CC BY
19
УДК (б11.341+616.71-003.93):616.381-002-092.9-085
Д. В. ВОЛКОВ, А. А. СТАДНИКОВ, В. С. ТАРАСЕНКО, Е. В. МАЛИЦКАЯ
ДИНАМИКА РЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНЕЙ ТОНКОЙ КИШКИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПЕРИТОНИТЕ НА ФОНЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ ТЕРАПИИ
ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России
D. V. VOLKOV, A. A. STADNIKOV, V. S. TARASENKO, E. V. MALICKAYA
DYNAMICS OF REGENERATION OFTISSUE OF SMALL INTESTINE IN EXPERIMENTAL PERITONITIS ON THE BACKGROUND OF ANTIOXIDANT THERAPY
FSBEI HE «Orenburg State Medical University» of the Ministry of Health of Russia
РЕЗЮМЕ
В статье приведены результаты исследования динамики регенерации тканей тонкой кишки в условиях экспериментального калового перитонита у морских свинок на фоне различных схем лечения с применением анти-оксидантных препаратов. Выявлены нарушения микроциркуляции в тканях кишечника в ранние сроки заболевания, дистрофические и некробиотические поражения энтероцитов. Установлено, что применениерекомбинантной супероксиддисмутазы и высоких доз аскорбиновой кислоты, особенно их комбинации, в лечении синдрома энтеральной недостаточности у экспериментальных животных способствует более быстрому устранению глубоких нарушений микроциркуляции и дистрофически-дегенеративных изменений в стенках сосудов, уменьшению зоны повреждения эпителия ворсинок и крипт на фоне восстановительных регенераторных процессов, что сопровождается снижением уровня летальности животных.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ПЕРИТОНИТ, СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ, ЭНТЕРАЛЬНАЯ НЕДОСТАТОЧНОСТЬ, СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗА, АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА.
SUMMARY
The article presents the results of a study of the dynamics of tissue regeneration of the small intestine in experimental fecal peritonitis using various treatment
regimens with the appointment of antioxidant drugs. Microcirculation disorders in the intestinal tissues in the early stages of the disease, dystrophic and necro-biotic enterocyte lesions were revealed. It has been established that the use of recombinant superoxide dismutase and high doses of ascorbic acid, and especially their combination, in the treatment of enteral insufficiency in experimental animals promotes more rapid elimination of deep microcirculation disorders and of dystrophic-degenerative changes in the walls of blood vessels. Also we observed decrease of area injury of epithelial of the villi and crypts during recovery of regenerative processes. This is accompanied by a decrease of level of mortality of animals.
KEY WORDS: PERITONITIS, FREE-RADICAL OXIDATION, ENTERAL INSUFFICIENCY, SUPEROXIDE DISMUTASE, ASCORBIC ACID.
Несмотря на достижения современной медицины, лечение распространенных форм вторичного перитонита остается актуальной проблемой абдоминальной хирургии. Летальность при перитоните, по данным отечественных и зарубежных авторов, составляет от 6 до 42% [3, 9]. Прогрессирование перитонита сопровождается развитием синдрома энтеральной недостаточности, одной из причин которой является усиление свободнорадикальных процессов в условиях гипоксии тканей [2], что обуславливает необходимость применения препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами, в лечении данной патологии [5].
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - изучение влияния антиоксидантных препаратов при экспериментальном каловом перитоните на процессы регенерации тканей тонкой кишки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные исследования выполнены на 150 половозрелых морских свинках-самцах массой 550-700 г в 5 сериях опытов. Моделирование экспериментального калового перитонита осуществлялось по методике Т. С. Поповой [6]. Экспериментальные животные были разделены на пять групп по 30 особей. В первую группу вошли 30 морских свинок с экспериментальным каловым перитонитом без какого-либо лечения. Во вторую группу вошли 30 животных с экспериментальным каловым перитонитом, которым через два часа после завершения лапаротомии и далее ежедневно внутривенно вводили 0,9% раствор хлорида натрия в расчете 6 мл/кг. Третью группу составили 30 животных, которым внутривенно аналогичным способом вводили препарат Рексод®, содержащий рекомбинантную суперок-сиддисмутазу (РСОД), через 2 часа от начала эксперимента и затем ежедневно в разовой дозе 0,2 мг/кг. Четвертую группу составили 30 животных, которым по указанной схеме вводили раствор аскорбиновой кислоты в дозе 300 мг/кг. Пятая группа включала 30 животных, которым вводили оба препарата: аскорбиновую кислоту и РСОД по аналогичной методике. Контрольную группу составили пять здоровых морских свинок, чьи морфометрические и морфологические показатели оценивали как нормальные.
Для количественной оценки клинического состояния животных в ходе эксперимента была использована шкала, основанная на методике оценки общего состояния лабораторных животных в условиях хирургического опыта [9], сущность которой заключается в выражении наблюдаемых критериев (двигательная активность, реакция на звуковой раздражитель, реакция на болевой раздражитель, пищевое поведение) в баллах. Животных выводили из опыта по 10 особей из каждой группы через 24, 48 и 72 часа от начала эксперимента под глубоким ингаляционным эфирным наркозом.
При макроскопическом исследовании кишечника производили подсчет количества структурных дефектов слизистой оболочки на протяжении 5 см от илеоцекального перехода с последующим расчетом индекса Паулса [1, 4, 8]. Материал от экспериментальных животных (дистальный участок подвздошной кишки) подвергали однотипной гистологической обработке. Для светооптиче-ских и иммуноцитохимических исследований материал фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, спирт-формоле или жидкости Буэна. Обезвоживание и уплотнение материала производили в этаноле возрастающей крепости и заливали в смесь парафина с воском (1:1). Гистосрезы толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином Майера и эозином.
Для идентификации клеток с признаками апоптоза применяли следующие иммуноцито-химические реакции: на определение экспрессии проапоптотического белка р53 и на выявление интернуклеосомальной фрагментации ДНК. Материал фиксировали, обезвоживали и заливали в парафин. Исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5-6 мкм. Срезы инкубировали с моноклональными антителами к р53 (Daco, Дания) в рабочем разведении 1:50.
С целью определения экспрессии протеина Ki-67 использовали набор иммуноцитохимических реактивов (Intergen, Канада), докрашивание ядер производили 0,5% раствором метиленового зеленого на 0,1 М ацетатном буфере. Подсчитывали процент окрашенных клеток на 1000 клеток в случайно выбранных полях зрения. Для оценки пролиферативной активности тканей изучали показатели митотической активности: производили подсчет клеток, находящихся на разных стадиях фаз митоза в нескольких полях зрения, с последующим расчетом доли клеток, претерпевающих митоз.
Статистическая обработка полученных результатов исследования проводилась с помощью программ Microsoft Excel и Statistica 6.0. Данные представлены в виде среднего значения исследуемых величин (М), средней ошибки (m) для каждого показателя. Результаты исследования были подвергнуты статистической обработке
Таблица 1 - Динамика тяжести клинического состояния экспериментальных животных, М ± т, баллы
Группа 1-е сутки 2-е сутки 3-и сутки
I 2,55 ± 0,15 1,13 ± 0,13 0,63 ± 0,12
II 2,63 ± 0,06 1,44 ± 0,06 0,75 ± 0,25
III 2,69 ± 0,06 2,29 ± 0,091' 2 2,00 ± 0,141' 2
IV 2,66 ± 0,08 2,29 ± 0,081' 2 1,95 ± 0,171' 2
V 2,61 ± 0,08 2,22 ± 0,071' 2 2,06 ± 0,211' 2
1 - р < 0,01 при сравнении с показателями Iгруппы; 2 - р
с использованием ^критерия Стьюдента. Для множественных сравнений с учетом поправки Бонферрони использовался критерий вероятности р < 0,01.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе проведенного исследования было установлено, что через 24 часа эксперимента тяжесть состояния экспериментальных животных по группам практически не различалась. Начиная со вторых суток наблюдения ухудшение состояния животных, получавших РСОД, аскорбиновую кислоту, происходило в значительно меньшей степени, чем в I и II группах (табл. 1).
Выявление патоморфологических элементов в тонкой кишке показало снижение структурных нарушений через 72 часа от начала эксперимента в группах III, IV и V по сравнению с контрольными группами (р < 0,01). Наряду с этим индекс Паулса уже с первых суток эксперимента свидетельствовали о снижении прогрессирования деструктивных процессов в тканевых структурах стенки тонкого отдела кишечника, выявляя тем самым энтеропротекторный эффект терапии, включающей РСОД и аскорбиновую кислоту (рис.). Эта разница становится более выраженной с увеличением сроков наблюдения, достигая максимума через 72 часа от начала эксперимента.
Летальность среди животных была: в I группе через 1 сут. - 50%, через 2 сут. - 80%, через 3 сут. 80%. В группе II соответственно срокам наблюдения погибли от 40 до 80% животных. В III, IV и V группах летальность составила от 10-20% (1-е сутки) до 40-60% (2-3-и сутки). Таким образом, летальность животных в эксперименте постепенно нарастала с увеличением
< 0,01 при сравнении с показателями IIгруппы.
сроков наблюдения во всех сериях, но общая смертность за весь эксперимент в группах животных, получавших антиоксидантную терапию, была в два раза ниже аналогичных показателей групп сравнения.
При анализе гистологических препаратов у животных I и II групп через 48 и 72 часа отмечали выраженную гетероморфность структуры ворсинок тонкой кишки. Местами ворсинки были деформированы. Эпителий, покрывающий ворсинки, был уплощен, значительно инфильтрирован лимфоцитами, имел базофильную цитоплазму и высокое содержание рибонуклеопротеидов. Большинство эпителиальных клеток имело признаки дистрофических изменений (кариопикноз, кариолизис, везикуляция цитоплазмы). Отек тканей сопровождался локальным слущиванием эпителиоцитов.
Собственная пластинка слизистой оболочки была резко отечна и также обильно инфильтрирована лимфоцитами и плазматическими клетками. Среди лимфоцитов встречались клетки с признаками бластной трансформации. Данные клетки давали позитивную реакцию с иммуно-цитохимическим маркером Ю-67, что свидетельствовало об активации гена пролиферации.
В серозной оболочке тонкой кишки отмечалась гиперемия, набухание и отек мезотелия, частичная его десквамация, мелкие кровоизлияния в стро-мальных компонентах. В кровеносных сосудах микроциркуляции нарастали дистрофические и деструктивные изменения эндотелия, субэн-дотелиально наблюдалось скопление фибрина.
Полученные данные свидетельствовали о раннем нарушении микроциркуляции на фоне интенсификации воспаления в стенке тонкого
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
■ V группа ■ IV группа ■ III группа I II группа ■! группа
Рисунок - Динамика количества структурных дефектов слизистой оболочки тонкой кишки экспериментальных животных (индекс Паулса, ед.)
отдела кишечника экспериментальных животных в моделируемых условиях при перитоните, что приводило к усугублению дистрофических и некробиотических поражений эпителиоцитов.
Исследуя фрагменты тонкой кишки экспериментальных животных, у которых с целью лечебной коррекции применяли РСОД и высокие дозы аскорбиновой кислоты, отмечены существенные морфологические отличия в развитии репаратив-ных гистогенезов по сравнению с контрольными сериями, они были наиболее выражены в V группе.
Было установлено, что введение экспериментальным животным РСОД или аскорбиновой кислоты существенно компенсировало нарушенный клеточный и тканевой гомеостаз тонкого отдела кишечника. Так, несмотря на сохраняющийся мозаичный характер деструктивных изменений энтероцитов и собственной пластинки слизистой оболочки, отмечалось уменьшение их выраженности (особенно через 72 часа от начала эксперимента). Уменьшалось образование и размеры субэпителиальных пространств Грюнхагена, которые формировались вследствие отслойки эпителиального пласта от базальной мембраны. Снижалось число ворсин с признаками
десквамации энтероцитов. В соединительной ткани собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы уменьшалась степень дезинтегративных процессов (кровоизлияния, эрозии).
В криптах появлялись митотически делящиеся клетки, которые перемещались по направлению к вершине ворсинок, заменяя десквамированные участки эпителия. Здесь же регистрировались эпителиоциты и соединительнотканные клетки, экспрессирующие синтез протеина К1-67.
Через 72 часа эксперимента морфометриче-ские показатели (субэпителиальные пространства на верхушках ворсин, десквамация эпителия, эрозии ворсин) состояния кишечной стенки свидетельствовали о постепенном возвращении к норме (табл. 2). Отмечалось уменьшение отека в мышечной оболочке и снижение явлений деструкции гладких мышечных клеток. Сосуды венулярного звена не имели признаков агрегации эритроцитов. Их размеры составляли соответственно 32,3 ± 1,1, 32,8 ± 0,9 и 31,2 ± 1,4 мкм для III, IV и V групп. Следует заметить, что данные сосуды у экспериментальных животных, не получавших лечения, имели размеры 34,8 ± 2,1 мкм,
Таблица 2 - Морфометрические показатели структур тонкой кишки экспериментальных животных. Сетка Г. Г. Авантадилова, микроскоп МБИ-15, об. 20, ок. 10, М ± т
Морфометрический показатель (%) 1-е сутки 3-и сутки
Группа экспериментальных животных
I II III IV V I II III IV V
Субэпителиальные пространства на верхушке ворсин 6,5 ± 1,3 6,1 ± 1,6 5,2 ± 1,3 5,7 ± 1,1 4,9 ± 2,1 9,7 ± 1,5 9,9 ± 1,4 5,3 ± 1,6 5,0 ± 1,1 4,3 ± 0,91-2
Десквамация эпителия 20,9 ± 3,6 21,6 ± 4,1 20,9 ± 3,3 20,4 ± 2,2 19,3 ± 2,5 33,2 ± 2,6 29,6 ± 3,2 16,7 ± 26 2 17,6 ± 2,11'2 15,6 ± 3,11' 2
Эрозии ворсин 32,1 ± 2,4 30,7 ± 3,6 28,1 ± 4,1 29,2 ± 3,1 28,7 ± 1,9 41,7 ± 3,4 39,9 ± 3,3 27,6 ± 2,31' 2 26,1 ± 2,71' 2 22,7 ± 3,71' 2
1 - р < 0,01 при сравнении с показателями Iгруппы;2 - р < 0,01 при сравнении с показателями IIгруппы.
а получавших физиологический раствор хлорида натрия - 33,1 ± 1,9 мкм. Также на восстановление проницаемости микроциркуляторного русла указывало значительное уменьшение межуточного отека и периваскулярной клеточной инфильтрации. При этом эпителиальный покров ворсинок был непрерывным.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, применение рекомбинантной супероксиддисмутазы, аскорбиновой кислоты
и особенно их сочетания уменьшает глубокие нарушения микроциркуляции и дистрофически-дегенеративные изменения в стенках сосудов, что сопровождается уменьшением зон повреждения эпителия ворсинок и крипт на фоне восстановительных регенераторных процессов. Это приводит к снижению уровня летальности животных при экспериментальном каловом перитоните и открывает перспективу для дальнейших клинических исследований.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Аберясев, Н. В. Экспериментально-клиническое обоснование энтеропротекторной терапии при различных формах острого панкреатита: автореф. дис. ... канд. мед. наук/Н. В. Аберясев. - Москва, 2007. - 23 с.
2. Козлов, В. К. Сепсис: этиология, иммунопатоге-нез, концепция современной иммунотерапии / В. К. Козлов. - СПб.: Диалект, 2006. - 304 с.
3. Кригер, А. Г. Результаты и перспективы лечения распространенных форм перитонита/А. Г. Кригер, Б. К. Шуркалин, В. А. Горский [и др.] //Хирургия. -2001. - № 8. - С. 8-12.
4. Махакова, Г. Ч. Фармакологическая регуляция свободнорадикальных процессов при язвенной болезни / Г. Ч. Махакова, В. А. Орлов, С. М. Николаев. -Улан-Удэ: Издательство БНЦ СО РАН, 2001. -196 с.
5. Пасечник, И. Н. Абдоминальный сепсис и окислительный стресс / И. Н. Пасечник, Е. И. Скобелев,
B. В. Крылов [и др.] // Хирургия. - 2015. - № 12. -
C. 18-23.
6. Попова, Т. С. Синдром кишечной недостаточности в хирургии / Т. С. Попова, Т. Ш. Тамазашвили, А. Е. Шестопалов. - М.: Медицина, 1991. - 240 с.
7 Фадеев, С. Б. Интегральная количественная оценка общего состояния животных в экспериментальной хирургии / С. Б. Фадеев, Д. В. Волков // Вестник Оренбургского государственного университета. -2013. - № 1 (150). - С. 147-150.
8. Pauls, F. An assaumethod foranti ulcer substances / F. Pauls, A. M. Wick, E. M. Mac. Key [et al.] // Gastroenterology. - 1947. - № 8. - P. 774-782.
9. Stanescu, D. Treatment of acute peritonitis. Results in County Hospital Suceava with 317 cases / D. Stanescu, D. Mihalache, O. Irimescu [et al.] // Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iasi. - 2010. - Vol. 114, № 2. - P. 372-375.
