Динамика высвобождения хуманина и потребления аминокислот дифференцирующимися С2С12 миобластами Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

DOI: 10.23868/201808024

динамика высвобождения хуманина и потребления Аминокислот дифференцирующимися с2с12 миобластами

А.А. Жлоба1, Т.Ф. Субботина1, Н.А. Смолина2, А.А. Костарева2

1 Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия

2 Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова, Санкт-Петербург, Россия

dynamics of HUMANIN release AND consumption of AMiNo AciDs BY DiFFERENTiATiNG c2c12 MYoblasts

A.A. Zhloba1, T.F. Subbotina1, N.A. Smolina2, A.A. Kostareva2

11.P. Pavlov First Saint Petersburg State Medical University, Saint-Petersburg, Russia 2 V.A. Almazov National Medical Research Centre, Saint-Petersburg, Russia

e-mail: [email protected]

В дифференцирующейся культуре миобластов образование миофибрилл сопровождается потреблением аминокислот и высвобождением их производных в среду. Усиление ми-тохондриального метаболизма предшествует образованию миофибрилл. Целью работы являлась оценка высвобождения в культуральную среду хуманиноподобного пептида (ХНПП, mt-RNR-пептид) и производных аминокислот при дифференциров-ке С2С12 миобластов.

Клетки линии С2С12 культивировали по стандартной методике в планшетах, контролируя образование миофибрилл и отбирая для анализа пробы культуральной среды на 0 (индукция), 2, 4, 7, 9 и 11 сут. дифференцировки. Уровень ХНПП определяли иммуноферментным методом, аминокислот и их метаболитов — жидкостной хроматографией.

Из незаменимых аминокислот интенсивнее всех потребляются аминокислоты с разветвленной цепью — Вал, Лей, Иле вплоть до 7 сут. дифференцировки. Отмечается взаимная корреляция суточной продукции производных заменимой аминокислоты аргинина — гомоаргинина (гАрг) и орнитина (r=0,53; p=0,008) с максимумом на 2 сут., значительным снижением секреции гАрг на 4 сут. и следовой секрецией после 7 сут. диффе-ренцировки. Высвобождение в среду ХНПП, в отличие от гАрг, продолжается до 4 сут.

Начало дифференцировки клеточной культуры более четко прослеживалось не по уровню потребления незаменимых аминокислот, присутствующих в культуральной среде в высоких концентрациях, а по образованию аминокислот-продуктов специализированных метаболических путей, к числу которых относятся гАрг и орнитин. Метаболическая активность митохондрий подтверждается секрецией ХНПП. Секреция ХНПП дифференцирующимися миобластами является ранним маркером становления митохондриального метаболизма. Ее понижение к 7 сут. происходит на фоне деградации уже дифференцированных ми-оцитов. Специфическая функциональная активность миоцитов зависит от метаболической активности митохондрий, которую можно оценивать по уровню секретируемого ХНПП.

ключевые слова: хуманин, миобласты, дифференцировка, аминокислоты, гомоаргинин, митохондрии, хуманиноподобный пептид, mt-RNR-пептиды.

введение

В культурах миобластов, как и в культурах большинства других эукариотических клеток, развитию сарко-меров предшествует формирование митохондриона, обеспечивающего достаточный уровень АТФ для поддержания жизнеспособности и функциональной активности клеток. [1, 2]. Оценка динамики потребления и выделения метаболитов культурой клеток может использоваться в технологиях по производству рекомбинантных белков, при подготовке клеток к трансплантации, при разработке протоколов культивирования и дифференцировки и при создании новых питательных сред [3, 4]. В изучении метаболизма на культурах клеток безусловное преимущество имеют методы, не нарушающие нативность культуры,

In the differentiating culture of myoblasts, the formation of myofibrils is accompanied by the consumption of amino acids and the release of their derivatives into the medium. The enhancement of mitochondrial metabolism precedes the formation of myofibrils. In this work, the release of a humanin-like peptide (HNLP, mt-RNR-peptide) and amino acid derivatives into the medium was studied in the differentiation of C2C12 myoblasts.

Cells of the C2C12 line were cultured using standard techniques in plates with control of myofibril formation and samples selection for analysis at 0 (induction), 2, 4, 7, 9 and 11 days of differentiation. HNLP was determined by enzyme immunoassay, and amino acids and their metabolites by liquid chromatography.

From the essential amino acids, branched chain — Val, Leu, Ile were most intensively consumed up to day 7 of differentiation. There was observed a mutual correlation between the daily production of arginine derivatives — homoarginine (hArg) and ornithine (r = 0.53, p = 0.008) with a maximum on day 2, a significant decrease of hArg production on day 4 and trace secretion after day 7. The release of HNLP, unlike hArg, lasts up to 4 days.

Secretion of HNLP in course differentiating myoblasts is an early marker of the mitochondrial metabolism development. Its decrease by day 7 is associated to inhibition of the further existence of already differentiated myocytes. The early stage of cell culture differentiation is more clearly checked not by the level of essential amino acids intake, which presented in the cultivation medium at high concentrations, but by the formation of amino acid products of specialized metabolic pathways, including hArg and ornithine. The metabolic activity of mitochondria is confirmed by the secretion of HNLP. The specific functional activity of myocytes depends on the metabolic activity of the mitochondria, which can be checked without violating the integrity of the culture, according to the level of secreted HNLP.

Keywords: humanin, myoblasts, differentiation, amino acids, homoarginine, mitochondria, humanin-like peptide, MT-RNR-peptides.

например, анализ состава культуральных сред на различных этапах роста и дифференцировки клеток [3-5]. Однако определение потребления аминокислот in vitro растущими и дифференцирующимися клетками характеризует их утилизацию из культуральной среды, но не становление митохондриального метаболизма в культуре эукариотических клеток, в том числе миобластов. Кроме того, аминокислотный состав питательных сред всегда предусматривает большие избытки незаменимых и условно заменимых аминокислот, поэтому их потребление клетками может составлять лишь несколько процентов от общего количества, а значит, точная оценка потребления весьма затруднительна. В связи с этим более обоснованным является определение в культуральных

средах метаболических маркеров, которые отсутствуют в формуляре среды, но продуцируются клетками. Таким маркером может предположительно выступать пептид хуманин (ХН), синтезирующийся в ходе генерации митохондрий и в основном на матрице митохондриальной ДНК [6]. В организме образование ХН прямо коррелирует с увеличением числа митохондрий [7]. Пептид ХН описан как митохондриальный фактор mt-RNR, регулирующий окислительное фосфорилирование и, тем самым, продукцию АТФ [8]. В литературе есть данные о том, что хуманиновая митохондриальная ДНК переносится в ядерный геном, и существуют различные ядерные ДНК-последовательности митохондриального происхождения — явление, известное как NUMT (nuclear mitochondrial DNA) [6]. Таким образом, в ядерном геноме имеются вырожденные ХН-подобные открытые рамки считывания — последовательности нуклеотидов в составе ДНК, способные кодировать этот пептид. В итоге в организме и, соответственно, в крови обнаруживаются аналоги ХН с биологической активностью [9]. Известно, что ХН у человека интенсивно образуется не только в тканях печени и почек, но и в других богатых митохондриями тканях, включая сердечную мышцу и поперечнополосатую мышечную ткань, а также клетки нервной системы [10].

Для изучения продукции ХН в качестве экспериментальной модели мы использовали мышиные миобласты С2С12, т. к., во-первых, на них получают хорошо воспроизводимые результаты при исследовании развития мышечной ткани in vitro [11], и, во-вторых, к настоящему времени помимо человеческого доказано существование мышиного аналога хуманина — хуманиноподобного пептида (ХНПП, mt-RNR) [12, 13].

Цель работы: изучение высвобождения в культураль-ную среду хуманиноподобного пептида (ХНПП, mt-RNR-пептид) и производных аминокислот при дифферен-цировке С2С12 миобластов. Задачами исследования являлось определение: 1) стадии дифференцировки ми-областов, на которой начинает синтезироваться ХНПП; 2) динамики его образования в сопоставлении с потреблением аминокислот и образованием их производных в ходе дифференцировки в интактной культуре клеток; 3) роли ХНПП в качестве маркера, позволяющего проследить начало и наивысшую активность клеток по образованию митохондрий.

Материал и методы

Культивирование клеток линии С2С12

Клетки линии С2С12 (мышиные миобласты) были любезно предоставлены нашими коллегами из Каролинского Института (Prof. Thomas Sejersen, Group of myopathy research, Karolinska Institutet, Stockholm, Швеция). Клетки высевали в лунки 6-луноч-ного планшета (2х105 клеток на лунку в 2 мл среды) и культивировали в ростовой среде DMEM, содержащей 10 % инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FCS), 1 % L-глутамина и 1 % пенициллина/стрептомицина (все реагенты Invitrogen, США) в С02-инкубаторе (37 °С, 5 % CO2, 99 % влажность) в течение 72 ч. К окончанию инкубации степень слияния клеток достигала 80 % при хорошей адгезии.

Миогенная дифференцировка

Миогенную дифференцировку клеток проводили по методике, описанной в работе P. Keire и соавт. (2013) [14]. После 72 ч. инкубации клеток в ростовой среде ее отсасывали и брали для анализа. Клетки промывали подогретым фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и заливали 2 мл дифференцировочной

среды, состоящей из питательной среды DMEM, содержащей 2 % лошадиной сыворотки (horse serum, HS) (Gibco, США), 1 % L-глутамина и 1 % пенициллина/ стрептомицина. Забор для анализа дифференциро-вочной среды и полную ее смену после промывания PBS производили через каждые 48 ч. (один раз через 72 ч.). Таким образом, были получены образцы культу-ральной среды на 0 (индукция), 2, 4, 7, 9 и 11 сут. диф-ференцировки, состав которых сравнивали с составом соответствующих исходных сред — ростовой (0 сут.), либо дифференцировочной (остальные сут.). Образцы сред сразу замораживали и хранили до анализа при -80 °С. Контроль миогенной дифференцировки клеток проводили с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания тяжелых цепей миозина. Дизайн эксперимента представлен на рис. 1А.

Количественное определение аминокислот

Спектр из 22 аминокислот, 15 из которых являются компонентами среды DMEM, а 7 других (аланин, гомоаргинин (гАрг), цитруллин, орнитин, аспартат, глу-тамат, аспарагин) образуются в ходе метаболизма клеток, количественно определяли в культуральной среде методом обращенно-фазного ВЭЖХ-анализа на хроматографе Agilent 1100 (Agilent Technologies, США) по разработанной нами технологии, подробно описанной в патенте [15]. Были использованы колонка Zorbax Eclipse AAA C18 (150x4,6 мм, диаметр зерен 3,5 мкм) и ортофталевый альдегид (Agilent Technologies, США) для предколоночной дериватизации. Концентрации аминокислот рассчитывали, используя норвалин в качестве внутреннего стандарта.

Иммунофлюоресцентный анализ

Для проведения иммуноцитохимического исследования клетки фиксировали 4 % параформальдегидом при +4 °С в течение 10 мин., затем в течение 5 мин. инкубировали с 0,2 % раствором Тритона Х-100 для повышения проницаемости мембран, а далее блокировали неспецифическое связывание путем 30-мин. инкубации в 15 % растворе FCS в PBS. Инкубацию с монокло-нальными первичными антителами к тяжелым цепям миозина MAB4470 (R&D, США) проводили в течение 1 ч. при комнатной температуре, после чего в течение 45 мин. инкубировали с вторичными антителами, конъ-югированными с флюоресцентным красителем Alexa Fluor 546 (Molecular probes, США). Ядра окрашивали 4',6-диамидино-2'-фенилиндолом (DAPI; Molecular probes, США). Промежуточную отмывку клеток между этапами окраски осуществляли PBS.

Определение мышиного ХНПП

Уровень мышиного ХНПП в культуральной среде определяли с помощью коммерческих наборов реактивов для иммуноферментного анализа производства CLOUD-CLONE CORP, США, поставщик НПО «Иммунотэкс», Ь|йр://белкиантитела.рф/, Россия. Производство наборов, поставляемых НПО «Иммунотэкс», сертифицировано по ISO-13485 и IS0-9001. Все использованные нами наборы были поставлены в теплоизолирующих контейнерах с хладоагентами, сохранившими требуемое охлаждение вплоть до вскрытия контейнеров в лаборатории.

Статистический анализ

Высвобождение (+) аминокислот в культуральную среду или их потребление (-) из среды рассчитывали по формуле:

(Собр-Сср)*2Л,

А

Посев клеток-

V 2 мл ) \

1_

Б

±

-3 -2 -1

Фаза роста

Индукция дифференцировки

2 мл

2 мл

2 мл

2 мл

ДС 2 мл

Дни

дифференцировки

10

11

Образец

V о у

Образец

V 2 у

Образец

4

Образец

^ 7 у

Образец

9

Образец

V 11 У

Рис. 1. Дизайн эксперимента (А) и миотубы в С2С12 клетках через 72 ч. (слева) и 7 сут. (справа) дифференцировки (Б). РС — ростовая среда, ДС — дифференцировочная среда. Иммунофлуоресцентная реакция с антителами к тяжелым цепям миозина, доокраска ядер — йДР!. Масштабный отрезок — 25 мкм.

где Собр — концентрация аминокислоты в опытном образце (нмоль/мл), Сср — концентрация аминокислоты в соответствующей исходной среде (нмоль/мл), t — время инкубации (сут.), 2 — объем среды (мл). Скорость продукции/потребления аминокислот выражали в нмоль/ сут. на 2х105 первично посеянных клеток. Данные представлены как среднее значение ± ошибка среднего значения из двух независимых экспериментов, каждый с тремя параллельными (п=6). Соответствие данных нормальному распределению проверяли с помощью теста Шапиро-Уилка. Достоверность различий оценивали с помощью ^критерия, поскольку все данные имели нормальное распределение. Статистически значимыми считали различия при р<0,05. Статистический анализ проводили с использованием пакета программ Statistica 10.

Результаты

Культуральные среды на основе ОМБМ, согласно формуляру, содержат избыточные количества всех незаменимых и нескольких заменимых (глутамин, серин, глицин, тирозин, цистеин) аминокислот. Тем не менее, аминокислотные составы ростовой и дифференциро-вочной сред несколько различаются (табл.), прежде всего, за счет различного количества сывороточных добавок и их источника (10 % FСS в ростовой среде и 2 % Ш в дифференцировочной). Заменимые аминокислоты, за исключением перечисленных выше, содержатся в средах в небольших количествах, производные аргинина — цитруллин, гомоаргинин (гАрг) и орнитин, — обнаруживаются в ростовой среде в минимальных количествах, а в дифференцировочной среде не выявляются.

Таблица. Возрастание концентраций аминокислот (АК) в среде (+) или потребление из среды (-) в сравнении с концентрациями АК в исходных средах. Показатель на сроке 0 сут. (индукция дифференцировки) сравнивали с составом ростовой среды (РС), а данные остальных сроков наблюдения — с составом дифференцировочной среды (ДС).

Концентрации АК (^М)

Сдвиг концентраций АК (^М), М(т)

АК

РС

ДС

Суток дифференцировки

0

2

4

7

9

11

Ала 116 (4)

8 (2)

217 (51)

Р4Яи<0,008

Арг 412 (12) 406 (17)

Глн 3753 (82)

504 (42) р9=0,01

-12 (28)

411 (59) 4,9,11— Р9=0,001 29 (68) -63 (25) Ра„>0,05 Рц<0,05

4011 (101) -713 (293) -2334 (70) -2449 (91) -2642 (195) -1400 (406) -1729 (152)

390 (80) р9=0,037

-35 (47)

820 (114) 560 (28)

53 (61)

33 (27)

р247<0,001 р911<0,01 р911<0,003 р11<0,02

Гли 453 (17) 395 (15)

2,4,7

93 (114)

ра„>0,05

9,11

175 (73)

9,11

153 (51) р9=0,037

11

105 (48)

408 (100) 247 (39)

Концентрации АК (^М)

Сдвиг концентраций АК (^М), М(т)

АК

РС

ДС

Суток дифференцировки

4

7

11

Иле 640 (21) 668 (27) 138 (103) ра,4<0,01 -133 (29) Раи<0,02 -106 (23) р9,11<0,03 -149 (85) 134 (117) 9 (37)

Лей 900 (25) 770 (30) 79 (150) ра||>0,05 -99 (28) р911<0,007 -53 (46) р9,11<0,04 -74 (88) 296 (150) 140 (57)

Лиз 800 (31) 829 (40) 301 (172) р2<0,03 -39 (40) Раи<0,02 -11 (67) р9=0,03 -87 (103) 343 (140) 170 (64)

Сер 483 (23) 436 (17) 22 (76) р2,4<0,02 -170 (20) р9,11<0,004 -167 (23) р9,11<0,007 -168 (33) р9,11<0,04 43 (59) -20 (28)

Вал 721 (21) 777 (20) 236 (124) р2,4<0,02 -102 (34) р9,11<0,007 -39 (30) р9,11<0,02 -108 (122) 347 (168) 143 (47)

0

2

9

Результаты, представленные в таблице, показывают, что из незаменимых аминокислот интенсивнее всех потребляются аминокислоты с разветвленной цепью — Вал, Лей, Иле вплоть до 7 сут. дифференцировки, а далее наблюдается их высвобождение в среду. На 9 сут. дифференцировки концентрации незаменимых аминокислот превышают их содержание в исходной диффе-ренцировочной среде приблизительно в 1,3 раза (табл.). Динамика изменения их уровня в процессе дифференцировки однотипна. Использование этих аминокислот в биосинтетических процессах подтверждается морфологическими данными: образование значительных количеств миозина отмечается через 72 ч. после индукции дифференцировки, а к 7 сут. он принимает более упорядоченный характер в составе миофибрилл (рис. 1Б).

Динамика изменения уровня заменимых аминокислот, которые участвуют в энергетическом метаболизме, в ходе миогенной дифференцировки С2С12 миобластов выглядит иначе. Высокая исходная концентрация глута-мина (Глн, 4000 рМ) падает примерно в 2 раза после каждой смены среды, включая 9 и 11 сут. дифференци-ровки (табл.). Аланин же, присутствующий в дифферен-цировочной среде в минимальных количествах, постоянно высвобождается в среду в высоких концентрациях на протяжении всего эксперимента.

Динамика изменения содержания в среде производных аргинина (гАрг и орнитина) в течение первых двух сут. диф-ференцировки имеет сходный характер, их максимальное количество зафиксировано на вторые сут. (рис. 2). Следует отметить, что динамика изменений уровня гАрг в среде выявляется с большей достоверностью, чем орнитина или любых исходных аминокислот в составе питательных сред (табл.). На четвертые сут. дифференцировки количество гАрг в среде значительно снижается по сравнению с его содержанием на вторые сут. дифференцировки и далее его накопление поддерживается на очень низком уровне. Отмечается взаимная корреляция суточной продукции гАрг и орнитина (г=0,53; р=0,008).

Обращает на себя внимание необычно высокий уровень высвобождения большинства аминокислот (за исключением Глн) на 9-11 сут. эксперимента, что указывает на протеолиз белков и деградацию культуры. Таким образом, по данным изучения динамики уровней аминокислот миогенная дифференцировка в условиях использования культуральной среды ОМБМ продолжается до 7 сут., а затем наблюдаются признаки деградации миоцитов.

Динамика высвобождения ХНПП в культуральные среды быстро нарастая, в отличие от гАрг, продолжается до 4 сут., достоверно не отличаясь от его высвобождения

на вторые сут. (рис. 2) Уровень секреции этого пептида до индукции дифференцировки (0 сут.) составляет 84±21 пг/ сут. на 2*105 высаженных клеток, повышается ко вторым сут. после индукции дифференцировки почти в 3 раза (244±27 пг/сут., р=0,0082) и сохраняется до 4 сут. эксперимента. Начиная с 7 сут. наблюдается достоверное снижение его выделения в среду (ниже 50 пг/сут), что свидетельствует о торможении образования и функционирования митохондрий в период между 4 и 7 сут. эксперимента.

обсуждение

Мониторинг дифференцировки клеточных культур требует информативных маркеров состояния метаболизма клеток. Предложены различные методы контроля, предусматривающие определение убыли компонентов сред, в том числе аминокислот [4, 5]. Наибольшее значение в мониторинге дифференцировки клеточных культур отводится динамике потребления глутамина и высвобождения отсутствующего в исходной среде аланина [5]. Высвобождение в среду аланина, начиная с 2 сут. диф-ференцировки, остается стабильно высоким, благодаря его образованию в ходе реакций трансаминирования из пировиноградной кислоты, которая присутствует в среде в высокой концентрации (1000 рМ).

Потребление незаменимых аминокислот по полученным нами данным, регистрируемое вплоть до 7 сут. диф-ференцировки, закономерно объясняется их участием в синтезе специфических мышечных белков, например, миозина. Пик их потребления приходится на 2 сут. дифференцировки, что соответствует максимальному количеству миозина по данным иммуноцитохимии (рис. 1Б). Однако использовать оценку уровня потребления незаменимых аминокислот (например, с разветвленной цепью) для мониторинга дифференцировки клеточных культур неудобно, поскольку существует значительная вариабельность данных, связанная с большими количествами этих аминокислот в формуляре среды [5]. Высвобождение в среду больших количеств как заменимых, так и незаменимых аминокислот (за исключением Глн), отмеченное нами на 9-11 сут. дифференцировки, может быть расценено как признак активации апоптоза, что является характерным для высоко-дифференцированных С2С12 миобластов [16].

Динамика потребления аргинина, которая относится к замениным аминокислотам у мышей, на модели миогенной дифференцировки С2С12 миобластов сходна с динамикой потребления незаменимых аминокислот с разветвленной цепью (табл.).

В ходе экспериментов показано, что высвобождение производных аргинина в культуральную среду может

300

250

& 200

\

т 1150

й Ю0 т

50 -

0 ]

1

30

25

20 £

со

I

15

10

I

о ее

О

т

2,5

о \ .0

о

1,5 ^

<

О

т

- 0,5

0 1 2 3 4 5 6 7

Время после индукции дифференцировки, сутки □ ХНПП □ Орн □ гАрг

Рис. 2. Скорость высвобождения гомоаргинина (гАрг), орнитина (Орн) и ХНПП в среду в процессе дифференцировки С2С12 миобластов. *различия статистически значимы по сравнению с показателями на сроке 0 сут.; #различия статистически значимы по сравнению с показателями на сроке 2 сут.

быть определено с большей достоверностью, чем потребление исходных аминокислот из среды, в том числе глутамина. Из образующихся производных аргинина наиболее достоверные сдвиги обнаружены в отношении гАрг по сравнению с орнитином и цитруллином. При этом значительно более высокую достоверность прироста гАрг можно, вероятно, объяснить тем, что его участие в метаболизме клеток весьма невелико, в отличие от орнитина или цитруллина [17]. Обнаруженная корреляция между уровнями гАрг и орнитина, но не цитруллина, возможно, объясняется тем, что гАрг и орнитин могут образовываться в одной и той же реакции, катализируемой ферментом аргинин:глицинамидинотрансферазой (АГАТ, КФ 2.1.4.1), который необходим для биосинтеза креатина. Максимум продукции гАрг на 2 сут. дифференцировки соответствует по времени синтезу максимального количества миозина (рис. 1Б и 2). В дальнейшем, с 7 по 11 сут., синтез гАрг резко замедляется в связи с гибелью клеток. Таким образом, образование гАрг, происходящее на ранних стадиях дифференцировки, является информативным маркером этого процесса, а динамика изменения уровня гАрг позволяет проследить процесс дифференцировки в культуре клеток, не затрагивая клеточный материал. Образование гАрг и его накопление в культуральной среде в процессе миогенной дифференцировки миобластов вплоть до 4 сут. дифференцировки, предположительно в результате экспрессии гена Gatm и синтеза фермента АГАТ, начинается в ранний период после индукции дифференцировки и предшествует образованию миофибрилл. Имеются данные о том, что синтез АГАТ может происходить в эмбриональной мышечной ткани [18, 19], но не в высокодиф-ференцированных миоцитах. В связи с этим уже к 4 сут. в нашем эксперименте наблюдается снижение высвобождения гАрг в культуральную среду. Важно отметить, что уровень ХНПП существенно понижается значительно позднее начала образования миофибрилл, то есть после

образования миоцитов. Как известно, снижение функциональной активности митохондриона клеток сопровождается снижением секреции этого пептида [20, 21], что ведет к снижению митохондриального аэробного пути пополнения энергоресурсов клетки. В настоящем исследовании показано, что к 7 сут. развития культуры миобластов наблюдается примерно двукратное снижение суточного накопления ХНПП в культуральной среде (рис. 2).

На основании полученных данных можно сделать следующие выводы:

1) появление в среде ХНПП со вторых сут. диффе-ренцировки является ранним маркером метаболической активности дифференцирующихся миобластов;

2) понижение уровня ХНПП в среде к 7 сут. происходит на фоне деградации уже дифференцированных миоцитов. Мы считаем целесообразным проводить оценку начала дифференцировки в клеточной культуре не по уровню потребления незаменимых аминокислот, присутствующих в культуральной среде в высоких концентрациях, а по образованию аминокислот-продуктов специализированных метаболических путей, к числу которых относятся гАрг и орнитин;

3) после завершения дифференцировки специфическая функциональная активность миоцитов зависит, прежде всего, от состояния метаболизма митохондрий, что представляется возможным оценивать по уровню выделяемого в среду ХНПП.

Благодарности

Авторы выражают благодарность менеджменту ПСПбГМУ им. И.П. Павлова. Исследование выполнено в рамках выполнения государственного задания и при поддержке гранта РНФ 14-15-745П.

Конфликт интересов

Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Lewis M.R., Lewis W.H. Mitochondria in tissue culture. Science. New Series 1914; 39(1000): 330-3.

2. Fujioka H., Tandler B., Consolo M.C. et al. Division of mitochondria in cultured human fibroblasts. Microscopy research and technique 2013; 76: 1213-6.

3. Carrillo-Cocom L.M., Genel-Rey T., Araiz-Hernandez D. et al. Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody. Cytotechnology 2015; 67(5): 809-20.

4. Salazar A., Keusgen M., von Hagen J. Amino acids in the cultivation of mammalian cells. Amino Acids 2016; 48: 1161-71.

5. Hong P., Wheat T.E., Mazzeo J.R. et al. Monitoring cell culture media with the Waters amino acid analysis solution. Waters Applications Notebook; 2007, http://www.waters.com/webassets/cms/library/docs/720002381en.pdf.

6. Lee C., Yen K., Cohen P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-de-rived peptides? Trends Endocrinol. Metab. 2013; 24(5): 222-8.

7. Luciano F., Zhai D., Zhu X. et al. Cytoprotective peptide humanin binds and inhibits proapoptotic bcl-2/bax family protein bimEL. J. Biol. Chem. 2005; 280: 15825-35.

8. Remor A.P., de Matos F.J., Ghisoni K. et al. Differential effects of insulin on peripheral diabetes-related changes in mitochondrial bioenergetics: involvement of advanced glycosylated end products. Biochim. Biophys. Acta. 2011; 1812(11): 1460-71.

9. Bodzioch M., Lapicka-Bodzioch K., Zapala B. et al. Evidence for potential functionality of nuclearly-encoded humanin isoforms. Genomics 2009; 94(4): 247-56.

10. Биоинформационная база данных Uniprot [Электронный ресурс]. Available at: http://www.uniprot.org/uniprot/Q8IVG9 (accessed 23 may 2018).

11. Yaffe D., Saxel O. A myogenic cell line with altered serum requirements for differentiation a myogenic cell line with altered serum requirements for differentiation. Differentiation 1977; 7(3): 159-66.

12. Niikura T., Sidahmed E., Hirata-Fukae C. et al. A humanin derivative reduces amyloid beta accumulation and ameliorates memory deficit in triple transgenic mice. PLoS ONE. 2011; 6(1): e16259.

13. Oh Y.K., Bachar A.R., Zacharias D.G. et al. Humanin preserves endothelial function and prevents atherosclerotic plaque progression in hy-percholesterolemic ApoE deficient mice. Atherosclerosis 2011; 219(1): 65-73.

14. Keire P., Shearer A., Shefer G. et al. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Meth. Mol. Biol. 2013; 946: 431-68.

15. Жлоба А.А., Субботина Т.Ф., Шипаева К.А. Способ определения содержания гомоаргинина в плазме крови и других биологических жидкостях человека. Патент РФ на изобр. № 2609873. 06 февраля 2017.

16. Burattini S., Ferri P., Battistelli M. et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. Eur. J. Histochem. 2004; 48(3): 223-33.

17. Hou Y., Hu S., Jia S. et al. Whole-body synthesis of L-homoarginine in pigs and rats supplemented with L-arginine. Amino Acids 2016; 48: 993-1001.

18. Braissant O., Henry H., Villard A.M. et al. Creatine synthesis and transport during rat embryogenesis: spatiotemporal expression of AGAT, GAMT and CT1. BMC developmental biology. 2005; 5: 9.

19. Sandell L.L., Guan X.J., Ingram R., Tilghman S.M. Gatm, a creatine synthesis enzyme, is imprinted in mouse placenta. PNAS USA 2003; 100(8): 4622-7.

20. Nashine S., Cohen P., Chwa M. et al. Humanin G (HNG) protects age-related macular degeneration (AMD) transmitochondrial ARPE-19 cybrids from mitochondrial and cellular damage. Cell Death Dis. 2017; 8(7): e2951.

21. Herst P.M., Rowe M.R., Carson G.M. et al. Functional mitochondria in health and disease. Front. Endocrinol. 2017; 8: 296.

Поступила: 10.04.2018