CC BY
76
УДК 579.66:663.18
А.С. Дерунец *, В.Д. Грошева, А.В. Белодед
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20, корп. 1 * e mail: [email protected]
ДИНАМИКА ПОПУЛЯЦИИ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ КУЛЬТУРЫ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ В УСЛОВИЯХ ИСЧЕРПАНИЯ СУБСТРАТА И ВЫСОКИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ МОЛОЧНОЙ КИЛОТЫ
Исследовались изменения характеристик культуры Lactobacillus casei в процессе периодического культивирования применительно к последующей разработке процесса биосинтеза молочной кислоты в мембранном биореакторе. Установлено, что максимум физиологической и биохимической активности культуры микроорганизмов приходится на 21 -ый час культивирования, тогда как максимальный титр клеток (КОЕ) достигается к 47-му часу, после чего наблюдается медленный лизис культуры на протяжении, как минимум, 270 часов культивирования.
Ключевые слова: молочная кислота; молочнокислые бактерии; бродильная активность.
Во всем мире широкое применение находят синтетические полимеры и пластики, поскольку они обладают при сравнительно низкой себестоимости производства требуемыми прочностными и другими эксплуатационными характеристиками. Однако значительным недостатком пластиков на основе синтетических гидрофобных полимеров является длительное естественное разложение, а также образование токсичных продуктов в ходе их утилизации. В связи с этим, в настоящее время становится актуальной разработка эффективных способов получения высокомолекулярных соединений -основ пластмасс, которые при сохранении прочностных и эксплуатационных характеристик одновременно обладали бы способностью к биоразложению в условиях окружающей среды в течение непродолжительного времени [1]. Биотехнологические методы позволяют в некоторых случаях достичь желаемых результатов [2], в частности применительно к синтезу биоразлагаемых полимеров на основе полилактида, получаемого, в свою очередь, из молочной кислоты. Традиционные методы получения молочной кислоты включают периодическое глубинное культивирование штаммов молочнокислых бактерий и грибов р. Ккггорш [3], однако данный процесс имеет ряд существенных недостатков, главным из которых является длительность процесса и низкая продуктивность. В связи с этим в последнее время значительную роль приобретают методы высокоплотностного мембранного
культивирования, заключающиеся в рецикле биомассы. Данный процесс подразумевает прохождение ферментационной среды через мембранный модуль, причем культуральная жидкость, содержащая молочную кислоту, отводится, а биомасса возвращается обратно в
реактор, что обеспечивает высокую концентрацию клеток и, следовательно, высокую производительность биореактора. Однако проведенные ранее эксперименты показали, что для поддержания высокой продуктивности при длительной эксплуатации мембранного биореактора в данном режиме популяция клеток молочнокислых бактерий не должна находиться в условиях низкой концентрации субстрата в среде [4]. В противном случае бродильная активность биомассы резко снижается и затем не восстанавливается до начального уровня при введении мембранного биореактора в оптимальный режим функционирования, что может быть объяснено либо гибелью части клеток, либо снижением физиологической и биохимической активности культуры
микроорганизмов, либо переходом части культуры в состояние, характеризующееся замедленным метаболизмом. От характера изменения физиологической активности клеток микроорганизмов в таком случае будет зависеть поиск способов повышения стабильности и эффективности процесса получения молочной кислоты в мембранном биореакторе.
В данном эксперименте были изучены динамика популяции и физиологическое состояние культуры молочнокислых бактерий в условиях голодания и избытка продуктов метаболизма, что было смоделировано периодическим культивированием в течение 317 часов. Объектом исследования был выбран вид молочнокислых бактерий Lactobacillus casei, что объясняется несколькими факторами. Во-первых, по литературным данным известно, что данные микроорганизмы осуществляют
гомоферментативное молочнокислое брожение (продуктом которого является преимущественно молочная кислота) [5]. Во-вторых, по результатам
ранее проведенных исследований среди штаммов молочнокислых бактерий, осуществляющих гомоферментативное молочнокислое брожение, Ь. casei обладает наибольшей продуктивностью по молочной кислоте при прочих равных условиях [4]. Cуточная культура Ь. casei обладает следующими морфологическими
характеристиками: клетки по форме небольшие палочки, 1-2 мкм, располагаются в цепочке.
Культивирование проводили при температуре 30 0С в лабораторном ферментере Miшfors, общий объем которого составляет 5 л, при рабочем объеме среды 2 л. Скорость вращения мешалки составляла 150,0 об/мин. В ходе процесса осуществлялась автоматическая подтитровка 25 % раствором аммиака до значений кислотности среды 6,0-6,5. В качестве питательной среды использовали среду следующего состава: глюкоза - 100 г/л дрожжевой экстракт - 10 г/л, К2НРО4 - 2,5 г/л, MgSO4 - 2 г/л, MnSO4 - 0, 02 г/л.
Инокулятом служила суточная культура, выращенная на среде аналогичного состава.
В ходе всего культивирования определялись следующие характеристики: КОЕ, концентрация белка в культуральной жидкости, концентрация глюкозы, концентрация молочной кислоты. Концентрацию глюкозы измеряли методом Бертрана [6], содержание молочной кислоты в культуральной жидкости определяли потенциометрическим титрованием в
изопропаноле 1°%-ным раствором NaOH. О концентрации биомассы судили по оптической плотности, для чего отобранную на определенных этапах суспензию центрифугировали при 9000 об/мин в течение 10 мин, биомассу промывали трис-глициновым буфером и центрифугировали снова. Оптическую плотность измеряли при длине волны 505 нм, ФЭК «Экотест 2020». Титр клеток определяли методом Коха. Концентрацию белка в культуральной жидкости измеряли методом Лоури [7]. Из первоначально отобранной суспензии готовили препарат фиксированных клеток, который микроскопировали при увеличении 1000 с масляной иммерсией. Таким образом следили за изменением морфологии клеток в ходе эксперимента.
Основные результаты эксперимента представлены в таблице 1 и на рисунке 1. Кривая роста и гибели представляет собой типичную для микроорганизмов кривую со следующими параметрами: лаг-фаза - 5 часов, продолжительность логарифмической фазы роста - 4 часа, а время до перехода культуры в стационарное состояние - 47 часов, удельная скорость роста культуры при этом 0,25 ч(-1), в то время как удельная скорость гибели клеток на фазе отмирания составила 0,005 ч(-1).
Максимальный достигаемый при данных условиях культивирования титр клеток составляет 4,4*109 КОЕ/мл и приходится на 47 часов. Снижение концентрации клеток в питательной среде начинает наблюдаться после 47 часов культивирования (табл. 1). Степень конверсии глюкозы в молочную кислоту близка к 100%.
Таблица 1
Результаты периодического культивирования Ь. casei
В целях определения физиологического состояния культуры молочнокислых бактерий проводили анализ бродильной активности биомассы, отобранной на различных фазах роста культуры. При этом для исключения влияния на результаты состава питательной среды, а также метаболитов, образующихся в процессе культивирования, биомассу перед анализом центрифугировали в течение 10 мин при 9000 об/мин, отмывали, разводили в трис-глициновом буфере, который содержал глюкозу и факторы роста и далее анализировали количество потребляемых углеводов в единицу времени. Общее время при этом составляло не более 60 минут, температура - 37оС. Показателем физиологической и биохимической активности культуры микроорганизмов считали удельную активность биомассы, которую рассчитывали, как количество потребленной глюкозы в единицу времени (г) , отнесенную к единице оптической плотности биомассы (О):
А _ (Сгл1 - Сгл0 ) г * О '
Максимальная удельная активность биомассы достигалась на 21 -ом часу культивирования и составляла 1,75 г/л*ч*опт. ед. Далее наблюдалось падение данного показателя и к 52-ому часу культивирования удельная бродильная активность биомассы составляла 0,1 г/л*ч*опт. ед. Концентрация жизнеспособных клеток при этом снижалась всего в 3,4 раз по сравнению с максимальной.
т, ч КОЕ/ OD Сбел Сглю^ Смк А,
мл при ^ г/л , г/л г/лх
X = г/л чх
505 опт.
нм ед
0 7*106 0,22 8,1 99,0 0 0
4,5 3,6*107 0,49 7,95 98,8 0 0
21 4,4*108 3,17 1,35 1,9 98,5 1,75
28 1,8* 109 3,19 1,23 1,0 99,0 1,5
47 4,4*109 3,2 1,1 <0.5 99,0 0,80
52 1,3*109 3,2 1,1 <0.5 99,0 0,1
72 1,5*107 3,18 1,1 <0.5 99,0 0
142,5 2,5*106 3,15 1,1 <0.5 99,0 0
167 8,0*105 2,2 1,0 <0.5 99,0 0
192 6,0*105 1,98 1,0 <0.5 99,0 0
221 1,0*105 1,98 1,0 <0.5 99,0 0
317 1,6*104 1,98 1,0 <0.5 99,0 0
То, что удельная активность биомассы снижается значительно раньше падения титра клеток, свидетельствует об изменении физиологического и биохимического состояния культуры микроорганизмов задолго до начала лизиса. Культура молочнокислых бактерий адаптируется к условиям исчерпания субстратов, что характеризуется определенными
биохимическими и морфологическими изменениями клеток (рис. 2). На рисунке 2а представлена микроскопия препарата суточной культуры молочнокислых бактерий. Морфология клеток на данной стадии является типичной для L.casei. Из следующих рисунков (2б и 2в), демонстрирующих морфологию клеток молочнокислых бактерий на более поздних стадиях процесса, видно, что происходит уменьшение размеров клеток, а при большей
продолжительности процесса, можно
предположить, что отдельные частицы, имеющие форму, нехарактерную для палочек, являются следствием частичного лизиса культуры. Вероятнее всего, аналогичное явление имеет место при ведении процесса в мембранном биореакторе в условиях нехватки субстрата, что характерно для полупериодического или непрерывного режима с низкой скоростью протока. Однако данная гипотеза требует дополнительных исследований. Исходя из этого, можно сделать вывод, что при проведении биосинтеза в мембранном биореакторе важно ориентироваться не только на достижение максимального содержания клеток продуцента, но и на поддержание оптимального физиологического состояния,
характеризующегося максимальной активностью популяции.
-Кривая роста молочнокислых бактерий
Глюкоза
Молочная кислота
Часы
Рис.1. Кривая роста культуры Lactobacillus casei, кривая потребления субстрата и кривая накопления продукта
Рис. 2. Микрофотографии клеток культуры Lactobacillus casei на разных этапах ее развития.
Увеличение 1000, масляная иммерсия А- суточная культура, Б- 143 час культивирования, В- 317 час культивирования
Дерунец Алиса Сергеевна, студентка 4 курса кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Грошева Вероника Дмитриевна, к.т.н., н.с. кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Белодед Андрей Васильевич, к. б.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Литература
1. В. А. Фомин, В. В. Гузеев. Биоразлагаемые полимеры // Химия и жизнь. - 2007. -№ 7 - С. 8 - 11
2. М. Ю. Плетнев. Биополимеры как матерал для экологичной упаковки - в фокусе полилактаты.// SOFW-Journal (Russion version). - 2004. - №1.- С. 64 - 68.
3. R. Datta, Lactic acid: recent advances in products, processes and technologies—a review // Datta R., Henry M. J. Chem. Technol. Biotechnol. - 2006. - №, 81. - Р. 1119-1129
4. А. С. Дерунец, В. Д. Смирнова, А. В. Белодед. Высокоплотностное непрерывное культивирование молочнокислых бактерий в мембранном биореакторе. Успехи в химии и химической технологии: сб. научных трудов. Том XXVII, № 8(148) - М.: РХТУ им. Д. И. Менделеева, 2013. - с.105 -111.
5. Квасников Е.И. Молочнокислые бактерии и пути их использования. / Е.И. Квасников - М.:Наука, 1975. - 395 с.
6. Низовкин В. К. Эбулиостатический метод определения редуцирующих сахаров / В. К. Низовкин, И.З. Емельянова // Журнал прикладной химии. -1959. -Т. 32, № 11.- С. 2516-2521
7. O. H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall. Protein measurement with the Folin phenol reagent // The Journal of Biological Chemistry. - 1952.-V. 193. - P.265-275
Derunets Alice Sergeevna *, Grosheva Veronika Dmitrievna, Beloded Andrey Vasil'evich
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. * e-mail: [email protected]
DYNAMICS OF POPULATION AND PHYSIOLOGICAL STATE OF THE CULTURE OF LACTIC ACID BACTERIA IN THE CONDITIONS OF EXHAUSTION OF THE SUBSTRATE AND HIGH CONCENTRATIONS OF LACTIC ACID
Abstract
Changes of characteristics of Lactobacillus casei culture in periodic fermentation were investigated for the subsequent development of lactic acid biosynthesis process in the membrane bioreactor. Physiological and biochemical maximum activity of microorganisms has shown at 21th hour of fermentation, whereas the maximum CFU/ml number is achieved at the 47th hour then is observed slow lysis culture for at least 270 hours of cultivation.
Key worlds: lactic acid; lactic acid bacteria; fermentation activity.
