CC BY
0
Российский медико-биологический вестник
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Том 32, № 4, 2024 имени академика И. П. Павлова
УДК 617-001.4-002-085.36
001: https://doi.org/10.17816/PAVL0VJ471212
Динамика заживления и изменение бактериальной обсемененности инфицированной раны при применении пептида GHK и его структурных аналогов
К . К . Рахметова, И. И . Бобынцев, Л . В . Жиляева, А . И . Бежин, А . О . Ворвульи
Курский государственный медицинский университет, Курск, Российская Федерация
АННОТАЦИЯ
Введение. В настоящее время перспективным направлением представляется использование для ускорения раневого процесса трипептида МН2-01у-Ь-Н1з-Ь-Ьуз-С00Н (ЭНК), который действует на процессы регенерации ткани, обладает антиоксидантными, иммунотропными и противовоспалительными эффектами . При этом недостатком всех пептидов является их быстрая деградация протеолитическими ферментами . Одним из способов повышения устойчивости пептидных молекул является включение в их структуру 0-изомеров аминокислот. Ранее нами было установлено, что ЭНК-О-А1а оказывал более выраженное влияние на регенеративные процессы в ране, способствовал увеличению в ране количества клеток фибробластического ряда, макрофагов на фоне уменьшения числа гранулоцитов и лимфоцитов, представлено существенное влияние О-А1а-ЭНК и ЭНК-О-А1а на показатели врожденного иммунитета и перекисного окисления липидов .
Цель. Оценить динамику заживления и бактериальной обсемененности инфицированной раны при применении пептида глицил-гистидил-лизин и его структурных модификаций с О-аланином (О-А1а) .
Материалы и методы. Эксперименты выполнены на крысах линии W¡star. В работе использовали пептид ЭНК и его структурные аналоги О-А1а-ЭНК и ЭНК-О-А1а; вводили внутрикожно вокруг раны в дозах 0,5 мкг/кг и 1,5 мкг/кг каждые 24 ч . на протяжении 3, 7 или 10 сут . Оценивали площадь раны с расчетом коэффициента относительного ранозаживления (КОР), скорость заживления, сроки исчезновения перифокального отека, очищения раны, появления грануляций и начала краевой эпителизации . Бактериальную обсемененность определяли путем подсчета колоний на питательных средах после посева на них материала из биоптата раны .
Результаты. На 3 сут. КОР увеличился в 3,2-5,3 раза (р < 0,05-0,01) после использования пептидов О-А1а-ЭНК и ЭНК-О-А1а в обеих дозах при отсутствии эффекта после введения ЭНК. На 7 сут. уменьшение площади раны достигло статистически значимых различий во всех подопытных группах . К 10 сут . также во всех группах использование пептидов вызвало уменьшение площади раны при наибольшей выраженности после введения пептида ЭНК-О-А1а (93%, р < 0,001) . На 7-10 сут. ЭНК-О-А1а увеличил скорость заживления в 4,7-5,3 раза (р < 0,05-0,01) при отсутствии существенных изменений после введения ЭНК и О-А1а-ЭНК. Также ЭНК-О-А1а в обеих дозах способствовал наиболее раннему исчезновению перифокального отека, очищению раны, появлению грануляций и началу краевой эпителизации . Значимое снижение бактериальной обсемененности наблюдалось после введения всех пептидов на 7 и 10 сут . при наибольшей выраженности после применения ЭНК-О-А1а .
Заключение. В условиях инфицированной кожной раны применение пептида ЭНК и его структурных аналогов О-А1а-ЭНК и ЭНК-О-А1а ускоряет ее заживление на фоне снижения бактериальной обсемененности . При этом наиболее выраженные изменения данных показателей отмечались после введения пептида ЭНК-О-А1а, что указывает на важное значение защиты молекулы ЭНК от действия карбоксипептидаз . Перспективным продолжением исследований в данном направлении может являться разработка местного средства с антибактериальным действием для стимуляции процессов регенерации в ране .
Ключевые слова: GHK; D-аланин; регенерация; раневой процесс; бактериальная обсемененность; планиметрия Для цитирования:
Рахметова К.К., Бобынцев И.И., Жиляева Л.В., Бежин А.И., Ворвуль А.О. Динамика заживления и изменение бактериальной обсемененности инфицированной раны при применении пептида БЫК и его структурных аналогов // Российский медико-биологический вестник имени академика И. П. Павлова. 2024. Т. 32, № 4. С. 539-548. 001: https://doi.org/10.17816/PAVL0VJ471212
Рукопись получена: 31. 05. 2023 Рукопись одобрена: 14 . 09 . 2024 Опубликована: 31.12. 2024
Лицензия К BY-NC-ND 4.0 © Коллектив авторов, 2024
ORIGINAL STUDY ARTICLES 540 -
DOI: https://dol.org/10.17816/PAVLOVJ471212
Effects of GHK Peptide and Its Structural Analogues on Dynamics of Healing and Bacterial Contamination of Infected Wound
Kamila K. Rakhmetova, Igor' I . Bobyntsev, Lyudmila V . Zhilyayeva, Aleksandr I . Bezhin, Anton 0 . Vorvul'H
Kursk State Medical University, Kursk, Russian Federation
ABSTRACT
INTRODUCTION: Currently, a promising trend to accelerate wound process seems to be the use of NH2-Gly-L-His-L-Lys-C00H (GHK) tripeptide, which acts on the tissue regeneration, possesses antioxidant, immunotropic and anti-inflammatory effects . At the same time, the disadvantage of all peptides is their rapid degradation by proteolytic enzymes 0ne method to increase the stability of peptide molecules is the incorporation of D-isomers of amino acids in their structure . It was previously found by us that GHK-D-Ala produces a more marked effect on regenerative processes in the wound and facilitates increase in the number of fibroblast cells and macrophages in the wound with the underlying decrease in the number of granulocytes and lymphocytes; a significant effect of D-Ala-GHK and GHK-D-Ala on the parameters of the inborn immunity and lipid peroxidation was shown .
AIM: To evaluate the healing dynamics and bacterial contamination of an infected wound when using Glycyl-Histidyl-Lysine (GHK) peptide and its structural modifications with D-alanine (D-Ala) .
MATERIALS AND METHODS: The experiments were conducted on Wistar rats . In the work, GHK peptide and its structural analogues D-Ala-GHK and GHK-D-Ala were used; they were administered intracutaneously around the wound at doses of 0 . 5 pg/kg and 1. 5 pg/kg every 24 hours for 3rd, 7th and 10th days . The wound area with calculation of the relative wound healing coefficient (RWHC), the healing rate, the time of perifocal edema disappearance, wound cleansing, appearance of granulation and onset of marginal epithelialization were assessed Bacterial contamination was determined by counting colonies on the nutrient media after inoculation of wound biopsy material on them .
RESULTS: On day 3rd, RWHC increased 3 . 2-5 . 3 times (p < 0 . 05-0 . 01) after the use of D-Ala-GHK and GHK-D-Ala peptides at both doses with no effect after the injection of GHK . On day 7th, the reduction of the wound area reached statistically significant differences in all experimental groups . By day 10th, the use of peptides resulted in decrease in the wound area most evident after the injection of GHK-D-Ala peptide (by 93%, p < 0 . 001) in all groups . On days 7th-10th, GHK-D-Ala increased the healing rate 4 . 7-5 . 3 times (p < 0 . 05-0 . 01) with no significant changes after the injection of GHK and D-Ala-GHK Also, GHK-D-Ala at both doses resulted in the earliest disappearance of perifocal edema, wound cleansing, emergence of granulation and the onset of marginal epithelialization in all experimental groups Significant reduction in bacterial contamination was observed after administration of all peptides on days 7th and 10th, being most pronounced after the use of GHK-D-Ala
CONCLUSION: The application of GHK peptide and its structural analogues D-Ala-GHK and GHK-D-Ala in infected skin wounds accelerated wound healing against the background reduction of bacterial contamination . The most pronounced changes of these parameters were observed after administration of GHK-D-Ala peptide, which indicates the importance of protecting GHK molecule against the impact of carboxypeptidases . A promising continuation of the research in this direction can be the development of local means with antibacterial effect for stimulation of the regeneration processes in the wound
Keywords: GHK; D-Alanine; regeneration; wound process; bacterial contamination; planimetry For citation:
Rakhmetova KK, Bobyntsev II, Zhilyayeva LV, Bezhin AI, Vorvul' AO. Effects of GHK Peptide and Its Structural Analogues on Dynamics of Healing and Bacterial Contamination of Infected Wound. I. P. Pavlov Russian Medical Biological Herald. 2024;32(4):539—548. DOI: https://doi.org/10.17816/PAVLOVJ471212
Accepted: 14 . 09 . 2023 Published: 31.12. 2024
The article can be use under the CC BY-NC-ND 4.0 license
© Authors, 2024
Received: 31. 05 . 2023
ECO O R
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ЭНК — Glycyl-Histidyl-Lysine (глицил-гистидил-лизин)
О-А1а — О-А1ашпе (О-аланин)
КОЕ — колониеобразующая единица
КОР — коэффициент относительного ранозаживления
СЗ — скорость заживления
ВВЕДЕНИЕ
Повышение эффективности регенеративных механизмов при раневых процессах является актуальным направлением современных биомедицинских исследований В настоящее время установлено, что основными последовательно развивающимися этапами регенерации при повреждениях тканей являются воспалительная реакция, заживление ран, ремоделирова-ние внеклеточного матрикса, противовоспалительный и противофиброзный ответ, а также ремоделирование ткани [1-3]. Данные процессы обеспечиваются достаточно сложными и многообразными механизмами с участием всех регуляторных систем организма [4-6] . Одним из возможных путей реализации данной задачи может являться изучение пептидергических механизмов активации процессов заживления раны . В настоящее время накоплен значительный объем информации о применении пептидных молекул и созданных на их основе фармакологических препаратов в коррекции различных патологических процессов [6]. Поэтому достаточно перспективным представляется использование для ускорения разрешения раневого процесса трипептида глицил-гистидил-лизин (англ. : Glycyl-Histidyl-Lysine, ЭНК) .
Известно, что данный пептид действует на процессы регенерации ткани [7, 8], а также обладает ан-тиоксидантными, иммунотропными и противовоспалительными эффектами [9, 10] . При этом основным недостатком всех регуляторных пептидов является их быстрая деградация протеолитическими ферментами
Одним из возможных способов повышения устойчивости пептидных молекул и, как следствие, увеличения продолжительности их биологического действия является включение в их структуру О-изомеров аминокислот. В предыдущих исследованиях нами было установлено, что ЭНК-О-А1а (англ . : D-Alanine, О-А1а, О-аланин) оказывал более выраженное, чем ЭНК, влияние на регенеративные процессы в ране, способствовал увеличению в ране количества клеток фибробластического ряда, макрофагов на фоне уменьшения числа гранулоцитов и лимфоцитов [10]. Также было представлено существенное влияние ЭНК и его структурных аналогов О-А1а-ЭНК и ЭНК-О-А1а
при кожной инфицированной ране на показатели врожденного иммунитета и перекисного окисления липидов Наиболее выраженные и устойчивые эффекты также наблюдались при использовании ЭНК-О-А1а [11]. Полученные в данных исследованиях результаты обусловили необходимость изучения на фоне применения влияния ЭНК и его структурных аналогов О-А1а-ЭНК и ЭНК-О-А1а интегративных показателей заживления раны, используемых для клинической оценки эффективности регенеративных процессов
Цель — оценить динамику заживления и бактериальной обсемененности инфицированной раны при применении пептида ЭНК и его структурных модификаций с О-А1а .
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты выполнены на 150 крысах-самцах линии W¡star массой 180-240 г в возрасте 6-8 мес . (филиал «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства) . Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище при 12-часовом световом режиме и температуре воздуха 22 ± 2°С . Все подопытные группы включали по 10 крыс
В работе использовали пептид ЭНК и его структурные аналоги О-А1а-ЭНК и ЭНК-О-А1а (синтезированы в Научно-исследовательском институте химии Санкт-Петербургского государственного университета), которые растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрикожно (в двух точках вокруг раны, ежедневно меняя области введения по часовой стрелке на 90°) в дозах 0,5 мкг/кг и 1,5 мкг/кг в 0,1 мл через 24 ч после моделирования инфицированной раны с последующим введением той же дозы препарата каждые 24 ч . на протяжении 3, 7 или 10 сут. В контрольной серии животным в аналогичные промежутки времени вводили эквивалентные объемы физиологического раствора из расчета 1 мл на 1 кг массы тела Последнее введение препаратов осуществляли за 24 ч до вывода животных из эксперимента
Животных выводили из эксперимента путем забора крови из правого желудочка сердца под эфирным наркозом
Все исследования проводили с соблюдением принципов Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях; «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Москва, 2012) и в соответствии с решением Регионального этического комитета при Курском государственном медицинском университете (Протокол № 1 от 16 . 01. 2014) .
Для создания модели инфицированной (естественное инфицирование) открытой раны на выбритом от шерсти участке спины наркотизированного животного наносили полнослойные раны стандартного размера (250 мм2) .
Сразу после моделирования раневого процесса, а также на первые, третьи, седьмые и десятые сутки раны фотографировали цифровой камерой Canon A410 с применением миллиметровой сетки с последующим измерением площадей ран на данных сроках контроля . Вычисление площадей ран производилось с помощью программы ImageJ (National Institutes of Health, США) .
Для объективной планиметрической оценки заживления раны по изменению ее площади применяли коэффициент относительного ранозаживления (КОР) — выраженное в % уменьшение площади ран от исходного размера, который вычисляли по формуле:
КОР = (S0 - S) / S0 х 100%,
где S0 — начальная, а S — конечная площадь раны (мм2) [12].
Также рассчитывали скорость заживления ран (уменьшения площади раны за сутки в %) по формуле:
СЗ = (КОР1 - КОРц) / Т,
где СЗ — скорость заживления, КОР, — коэффициент на момент измерения (конечный), КОР0 — коэффициент при предыдущем измерении, Т — количество дней между измерениями
При визуальном осмотре оценивали клинические показатели заживления раны: сроки исчезновения пе-рифокального отека, очищения раны, появления грануляций и начала краевой эпителизации
Для количественного определения микробной обсемененности рану предварительно обрабатывали изотоническим раствором натрия хлорида, затем 70% этиловым спиртом с целью удаления с ее поверхности вегетирующей микрофлоры, гноя и детрита. Взятие материала производили после выведения животного из эксперимента в стерильном боксе иссечением участка ткани массой 0,1-0,5 г на всю глубину раны .
В дальнейшем биоптат взвешивали для вычисления коэффициента пересчета на 1 г ткани (К), готовили суспензию в изотоническом растворе натрия хлорида из расчета 1:10 и осуществляли посев 0,1 мл на плотную питательную среду (мясо-пептонный агар) по методу Дригальского Посевы инкубировали в термостате (37°С) в течение 20 ч . , затем сутки при комнатной температуре, после чего осуществляли подсчет колоний с учетом пересчета на 1 г ткани
Подсчет колоний вели на чашках, в которых колонии росли изолированно и количество их не превышало 300 Количество микробов в 1 г ткани высчитывали по формуле:
N = n х 10 х 10 (или х 100, или х 1000) х К,
где N — количество микробов в 1 г биоптата, n — количество микробов, выросших в чашке Петри, 10 — пересчет на 1 г суспензии, 10, 100 или 1000 — разведение засеянного материала на чашку Петри, с которой вели подсчет колоний, К — коэффициент пересчета навески на 1 г биоптата .
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием языка программирования R ver. 4 .1. 0 [13] в интегрированной среде разработки RStudio Desktop ver . 1. 4 .1717 (RStudio, PBC, США) . Для проверки нормальности распределения применяли критерий Шапиро-Уилка (функция shapiro ,test() из стандартного пакета), а равенства дисперсий — критерий Левене (функция levene . test() из пакета lawstat) . В случае подтверждения гипотез данные представляли в виде «среднее ± стандартное отклонение» (M ± SD), М и SD вычисляли с помощью функций mean() и sd() из стандартного пакета; при отклонении — в виде «Медиана [нижний квартиль; верхний квартиль]» (Me [Q1; Q3]), которые вычисляли с использованием функций median() и quantile() из стандартного пакета Для определения различий между группами применяли критерий Краскела-Уоллиса (функция kruskal test() из стандартного пакета) с апостериорным тестом Данна с поправкой Бенджами-ни-Хохберга (функция dunnTest() из пакета FSA) . Тест Данна проводился только при наличии значимых межгрупповых различий: p-значение для рассчитанного критерия Краскела-Уоллиса с 6 межгрупповыми степенями свободы и 70 — внутригрупповыми (H6 70) было менее 0,05 . Для него рассчитывались z-значение и степень его значимости (p-значение) . Различия считали значимыми при p < 0,05 .
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как следует из таблицы 1, на 3 сут. во всех подопытных группах существенных различий в показателях площади раны и коэффициента ранозаживле-
Российский медико-биологический вестник
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Том 32, № 4, 2024 имени академика И. П. Павлова
ния в сравнении с контрольными животными не наблюдалось .
На 7 сут. уменьшение площади раны достигало достоверно значимых различий во всех подопытных группах. Наиболее выраженные сдвиги при этом наблюдались после введения ОИК в дозах 0,5 (на 62%, г = -4,53, р = 0,000005) и 1,5 мкг/кг (на 56%, г = -4,11, р = 0,00003), а также О-А1а-ОИК в дозе 0,5 мкг/кг (на 60%, г = -4,4, р = 0,00001), что отразилось в достоверно значимом увеличении в данных группах коэффициента ра-нозаживления в 2,37 (г = 3,78, р = 0,00015), 2,17 (г = 3,74, р = 0,00018) и 1,94 (г = 3,13, р = 0,0017) раза соответственно . Увеличение данного показателя после введения ОИК-О-А1а не было статистически значимым. К 10 сут. эксперимента во всех группах использование
пептидов сопровождалось существенным уменьшением площади раны Наиболее выраженные различия относительно контрольных значений отмечались после введения пептида ОИК-О-А1а в дозах 0,5 (на 93%, г = -5,91, р = 0,000000004) и 1,5 мкг/кг (на 92%, г = -5,33, р = 0,00000007) . После введения пептида О-А1а-ОИК снижение данного показателя было наименее выраженным: на 58% (г = -2,19, р = 0,0028) в дозе 0,5 мкг/кг и на 59% (г = -2,03, р = 0,0042) в дозе 1,5 мкг/кг. При этом обращает внимание отсутствие зависимости эффекта данных пептидов от использованной дозы . На фоне применения ОИК площадь раны была меньше контрольных значений после введения в дозах 0,5 мкг/кг (на 69%, г = -2,91, р = 0,00036) и 1,5 мкг/кг (на 83%, г = -4,36, р = 0,000015) .
Таблица 1. Динамика изменений планиметрических показателей заживления раны (п = 10) при применении пептидов О-А1а-ОИК и ОИК-О-А1а, М ± БО/Ме [01; 03]
Группы Срок
1 сутки 3 сутки 7 сутки 10 сутки
Площадь раны, мм2
Контроль 250,00 [249,25; 250,00] 216,60 ± 39,88 165,50 ± 47,43 85,50 [72; 155,75]
БЫК 0,5 мкг/кг 250,00 [248,50; 250,00] 211,50 ± 63,93 63,40 ± 28,32*** 26,50 [19,5; 29,00]**
БЫК 1,5 мкг/кг 249,00 [248,00; 250,00] 209,00 ± 35,05 72,60 ± 36,41*** 14,50 [8,5; 23,25]***
О-А1з-БИК 0,5 мкг/кг 249,50 [248,25; 250,00] 174,60 ± 28,78 66,60 ± 23,33*** 36,00 [23,5; 43,50]*
О-А1з-БИК 1,5 мкг/кг 250,00 [249,25; 250,00] 174,30 ± 37,85 97,10 ± 17,99*** 35,50 [24,25; 59,25]*
БИК-О-А1з 0,5 мкг/кг 249,50 [248,00; 250,00] 169,00 ± 47,01 96,70 ± 34,08*** 6,30 [5,1; 8,60]***
БИК-О-А1з 1,5 мкг/кг 249,50 [248,00; 250,00] 172,00 ± 47,86 113,80 ± 42,07** 7,20 [5,7; 16,00]***
Критерий Краскела-Уоллиса Иб,70 = 2,71, р = 0,84 И6,70 = 12,47, р = 0,052 ^70 = 32,96, p = 0,00001 ^ 70 = 51,85, p = 0,00001
Коэффициент относительного ранозаживления, %
Контроль 0,40 [0,00; 0,79] 6,80 [2,30; 25,88] 21,32 ± 27,97 36,22 [14,02; 45,85]
БЫК 0,5 мкг/кг 0,20 [-0,30; 0,70] 17,56 [2,21; 35,27] 66,68 ± 21,11*** 62,55 [33,68; 71,87]
БЫК 1,5 мкг/кг 0,40 [0,00; 0,80] 13,39 [10,18; 22,30] 65,21 ± 18,06*** 77,98 [60,72; 86,80]**
О-А1з-БИК 0,5 мкг/кг 0,40 [0,10; 0,70] 27,33 [20,42; 38,63] 59,79 ± 19,41*** 48,17 [36,42; 55,03]
О-А1з-БИК 1,5 мкг/кг 0,20 [0,00; 0,80] 25,74 [19,97; 39,93] 43,16 ± 9,00 61,57 [45,01; 74,50]
БИК-О-А1з 0,5 мкг/кг 0,80 [0,10; 0,80] 36,97 [15,32; 45,22] 40,31 ± 24,89 92,00 [89,80; 94,59]***
БИК-О-А1з 1,5 мкг/кг 0,80 [0,10; 1,09] 22,01 [19,27; 47,91] 33,04 ± 21,96 91,98 [89,79; 94,64]***
Критерий Краскела-Уоллиса И6,70 = 2,78 р = 0,83 И6,70 = 12,47, р = 0,052 ^,70 = 27,85, p = 0,0001 ^,70 = 47,39, p = 0,00003
Примечания: * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001 при сравнении с контрольной группой (по апостериорному тесту Данна)
ORIGINAL STUDY ARTICLES 544 -
Скорость заживления ран у крыс, получавших ЭИК, за 1-3 сут . существенно не отличалась от контрольной группы (табл . 2) . На фоне введения О-А1а-ОНК и ОНК-Э-А1а заживление в равной степени ускорялось, но не достигало статистически значимых различий . За период 3-7 сут. пептид ОНК в дозе 0,5 мкг/кг повышал скорость заживления в 2,7 раза (2 = 2,44, р = 0,015), а в дозе 1,5 мкг/кг — в 1,4 раза (2 = 2,68, р = 0,007) . Однако на фоне введения ОНК-О-А1а, напротив, отмечалась тенденция к снижению данного показателя без достижения
достоверно значимого уровня . Применение О-А1а-ОНК сопровождалось разнонаправленными недостоверными изменениями в подопытных группах . На заключительном этапе эксперимента (7-10 сут. ) на фоне введения ОНК-О-А1а отмечено значительное ускорение заживления раны . Так, в дозе 0,5 мкг/кг пептид увеличивал данный процесс в 4,7 раза (2 = 2,57, р = 0,001) и в 5,3 раза в дозе 1,5 мкг/кг (2 = 3,09, р = 0,0002) . При этом существенных изменений скорости заживления после введения ОНК и О-А1а-ОНК не наблюдалось .
Таблица 2. Динамика скорости заживления раны (п = 10) при применении пептидов О-А1а-ОНК и ОНК-О-А1а, М ± БО/Ме [01; 03], %
Группы Срок
1-3 сутки 3-7 сутки 7-10 сутки
Контроль 6,43 ± 8,04 5,85 [-3,12; 8,19] 3,68 ± 8,15
БЫК 0,5 мкг/кг 7,52 ± 12,66 15,87 [3,64; 18,86]** -5,10 ± 14,53
БЫК 1,5 мкг/кг 7,85 ± 7,27 14,20 [11,03; 15,38]*** 2,83 ± 10,81
О-А1а-БИК 0,5 мкг/кг 14,64 ± 5,91 8,74 [6,36; 12,33] -5,34 ± 12,78
О-А1а-БИК 1,5 мкг/кг 14,89 ± 7,91 4,54 [-1,91; 7,56] 5,62 ± 6,82
БИК-О-А1а 0,5 мкг/кг 15,89 ± 9,61 3,90 [-5,54; 9,74] 17,24 ± 8,86*
БИК-О-А1а 1,5 мкг/кг 15,16 ± 9,70 1,56 [-1,43; 6,70] 19,62 ± 7,63**
Критерий Краскела-Уоллиса H6,70 = 12,01, p = 0,0616 Нб,70 = 20,04, p = 0,0027 Нб,70 = 34,49, p = 0,00001
Примечания: * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001 при сравнении с контрольной группой (по апостериорному тесту Данна)
Установленное повышение скорости заживления раны при введении ОНК-О-А1а проявилось и в клинических показателях (табл . 3) . Так, в обеих использованных дозах пептид способствовал наиболее раннему среди всех подопытных групп исчезновению перифокаль-ного отека, очищению раны, появлению грануляций
и началу краевой эпителизации . Эффекты ОНК и О-А1а-ОНК при этом были менее выраженными и между ними не отмечалось существенных различий. Следует отметить, что при использовании всех пептидов изменения сроков проявления клинических показателей заживления раны имели достоверный характер .
Таблица 3. Динамика клинических показателей заживления раны (п = 10) при применении пептидов О-А1а-ОНК и ОНК-О-А1а, М ± БО/Ме [01; 03]
^""""---...„Показатели Группы ^""""---.....„^ Исчезновение перифокального отека, сутки Очищение раны, сутки Появление грануляций, сутки Начало краевой эпителизации, сутки
Контроль 8 [8; 8,75] 9 [8,25; 9] 7 [7; 8] 9 [8; 9]
БЫК 0,5 мкг/кг 6 [5; 6]*** 6 [6; 6]*** 5 [5; 5]*** 5 [5; 5]***
БЫК 1,5 мкг/кг 6 [6; 6]*** 6,00 [6; 6,75]*** 5 [5; 6]** 6 [5; 6]**
О-А1а-БИК 0,5 мкг/кг 6 [6; 7]* 7 [6; 7]* 5,50 [5; 6]* 6 [5; 6]**
О-А1а-БИК 1,5 мкг/кг 6 [6; 6]** 6 [6; 7]** 5 [5; 6]** 6 [5; 6]**
БИК-О-А1а 0,5 мкг/кг 5 [4; 5]*** 5 [4,25; 5]*** 3 [3; 3,75]*** 4 [3; 4]***
БИК-О-А1а 1,5 мкг/кг 4 [4; 5]*** 5 [5; 5,75]*** 4 [3; 4]*** 5 [4; 5]***
Критерий Краскела-Уоллиса Н6 70 = 56,85, р = 0,00001 Н6 70 = 49,93, р = 0,00001 Н6 70 = 56,97, р = 0,00001 Н6 70 = 50,96, р = 0,00001
Примечания: * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001 при сравнении с контрольной группой (по апостериорному тесту Данна)
Известно, что важную роль в процессе заживления инфицированной раны играют показатели микробной обсемененности . Как видно из таблицы 4, на 3 сут. данный показатель имел близкие значения во всех группах животных. Однако на 7 сут. его значения достоверно снижались после введения как ЭИК, так и его аналогов . При этом наибольшее уменьшение микробной обсемененности (32%, г = 2,64, р = 0,0017) наблюдалось на фоне
применения ОИК-О-А1а в дозе 0,5 мкг/кг Подобный характер изменений данного показателя, но при еще большей выраженности, сохранился на 10 сут эксперимента . Так, наибольшее уменьшение микробной обсемененности (37%, г = 2,77, р = 0,0011) также наблюдалось на фоне применения ОИК-О-А1а в дозе 0,5 мкг/ кг, а наименее выраженный эффект отмечен после введения ОИК в аналогичной дозе (8%, г = 1,56, р = 0,042) .
Таблица 4. Показатели микробной обсемененности раны (п = 10) при применении пептидов О-А1а-ОИК и ОИК-О-А1а, М ± БО/Ме [01; 03], 1дКОЕ/г аутоптата
Группы Срок
3 сутки 7 сутки 10 сутки
Контроль 6,48 [6,47; 6,48] 5,98 ± 5,06 5,86 [5,79; 5,90]
БЫК 0,5 мкг/кг 6,48 [6,44; 6,48] 5,83 ± 5,23*** 5,41 [5,30; 5,50] *
БИК 1,5 мкг/кг 6,47 [6,46; 6,48] 5,33 ± 4,46*** 4,28 [4,18; 4,37] ***
О-А1з-БИК 0,5 мкг/кг 6,48 [6,44; 6,48] 5,44 ± 4,79*** 4,30 [4,26; 4,34] *
О-А1з-БИК 1,5 мкг/кг 6,47 [6,44; 6,48] 5,29 ± 4,24*** 4,10 [4,01; 4,17] ***
БИК-О-А1з 0,5 мкг/кг 6,48 [6,47; 6,48] 4,08 ± 3,45*** 3,68 [3,51; 3,83] ***
БИК-О-А1з 1,5 мкг/кг 6,47 [6,43; 6,48] 5,81 ± 4,94*** 4,47 [4,33; 4,48] ***
Критерий Краскела-Уоллиса И6,70 = 2,78 р = 0,8355 ^,70 = 12,47, p = 0,032 ^,70 = 56,97, p = 0,00001
Примечания: * — р < 0,05; *** — р < 0,001 при сравнении с контрольной группой (по апостериорному тесту Данна); КОЕ — колоние-образующая единица
ОБСУЖДЕНИЕ
Таким образом, ОИК и его структурные аналоги О-А1а-ОИК и ОИК-О-А1а способствовали ускорению заживления раны и снижению ее бактериальной обсе-мененности. Следует отметить, что полученные данные согласуются с результатами наших предыдущих исследований и их сопоставление в значительной мере способствует выяснению механизмов выявленных эффектов . Известно, что двухвалентные катионы меди необходимы для образования гидроксильных радикалов, являющихся важным компонентом в кислородза-висимых бактерицидных механизмах фагоцитирующих клеток . Полнота очищения раны от некротизированных элементов и микробов является основным условием эффективности репаративных процессов . Однако повышение образования активных форм кислорода, являющихся важными факторами развития вторичной альтерации в очаге воспаления, может сопровождаться высокой активацией перекисного окисления липи-дов и увеличением уровней малонового диальдегида и ацилгидроперекисей . При этом динамика изменения
активности данных процессов и их соотношение могут иметь достаточно сложный характер [11].
ОИК при взаимодействии с ионами меди образует комплекс ОИК-Си, который активирует процессы пролиферации при раневых процессах в коже и положительный хемотаксис макрофагов в область повреждения [14-16] . Ранее нами на аналогичной экспериментальной модели кожной раны в те же сроки наблюдения было показано, что ОИК и ОИК-О-А1а снижали число грану-лоцитов и лимфоцитов и повышали число клеток фи-бробластического ряда, макрофагов и клеточный индекс при большей активности ОИК-О-А1а [9] . Динамика данных морфометрических показателей, полученных при гистологическом изучении биоптата раны, могла находиться в основе изменений планиметрических показателей, установленных в настоящей работе . Раннее и более выраженное, чем в контрольной группе, снижение бактериальной обсемененности раны могло развиваться за счет более ранней активации процессов свободнора-дикального окисления в фагоцитирующих клетках [10] . Вероятно, быстрое уменьшение данного показателя явилось причиной снижения на поздних сроках наблюдения
ряда показателей фагоцитарной активности, отмеченных ранее [10], вследствие полного очищения раны, что также способствовало положительной динамике интегратив-ных планиметрических показателей заживления раны .
При этом достижение данного эффекта возможно и за счет антибактериального действия ОНК-Си2+. В частности, такое действие показано при местном применении данных комплексов в виде наночастиц [17]. При этом в структуре молекулы ОНК-Си2+ остается свободным С-конец [9, 16], что делает возможным присоединение О-А1а .
Повышение эффективности ОНК после его структурной модификации с применением О-А1а может быть обусловлено не только повышением устойчивости к действию протеаз, но и за счет действия образующихся при деградации пептидной молекулы аминокислот . В частности, О-А1а поддерживает потенциал мито-хондриальной мембраны и препятствует образованию активных форм кислорода, повреждающих клеточные структуры и нуклеиновые кислоты [18-20] .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании полученных данных можно заключить, что в условиях инфицированной кожной раны применение пептида ОНК и его структурных аналогов О-А1а-ОНК и ОНК-О-А1а ускоряет ее заживление на фоне снижения бактериальной обсемененности. При этом наиболее выраженные изменения данных показателей отмечались после введения пептида ОНК-О-А1а, что указывает на важное значение защиты молекулы ОНК от действия карбоксипептидаз .
Перспективным продолжением исследований в данном направлении может являться разработка местного средства для стимуляции процессов регенерации в ране с антибактериальным действием на основе комплекса пептида GHK-D-Ala и Cu2+ с его использованием в виде наночастиц .
ДОПОЛНИТЕЛЬНО
Финансирование. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов: Рахметова К. К — обработка материала, написание текста; Бобынцев И. И. — концепция и дизайн исследования, общее руководство, редактирование; Жиляева Л. В. — дизайн исследования, редактирование; Бежин А. И. — концепция и дизайн исследования, общее руководство; Ворвуль А. О. — обработка материала, написание текста. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).
Funding. This study was not supported by any external sources of funding.
Conflict of interests. The authors declare no conflicts of interests. Contribution of the authors: K. K. Rakhmetova — processing of material, writing the text; 1.1. Bobyntsev — concept and design of study, general guidance, editing; L. V. Zhilyayeva — concept of study, editing; A. I. Bezhin — concept and design of study, general guidance, editing; A. O. Vorvul' — processing of material, writing the text. The authors confirm the correspondence of their authorship to the ICMJE International Criteria. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Власова Т.И., Арсентьева Е.В., Спирина М.А., и др. Сигнальные пути и молекулярные маркеры эпидермальных стволовых клеток в процессе регенерации кожи // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2022. Т. 66, № 2. С. 91-101. doi: 10.25557/0031-2991.2022.02.91-101
2. Wynn T.A., Vannella K.M. Macrophages in Tissue Repair, Regeneration, and Fibrosis // Immunity. 2016. Vol. 44, No. 3. P. 450-462. doi: 10.1016/j.immuni.2016.02.015
3. Башкина О.А., Самотруева М.А., Ажикова А.К., и др. Нейроимму-ноэндокринная регуляция физиологических и патофизиологических процессов в коже // Медицинская иммунология. 2019. Т. 21, № 5. С. 807-820. doi: 10.15789/1563-0625-2019-5-807-820
4. Макаревич П.И., Ефименко А.Ю., Ткачук В.А. Биохимическая регуляция регенеративных процессов факторами роста и цито-кинами: основные механизмы и значимость для регенеративной медицины // Биохимия. 2020. Т. 85, № 1. С. 15-33. doi: 10.31857/ S0320972520010029
5. Хавинсон В.Х. Лекарственные пептидные препараты: прошлое, настоящее, будущее // Клиническая медицина. 2020. Т. 98, № 3. С. 165-177. doi: 10.30629/0023-2149-2020-98-3-165-177
6. Pickart L., Margolina A. Regenerative and Protective Actions of the GHK-Cu Peptide in the Light of the New Gene Data // Int. J. Mol. Sci. 2018. Vol. 19, No. 7. P. 1987. doi: 10.3390/ijms19071987
7. Pickart L., Vasquez-Soltero J.M., Margolina A. GHK Peptide as a Natural Modulator of Multiple Cellular Pathways in Skin Regeneration // Biomed. Res. Int. 2015. Vol. 2015. P. 648108. doi: 10.1155/2015/648108
8. Pickart L., Vasquez-Soltero J.M., Margolina A. The human tripeptide GHK-Cu in prevention of oxidative stress and degenerative conditions of aging: implications for cognitive health // Oxid. Med. Cell. Longev. 2012. Vol. 2012. P. 324832. doi: 10.1 155/2012/324832
9. Рахметова К.К., Мишина Е.С., Ворвуль А.О., и др. Регенеративные эффекты пептидов Gly-His-Lys и Gly-His-Lys-D-Ala при кожной инфицированной ране // Вестник РГМУ. 2022. № 2. С. 62-68. doi: 10.24075/vrgmu.2022.014
10. Рахметова К.К., Бобынцев И.И., Бежин А.И., и др. Эффекты пептида GHK и его структурных аналогов D-Ala-GHK и GHK-D-Ala на состояние врожденного иммунитета и перекисного окисления липидов в условиях кожной раны // Человек и его здоровье. 2023. Т. 26, № 1. С. 33-44. doi: 10.21626/vestnik/2023-1/05
11. Рисман Б.В., Зубарев П.Н. Современные методики оценки течения раневого процесса // Известия Российской Военно-медицинской академии. 2020. Т. 39, № 3. С. 74-81. doi: 10.17816/ rmmar64988
12. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing [Интернет]. Доступно по: https://www.R-project.org/. Ссылка активна на 31.05.2023.
13. Wang X., Liu B., Xu Q., et al. GHK-Cu-liposomes accelerate scald wound healing in mice by promoting cell proliferation and angiogenesis // Wound Repair Regen. 2017. Vol. 25, No. 2. P. 270-278. doi: 10.1111/wrr.12520
14. Gruchlik A., Chodurek E., Dzierzewicz Z. Effect of GLY-HIS-LYS and its copper complex on TGF-(3 secretion in normal human dermal fibroblasts // Acta Pol. Pharm. 2014. Vol. 71, No. 6. P. 954-958.
15. Pickart L., Vasquez-Soltero J.M., Margolina A. GHK-Cu may Prevent Oxidative Stress in Skin by Regulating Copper and Modifying Expression of Numerous Antioxidant Genes // Cosmetics. 2015. Vol. 2, No. 3. P. 236-247. doi: 10.3390/cosmetics2030236
16. Sun L., Li A., Hu Y., et al. Self-Assembled Fluorescent and Antibacterial GHK-Cu Nanoparticles for Wound Healing Applications // Particle & Particle Systems Characterization. 2019. Vol. 36, No. 4. P. 1800420. doi: 10.1002/ppsc.201800420
17. Iwata Y., Nakade Y., Kitajima S., et al. Protective effect of d-alanine against acute kidney injury // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2022. Vol. 322, No. 6. P. F667-F679. doi: 10.1152/ajprenal.00198.2021
18. Shi Y., Hussain Z., Zhao Y. Promising Application of D-Amino Acids toward Clinical Therapy // Int. J. Mol. Sci. 2022. Vol. 23, No. 18. P. 10794. doi: 10.3390/ijms231810794
19. Lee C.J., Qiu T.A., Sweedler J.V. D-Alanine: Distribution, origin, physiological relevance, and implications in disease // Biochim. Biophys. Acta Proteins Proteom. 2020. Vol. 1868, No. 11. P. 140482. doi: 10.1016/j.bbapap.2020.140482
REFERENCES
1. Vlasova TI, Arsenteva EV, Spirina MA, et al. Signaling pathways and molecular markers of epidermal stem cells during regeneration. Patologicheskaya Fiziologiya i Eksperimental'naya terapiya. 2022;66(2):91-101. (In Russ). doi: 10.25557/0031-2991.2022.02.91-101
2. Wynn TA, Vannella KM. Macrophages in Tissue Repair, Regeneration, and Fibrosis. Immunity. 2016;44(3):450-62. doi: 10.1016/j. immuni.2016.02.015
3. Bashkina OA, Samotrueva MA, Azhikova AK, et al. Neuro-immunoendocrine regulation of the skin functioning. Medical Immunology (Russia). 2019;21(5):807-20. (In Russ). doi: 10.15789/15630625-2019-5-807-820
4. Makarevich PI, Efimenko AYu, Tkachuk VA. Biochemical Regulation of Regenerative Processes by Growth Factors and Cytokines: Basic Mechanisms and Relevance for Regenerative Medicine. Biochemistry (Moscow). 2020;85(1):1 1-26. (In Russ). doi: 10.1134/ S0006297920010022
5. Khavinson VKh. Peptide medicines: past, present, future. Clinical Medicine (Russian Journal). 2020;98(3): 165-77. (In Russ). doi: 10.30629/0023-2149-2020-98-3-165-177
6. Pickart L, Margolina A. Regenerative and Protective Actions of the GHK-Cu Peptide in the Light of the New Gene Data. Int J Mol Sci. 2018;19(7):1987. doi: 10.3390/ijms19071987
7. Pickart L, Vasquez-Soltero JM, Margolina A. GHK Peptide as a Natural Modulator of Multiple Cellular Pathways in Skin Regeneration. Biomed Res Int. 2015;2015:648108. doi: 10.1 155/2015/648108
8. Pickart L, Vasquez-Soltero JM, Margolina A. The human tripeptide GHK-Cu in prevention of oxidative stress and degenerative conditions of aging: implications for cognitive health. Oxid Med Cell Longev. 2012;2012:324832. doi: 10.1 155/2012/324832
9. Rakhmetova KK, Mishina ES, Vorvul AO, et al. Regenerative effects of Gly-His-Lys and Gly-His-Lys-D-Ala peptides in infected skin wounds. Bulletin of RSMU. 2022;(2):58-64. (In Russ). doi: 10.24075/ vrgmu.2022.014
10. Rakhmetova KK, Bobyntsev II, Bezhin AI, et al. Effects of GHK peptide and its structure analogues, D-Ala-GHK AND GHK-D-Ala,
on innate immunity and lipid peroxidation processes in skin wound. Humans and Their Health. 2023;26(1):33-44. (In Russ). doi: 10.21626/ vestnik/2023-1/05
11. Risman BV, Zubarev PN. Modern methods for evaluating the process of the wound process. Russian Military Medical Academy Reports. 2020;39(3):74-81. (In Russ). doi: 10.17816/rmmar64988
12. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing [Internet]. Available at: https://www.r-project.org/. Accessed: 2023 May 31.
13. Wang X, Liu B, Xu Q, et al. GHK-Cu-liposomes accelerate scald wound healing in mice by promoting cell proliferation and angiogenesis. Wound Repair Regen. 2017;25(2):270-8. doi: 10.1111/ wrr.12520
14. Gruchlik A, Chodurek E, Dzierzewicz Z. Effect of GLY-HIS-LYS and its copper complex on TGF-(3 secretion in normal human dermal fibroblasts. Acta Pol Pharm. 2014;71(6):954-8.
15. Pickart L, Vasquez-Soltero JM, Margolina A. GHK-Cu may Prevent Oxidative Stress in Skin by Regulating Copper and Modifying Expression of Numerous Antioxidant Genes. Cosmetics. 2015;2(3):236-47. doi: 10.3390/cosmetics2030236
16. Sun L, Li A, Hu Y, et al. Self-Assembled Fluorescent and Antibacterial GHK-Cu Nanoparticles for Wound Healing Applications. Particle & Particle Systems Characterization. 2019;36(4):1800420. doi: 10.1002/ppsc.201800420
17. Iwata Y, Nakade Y, Kitajima S, et al. Protective effect of d-alanine against acute kidney injury. Am J Physiol Renal Physiol. 2022; 322(6):F667-79. doi: 10.1152/ajprenal.00198.2021
18. Shi Y, Hussain Z, Zhao Y. Promising Application of D-Amino Acids toward Clinical Therapy. Int J Mol Sci. 2022;23(18):10794. doi: 10.3390/ ijms231810794
19. Lee CJ, Qiu TA, Sweedler JV. D-Alanine: Distribution, origin, physiological relevance, and implications in disease. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2020;1868(1 1):140482. doi: 10.1016/j. bbapap.2020.140482
ОБ АВТОРАХ
Рахметова Камила Камильджановна;
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5511-5962; eLibrary SPIN: 5852-8840; e-mail: [email protected]
Бобынцев Игорь Иванович, д.м.н., профессор; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7745-2599; eLibrary SPIN: 3947-01 14; е-mail: [email protected]
AUTHORS' INFO
Kamila K. Rakhmetova;
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-551 1-5962; eLibrary SPIN: 5852-8840; e-mail: [email protected]
Igor' I. Bobyntsev, MD, Dr. Sci. (Med.), Professor; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7745-2599; eLibrary SPIN: 3947-0114; е-mail: [email protected]
Жиляева Людмила Владимировна, к.м.н.;
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0390-4155;
eLibrary SPIN: 1726-81 19; e-mail: [email protected]
Бежин Александр Иванович, д.м.н. профессор; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3776-9449; eLibrary SPIN: 1250-5549; е-mail: [email protected]
* Ворвуль Антон Олегович, к.м.н.;
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1529-6014;
eLibrary SPIN: 8398-9376; e-mail: [email protected]
Lyudmila V. Zhilyayeva, MD, Cand. Sci. (Med.); ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0390-4155; eLibrary SPIN: 1726-8119; e-mail: [email protected]
Aleksandr I. Bezhin, MD, Dr. Sci. (Med.), Professor; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3776-9449; eLibrary SPIN: 1250-5549; е-mail: [email protected]
* Anton O. Vorvul', MD, Cand. Sci. (Med.);
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1529-6014;
eLibrary SPIN: 8398-9376; e-mail: [email protected]
* Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
