция, и по выраженности эффектов превосходила амитрипти-лин - «золотой стандарт» антидепрессантов. Таким образом, можно заключить, что как в виде субстанции, так и в виде таблетированной лекарственной формы ГСБ-106 обладает антидепрессивными свойствами, что позволяет рассматривать его в качестве перспективного антидепрессивного лекарственного средства, первого в классе - миметиков BDNF.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ГСБ-106, депрессия, димерный дипептидный миметик BDNF, пероральная лекарственная форма.
ВВЕДЕНИЕ
Экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о центральной роли мозгового нейротрофического фактора (brain derived neurotrophic factor, BDNF) в патогенезе депрессии [1]. Проявление антидепрессивных свойств наблюдали в экспериментах при внутримозговом введении BDNF [2-4]. Содержание BDNF снижено в плазме крови больных депрессией, а после лечения антидепрессантами возвращается к нормальным значениям [5]. Кроме того, сниженный уровень BDNF зарегистрирован в гип-покампе людей, страдавших депрессией, а также
у жертв суицида [6, 7]. Научно обосновано предположение, что патогенетическая роль BDNF в депрессии связана с регуляцией нейропластичности и нейрогенеза в гиппокампе [8], нарушение которых считается ведущим этиопатогенетическим фактором заболевания [9].
Очевидно, что BDNF является важным объектом для разработки антидепрессантов с патофизиологически обоснованным механизмом действия.
Физиологические эффекты BDNF, включая регуляцию нейрогенеза и поддержание нейропластич-ности, опосредованы рецепторами ТгкВ и основны-
ми путями трансдукции их сигнала - MAPK/ERK и Р13К/АКТ [10, 11]. Нами созданы низкомолекулярные соединения, имитирующие бета-изгибы отдельных петлеобразных структур BDNF, и экспериментально доказана селективность вызываемой ими активации пострецепторных каскадов [12, 13]. При этом установлено, что миметики BDNF, селективно активирующие либо Р13К/АКТ, либо МАРК/ ERK, не обладают антидепрессивной активностью, что доказывает необходимость обоих пострецептор-ных сигнальных путей для проявления такой активности.
Рассматривая проблему с фармакологических позиций, следует отметить, что клиническое использование нативного BDNF ограничено его неудовлетворительными фармакокинетическими свойствами.
В связи с этим в качестве перспективного антидепрессанта в НИИ фармакологии им. В.В. Закусова отобран дипептид ГСБ-106, миметик бета-изгиба четвертой петли BDNF, представляющий собой гексаметилендиамид бис^-моносукцинил-Ь-серил-Ь-лизина) [14, 15]. Методом Вестерн-блот-анализа установлено, что ГСБ-106 активирует специфические для BDNF рецепторы ТгкВ и их пострецептор-ные сигнальные пути MAPK/ERK и Р13К/АКТ [12, 16]. ГСБ-106 проявлял выраженную антидепрессивную активность в батарее валидированных фармакологических тестов на грызунах при внутрибрю-шинном (в/б) введении в дозах 0.1 — 1 мг/кг [15, 17]. Предположительно, механизмы антидепрессивного действия ГСБ-106, как и полноразмерного белка, связаны с нейрогенезом и синаптогенезом. Влияние ГСБ-106 на нейрогенез доказано ранее на модели стресса у мышей, вызванного контактом с хищником [18].
Очевидно, что при депрессии предпочтительной является лекарственная форма для приема внутрь, что обусловлено длительностью курса фармакотерапии и ее проведением во внебольничных условиях. Поэтому в настоящем исследовании изучены антидепрессивные свойства ГСБ-106, вводимого перораль-но в виде как фармацевтической субстанции (ФС), так и созданной в Институте таблетированной лекарственной формы (ЛФ).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Лекарственные средства
ФС ГСБ-106 синтезирована в отделе химии лекарственных средств НИИ фармакологии им. В.В. Закусова как описано ранее [15]. ЛФ ГСБ-106 для перорального применения разработана и произведена в опытно-технологическом отделе НИИ фармакологии им. В.В. Закусова и содержала 1% ФС
ГСБ-106 и 99% наполнителя, состоящего из лактозы, микрокристаллической целлюлозы, сополимера по-лиэтиленгликоля-поливинилового спирта и стеарата магния.
Амитриптилин в инъекционной ЛФ произведен на Московском эндокринном заводе (Россия).
Животные
Эксперименты выполнены на 188 белых беспородных крысах-самцах массой 240-270 г, полученных в филиале «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства. Животных содержали в условиях вивария при естественной смене светового режима со свободным доступом к стандартному гранулированному корму и воде в соответствии с СП 2.2.1.321814 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29 августа 2014 г. № 51. Организация и проведение работ осуществлялись в соответствии с приказом Минздрава России № 199 от 01 апреля 2016 г. «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики». Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике НИИ фармакологии им. В.В. Закусова (протокол № 2 от 20 февраля 2017 г.).
Изучение антидепрессивной активности
Антидепрессивную активность ГСБ-106 у крыс определяли в тесте вынужденного плавания по Порсолту [19, 20]. Установка для оценки антидепрессивной активности представляла собой шесть сосудов цилиндрической формы диаметром 20 см и высотой 60 см, разделенных непрозрачными перегородками. Сосуды наполняли водой температурой 22°С на 40 см. Предварительно каждое животное помещали в сосуд с водой на 15 мин, после чего давали обсохнуть и возвращали в домашнюю клетку. Через 24 ч животных помещали в сосуд с водой на 5 мин, в течение которых оценивали время сохранения характерной позы иммобильности (отказ от активно-оборонительного и исследовательского поведения). Поведение животных регистрировали с помощью видеокамеры. Видеозапись эксперимента обрабатывали в полуавтоматическом режиме с помощью программы RealTimer («НПК Открытая Наука»).
Дизайн эксперимента
ФС ГСБ-106 растворяли в дистиллированной воде и вводили крысам ежедневно в течение 14 сут в дозах 0.1; 0.5; 1; 5 и 10 мг/кг перорально в объеме 1 мл/кг. Контрольные животные получали в том же
ТОМ 10 № 3 (38) 2018 | АСТА ЫАТиИАЕ | 89
режиме дистиллированную воду. ЛФ ГСБ-106 суспендировали в 1% растворе крахмала и вводили крысам ежедневно в дозах 0.001; 0.01; 0.05 и 0.1 и 5.0 мг/кг перорально в объеме 1 мл/кг в течение 14 дней. Контрольные животные получали в том же режиме плацебо, представляющее собой суспензию наполнителя ЛФ в 1% растворе крахмала. В качестве препарата сравнения использовали классический трициклический антидепрессант амитриптилин, который разводили в дистиллированной воде и вводили крысам перорально в дозе 5.0 мг/кг [21] в объеме 1.0 мл/кг в течение 14 дней. Контрольным животным вводили дистиллированную воду в том же режиме. Через 24 ч после последнего введения препаратов проводили предварительную посадку крыс в цилиндры с водой для формирования депрессивноподоб-ного состояния, еще через 24 ч осуществляли тестирование.
Статистический анализ
Межгрупповые различия оценивали с помощью {-критерия Стьюдента и и-теста Манна-Уитни (при сравнении более двух групп использовали поправку Бонферрони). Различия считали статистически значимыми при р < 0.05. Данные представляли в форме средних и стандартных ошибок среднего.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Антидепрессивная активность ФС ГСБ-106 при пероральном введении
Установлено, что крысы контрольной группы, получавшие дистиллированную воду, при тестировании в условиях вынужденного плавания по Порсолту после периода активности принимали характерную позу иммобильности (отказ от активно-оборонительного поведения) и сохраняли ее, с небольшими перерывами, до конца опыта. Время иммобильности у животных контрольной группы составило в разных экспериментах в среднем от 178 до 216 с. ГСБ-106 в виде ФС в дозах 0.5, 1.0 и 5.0 мг/кг статистически значимо (р < 0.05) снижал время иммобильно-сти в 1.5, 1.2 и 1.6 раза соответственно по сравнению с контролем (таблица), что указывает на наличие антидепрессивной активности. В дозах 0.1 и 10 мг/кг ГСБ-106 не оказывал антидепрессивного действия, что свидетельствует о дозозависимости эффекта. При этом выраженность эффекта ФС ГСБ-106 в дозе 0.5 мг/кг была сравнима с выраженностью эффекта амитриптилина в дозе 5.0 мг/кг (перорально) (таблица).
Таким образом, установлено, что ГСБ-106 в виде ФС обладает антидепрессивной активностью при пе-роральном введении в дозе 0.5-5 мг/кг.
Антидепрессивная активность ЛФ ГСБ-106 при пероральном введении
Время иммобильности у крыс контрольной группы, получавших плацебо, составило в двух экспериментах 245.7 и 201 с. ЛФ ГСБ-106 при пероральном введении в дозе 0.01, 0.05, 0.1 и 5.0 мг/кг статистически значимо (p < 0.01) снижала время иммобильности у крыс в тесте вынужденного плавания по Порсолту в 1.6, 1.8, 1.5 и 2.2 раза соответственно по сравнению с контролем (таблица). Эффект ЛФ ГСБ-106 был до-зозависимым и не проявлялся в дозе 0.001 мг/кг.
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящем исследовании установлено, что антидепрессивная активность дипептидного миметика BDNF ГСБ-106, выявленная ранее при в/б введении в интервале доз 0.1-1.0 мг/кг, сохранялась при пероральном введении и проявлялась в дозах 0.55.0 мг/кг для ФС и 0.01-5.0 мг/кг для ЛФ ГСБ-106. ЛФ ГСБ-106 была активна в 50 раз более низких дозах, чем ФС ГСБ-106, и по выраженности эффектов превосходила амитриптилин - «золотой стандарт» антидепрессантов.
Важно, что активность ГСБ-106 при пероральном введении сравнима с таковой при внутрибрюшинном введении. Такая устойчивость ГСБ-106 в биологических средах обусловлена отсутствием связей-мишеней протеаз, аминопептидаз и карбоксипептидаз благодаря дипептидной природе, наличию защиты на N- и C-концах соответственно. Это подтверждает перспективность и преимущество использования замещенных дипептидов в качестве пероральных лекарственных средств в сравнении с олигопептидами, которые легко деградируют в желудочно-кишечном тракте и не проникают через гастроинтестинальный барьер. Терапевтические олигопептиды, влияющие на ЦНС, применяются преимущественно в интрана-зальной форме, а олигопептиды с периферическими эффектами - в инъекционной форме. Однако показано, что дипептидные препараты, например ноо-троп Ноопепт (этиловый эфир N-фенилацетил-Ь-пролилглицина), антипсихотик Дилепт (метиловый эфир N-капроил-Ь-пролил-Ь-тирозина) и анксио-литик ГБ-115 (амид N-фенилгексаноил-Ь-пролил-Ь-триптофана), сохраняют активность при перораль-ном введении [22, 23]. Как установлено ранее [24, 25], существуют специфические транспортные системы переноса дипептидов через энтеральную слизистую желудочно-кишечного тракта PEPT-1 и через гема-тоэнцефалический барьер РЕРТ-2.
Таким образом, можно заключить, что дипеп-тид ГСБ-106 и его таблетированная лекарственная форма обладают антидепрессивными свойствами, что позволяет рассматривать ГСБ-106 в качестве
Антидепрессивные эффекты перорального введения ГСБ-106 у крыс, определенные в тесте вынужденного плавания по Порсолту
Антидепрессивный эффект ФС ГСБ-106
Группа n Доза, мг/кг Иммобильность, с Время иммобильности, снижение по сравнению с контролем, разы
Контроль (вода) 8 177.9 ± 9.3
Амитриптилин 8 5.0 134.5 ± 10.1*# 1.3
ГСБ-106 8 0.1 184.8 ± 16.6
8 0.5 116.9 ± 21.6# 1.5
Контроль (вода) 18 199.2 ± 10.0
ГСБ-106 18 1.0 163.2 ± 7.9# 1.2
Контроль (вода) 10 216.3 ±13.8
ГСБ-106 10 5.0 137.1 ± 12.3*# 1.6
Контроль (вода) 10 190.8 ± 9.8
ГСБ-106 10 10.0 202.2 ± 14.9
Антидепрессивный эффект ЛФ ГСБ-106
Группа n Доза, мг/кг Иммобильность, с Время иммобильности, снижение по сравнению с контролем, разы
Контроль (плацебо) 10 245.7 ± 13.4
ГСБ-106 10 0.001 192.5 ± 13.2
ГСБ-106 10 0.01 155.2 ± 20.3** 1.6
ГСБ-106 10 0.05 134.9 ± 18.8*** 1.8
ГСБ-106 10 0.1 165.4 ± 15.1** 1.5
Контроль (плацебо) 10 201.2 ± 12.1
ГСБ-106 10 1.0 159.9 ± 23.6# 1.3
ГСБ-106 10 5.0 92.8 ± 17.2*** 2.2
Примечание. п - количество животных в группе. Данные представлены в виде средних и стандартных ошибок среднего. * - р < 0.05, ** - р < 0.01; *** - р < 0.001 по сравнению с контролем (и-тест Манна-Уитни); # - р < 0.05 по сравнению с контролем (/-критерий Стьюдента).
оригинального антидепрессивного лекарственного средства, первого в классе.
ВЫВОДЫ
Димерный дипептидный миметик BDNF, ГСБ-106, обладает антидепрессивной активностью при перо-ральном введении. Разработанная лекарственная форма ГСБ-106 превосходит субстанцию как по дозам, так и по выраженности антидепрессивного эффекта.
Результаты настоящего исследования показывают целесообразность создания на основе дипептида
ГСБ-106 лекарственного средства, которое по дипеп-тидной структуре и BDNF-ергическому механизму действия может быть отнесено к первому в классе.
Работа выполнена при поддержке гранта Президиума РАН «Изучение роли синаптогенеза и нейрогенеза в механизме антидепрессивной активности мозгового нейротрофического фактора с использованием его дипептидных миметиков - первых в классе потенциальных антидепрессантов» и при поддержке РНФ (проект № 18-15-00381).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Castren E., Kojima M. // Neurobiol. Dis. 2017. V. 97. Pt B. P. 119-126.
2. Shirayama Y., Chen A.C., Nakagawa S., Russell D.S., Duman R.S. // J. Neurosci. 2002. V. 22. № 8. P. 3251-3261.
3. Hoshaw B.A., Malberg J.E., Lucki I. // Brain Res. 2005. V. 1037. № 1-2. P. 204-208.
4. Hu Y., Russek S.J. // J. Neurochem. 2008. V. 105. № 1. P. 1-17.
5. Polyakova M., Stuke K., Schuemberg K., Mueller K., Schoen-knecht P., Schroeter M.L. // J. Affect. Disord. 2015. V. 174.
P. 432-440.
6. Karege F., Vaudan G., Schwald M., Perroud N., La Harpe R. // Mol. Brain Res. 2005. V. 136. № 1-2. P. 29-37.
7. Thompson R.M., Weickert C.S., Wyatt E., Webster M.J. // J.
ТОМ 10 № 3 (38) 2018 | ACTA NATURAE | 91
Psychiatry Neurosci. 2011. V. 36. № 3. P. 195-203.
8. Autry A.E., Monteggia L.M. // Pharmacol. Rev. 2012. V. 64. № 2. P. 238-258.
9. Wainwright S.R., Galea L.A. // Neural Plast. 2013. V. 2013. P. 805497.
10. Jiang C., Salton R. // Transl. Neurosci. 2013. V. 4. № 1. P. 46-58.
11. Islam O., Loo T.X., Heese K. // Curr. Neurovasc. Res. 2009. V. 6. № 1. P. 42-53.
12. Gudasheva T.A., Povarnina P., Logvinov I.O., Antipova T.A., Seredenin S.B. // Drug Des. Dev. Ther. 2016. V. 10. P. 35453553.
13. Gudasheva T.A., Tarasiuk A.V., Sazonova N.M., Povarnina P.Y., Antipova T.A., Seredenin S.B. // Dokl. Biochem. Biophys. 2017. V. 476. № 1. P. 291-295.
14. Середенин С.Б., Гудашева Т.А. Патент № 2410392 РФ. 2011.
15. Гудашева Т.А., Тарасюк А.В., Помогайбо С.В., Логвинов И.О., Поварнина П.Ю., Антипова Т.А., Середенин С.Б. // Биоорган. химия. 2012. Т. 38. № 3. С. 280-290.
16. Гудашева Т. А., Логвинов И.О., Антипова Т.А., Середенин С.Б. // Докл. Акад. наук. 2013. Т. 451. № 5. С. 577-580.
17. Середенин С.Б., Воронина Т.А., Гудашева Т.А., Гарибова Т.Л., Молодавкин Г.М., Литвинова С.А., Елизарова О.А., Посева В.И. // Acta Naturae. 2013. Т. 5 № 4(19). C. 116-120.
18. Гудашева Т.А., Поварнина П.Ю., Середенин С.Б. // Бюл. эксп. биологии и медицины. 2016. Т. 162. № 10. С. 448-451.
19. Porsolt R.D., Anton G., Blavet N., Jalfre M. // Eur. J. Pharmacol. 1978. V. 47. № 4. P. 379-391.
20. Buccafusco J.J. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience, 2nd edition. Boca Raton (FL): CRC Press/Taylor & Francis, 2009. 360 p.
21. Takamori K., Yoshida S., Okuyama S. // Pharmacology. 2001. V. 63. № 3. P. 147-153.
22. Gudasheva T.A. // Russ. Chem. Bull. Internat. Ed. 2015. V. 64. № 9. P. 2012-2021.
23. Жердев В.П., Бойко С.С., Шевченко Р.В., Гудашева Т.А. // Фармакокинетика и фармакодинамика. 2017. № 1. С. 3-10.
24. Sala-Rabanal M., Loo D.D., Hirayama B.A., Turk E., Wright E.M. // J. Physiol. 2006. V. 574. Pt 1. P. 149-166.
25. Ganapathy M.E., Prasad P.D., Mackenzie B., Ganapathy V., Leibach F.H. // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1324. № 2.
P. 296-308.
