CC BY
49
УДК 616.37-002-036.11-092.9:612.127.2:546.172.6-31
динамика показателей кислородтранспортной
Функции крови и нитрат/нитритов при остром
экспериментальном панкреатите у крыс
С.В. Колешко
УО «Гродненский государственный медицинский университет»
Настоящая работа посвящена исследованию и сравнительному анализу показателей кислотно-основного состояния крови, кислородтранспортной функции и содержанию нитрат/нитритов в плазме крови при экспериментальном остром панкреатите у крыс. При этом развивается метаболический ацидоз и снижается pO2 крови, что приводит к развитию гипоксии. Смещение кривой диссоциации оксигемоглобина при данной патологии на 5 сутки вправо при реальных значенияхpH и pCO2, отражает усиление механизмов, направленных на компенсацию гипоксии. Концентрация нитрат/нитритов при остром панкреатите увеличивается, что отражает активизацию L-аргинин^О системы, которая обусловлена экспрессией индуцибельной изоформы NO-синтазы.
Ключевые слова: острый панкреатит, кровь, система транспорта кислорода, нитрат/нитриты
The present work is devoted to research and comparative analysis of blood acid - base balance indexes, oxygen transport function and nitrate/nitrites content in blood plasma during experimental acute pancreatitis at rats. A t this state the metabolic acidosis develops and blood pO2 decreases that results in hypoxia development. At this pathology oxyhemoglobin dissociation curve shifts to the right at actual pH andpCO2 on 5th day which reflects hypoxia compensatory mechanism potentiation During acute pancreatitis nitrate/nitrites concentration increases and that reflects L-arginin-NO systems activation due to inducible nitric oxide synthase expression.
Keywords: acute pancreatitis, blood, system of oxygen transport, nitrate/nitrites
Введение
За последние десятилетия заболеваемость острым панкреатитом (ОП) увеличилась более чем в 2 раза и превышает 25% в структуре острых хирургических заболеваний [1, 4]. Высокая заболеваемость лиц молодого и трудоспособного возраста, высокая летальность при деструктивных формах представляют интерес ученых к разработке новых методов диагностики и поиску эффективных способов лечения. Предпринимаются попытки применения для лечения ОП лекарственных средств, направленных на различные звенья этого тяжелого заболевания. Несмотря на значительный прогресс в диагностике и лечении ОП, некоторые аспекты его патогенеза остаются недостаточно изученными, что отражается на показателях летальности, которые колеблются в пределах от 5-21% в целом, до 85% при деструктивных формах заболевания [3, 5, 10]. В связи с этим актуальным и перспективным направлением в решении данной проблемы является дальнейшее изучение механизмов патогенеза ОП с последующей разработкой патогенетически обоснованного воздействия на них.
В настоящее время многие авторы считают, что гипоксия является важным составным звеном в развитии ОП [9, 11, 14]. Однако патогенетическая характеристика изменений кислородсвязующих свойств крови у больных с ОП исследована недостаточно, поэтому особую значимость приобретает изучение характера обеспечения тканей поджелудочной железы (ПЖ) кислородом при данной патологии и изыскание новых методов лечения ОП.
Целью данной работы является изучение кис-лородтранспортной функции крови и содержания нитрат/нитритов в плазме крови при экспериментальном ОП у крыс.
Материал и методы
Эксперименты проведены на 49 нелинейных белых крысах со средней массой около 200-250 г в соответствии с этическими нормами обращения с
- 2
животными, а также требованиями мирового сообщества «Европейская конвенция по защите позвоночных, используемых для экспериментальных и иных научных целей» (Страсбург, 1986).
Все животные были разделены на 2 экспериментальные группы: 1-я - контроль (24 животных); 2-я - модель острого очагового деструктивного панкреатита (25 животных).
В контрольной группе в стерильных условиях, после обработки операционного поля под внутримышечным наркозом (использовался раствор ка-липсола в дозе 20 мг/кг) производили верхнесрединную лапаротомию с последующим ушиванием брюшной полости послойно наглухо.
Моделирование ОП осуществлялось по разработанной нами методике. Способ осуществляли следующим образом. В стерильных условиях, после обработки операционного поля под внутримышечным наркозом (использовался раствор калип-сола в дозе 20 мг/кг) производили доступ к ПЖ путем выполнения верхнесрединной лапаротомии. В ткань ПЖ, у основания селезеночной ее части инсулиновым шприцем однократной пункцией вводили 0,1 мл 5% раствора Тритона Х-100. Рану ушивали послойно наглухо. Все крысы содержались на стандартном рационе вивария.
Забор смешанной венозной крови из правого предсердия осуществляли на 3, 5 и 10 сутки от начала эксперимента, с последующим выведением животного из эксперимента путем передозировки средств для наркоза.
В смешанной венозной крови определяли парциальное напряжение кислорода (рО2), насыщение крови кислородом (SO2), парциальное напряжение углекислого газа (рСО^), рН при температуре 37 °С с помощью газоанализатора "Synthesis-15" фирмы "Instrumentation Laboratory". Кислотно-основное состояние крови определялось по номограммам Siggaard-Andersen по следующим показателям: реальный и стандартный избыток буферных основа-
03
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Журнал ГрГМУ 2009 № 2
ний (АВЕ/SBE), концентрация гидрокарбоната (НСО3-), общей углекислоты (ТСО2), стандартного бикарбоната (SBC). Сродство гемоглобина к кислороду оценивалось по показателю p50 (рО2, соответствующее 50% насыщению гемоглобина кислородом), определяемого спектрофотометрически при реальных значениях рН, рСО2 (р50 еал), которое затем корректно приводили к стандартным условиям (p50станд) по формулам Severinghaus J.W. [13]. Положение кривой диссоциации оксигемог-лобина рассчитывали по полученным значениям р50, используя уравнение Хилла. Содержание нитрат/нитритов в плазме крови измеряли с помощью реактива Грисса [12]. К 0,6 мл исследуемого образца добавляли 0,8 мл 30% раствора цинка сульфата и инкубировали 15 минут при комнатной температуре. Пробы центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин. Затем к 0,8 мл супернатанта вносили по 0,8 мл гидроокси натрия, перемешивали и центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин. К 1,0 мл прозрачной надосадочной жидкости добавляли по 0,5 г кадмия и инкубировали при комнатной температуре в течение 24 часов. Через сутки к 1 мл пробы добавляли по 2 мл реактива Грисса (1% сульфаниламид и 0,1% N-нафтилэтилендиамин дигид-рохлорид), интенсивно перемешивали и через 15 минут измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм. Количество нитрат/нитритов рассчитывали по калибровочному графику, построенному с известными концентрациями нитрат/нитритов.
Статистическая обработка полученных данных выполнялась на персональном компьютере с помощью прикладных программ «Excel» и «STATISTlCA 6.0». Количественные сведения выражались средними арифметическими величинами и их стандартными ошибками (M±m). Оценка достоверности выявленных различий среди абсолютных величин по p<0,05 выполнена методом непараметрической статистики с использованием критерия Манна - Уитни.
Результаты и обсуждение
Изменения показателей кислотно-основного состояния крови у крыс в проведенных исследова-
сутки pH снижается на 0,182ед. (р<0,001), при этом ABE на 467,1% (р<0,001), HCO3- на 24,8% (р<0,001), TCO2 на 23,9% (р<0,001), sBe на 337,9% (р<0,001), SBC на 28,6% (р<0,001), а pCO2 увеличивается на 14% (р<0,001). На 10 сутки pH становится меньше на 0,051ед. (р<0,001), ABE на 117,2% (р<0,001), HCO3- на 9,8% (р<0,05), SBE на 89,2% (р<0,001), SBC на 9,8% (р<0,05), при этом pCO2 достоверно не изменялось. В развитии ОП прослеживались следующие изменения: на 5 сутки снижались показатели pH на 0,08 ед. (р<0,001), ABE на 24,5% (р<0,05), SBE на 27,8% (р<0,05), SBC на 5,9% (р<0,05), увеличивалось pCO2 на 22,6% (р<0,001). К 10 суткам pH наоборот, увеличилось, по отношению к 5 суткам на 0,135ед. (р<0,001), ABE на 93,5% (р<0,001), HCO3- на 23,7% (р<0,01), TCO2 на 22,3% (р<0,01), SBE На 105,8% (р<0,001), SBC на 29,2% (р<0,001), при этом pCO2 уменьшилось на 9,2% (р<0,01).
Изменения показателей кислородтранспортной функции крови у крыс в проведенных исследованиях представлены в таблице 2. В контрольных группах достоверных изменений показателей кис-лородтранспортной функции крови также не наблюдалось. В сравнении с контролем при ОП на 3 сутки снижались pO2 на 28,8% (р<0,01), SO2 на 16,1% (р<0,01), увеличивалось p50 еал на 15,7% (р<0,01). К 5 суткам продолжали снижаться pO2 на 37,1% (р<0,001), SO2 на 41,3% (р<0,001), p50 rn 7,4% (р<0,01), увеличиваться p50 еал на 13,3% (р<0,01). На 10 сутки также отмечается снижение pOra 15% (р<0,01), SO2 на 13,5% (р<0,01) и p50CT3iw на 7,6% (р<0,05), p50 еал существенно не поменялось. В динамике развития ОП отмечалось: на 5 сутки снижение pO2 на 18,1% (р<0,01), SO2 на 27% (р<0,01), p50CT£iTO на 9% (р<0,02), кривая диссоциации оксигемоглобина (КДО) смещается вправо (рисунок 1). К 10 суткам существенно увеличились, по отношению к 5 суткам, показатели pO2 - на 43% (р<0,001) и SO2 - на 33,3% (р<0,01), однако продолжали оставаться ниже контрольных; уменьшилось p50реал на 12,2% (р<0,01).
Концентрация нитрат/нитритов в плазме крови у крыс при ОП отображена на рисунке 2. Содержа-
ниях представлены в таблице 1. В контрольных группах на 3, 5, 10-е сутки достоверных изменений показателей кислотно-основного состояния практически не наблюдалось. При сравнении ОП с контролем в динамике на 3 сутки отмечается снижение рН на 0,097 ед. (р<0,01), рС02 на 7,3% (р<0,01), АВЕ на 410,5% (р<0,01), НСО-на 25,9% (р<0,01),
Таблица 1 - Изменение показателей кислотно-основного состояния крови у крыс при остром панкреатите
Показатель 3 сутки 5 сутки 10 сутки
Контроль О. панкреатит Контроль О. панкреатит Контроль О. панкреатит
n S 8 8 9 8 8
pH, ед. 7,320±0,009 7.223±0.011* 7.325±0.004 7,143±0.006*# 7.329±0.002 7.278±0.006*#Y
pCO2, мм рт.ст. 57,3±0,68 53.1±0,73* 57,1±0,62 65.1±0,98*# 58.5±0,38 59,1±0,77#Y
ABE, ммоль/л 2,00±0,21 -6,21±0,43* 2,10±0.13 -7,71±0.40*# 2,91±0.34# -0,50±0,33*#Y
HCO3-, ммоль/л 28,6±0,36 21,2±0.77* 28,6±0,83 21,5±0.67* 29,5±0,91 26,6±0,87*#Y
TCO2, ммоль/л 30,5±0,37 22,7±0,78* 30,6±0,90 23,3±0.63* 31,5±0.89 28,5±0,91#Y
SBE, ммоль/л 2,9±0,21 -5,4±0.44* 2,9±0,14 -6,9±0.41*# 3,7±0,24# 0,4±0,33*#Y
SBC, ммоль/л 26,8±0,62 20,4±0.92* 26,9±0.60 19,2±0.64*# 27.5±0.54 24,8±0.68*Y
Примечание: * - р<0.05 по отношению к контрольной группе, # - по отношению к третьим суткам, у - по отношению к пятым суткам Таблица 2 - Изменение показателей кислородтранспортной функции крови у крыс при остром панкреатите (М±т)
TCO
на
25,
,6%
(р<0,01), SBE на 286,2% (р<0,01), SBC на 23,9% (р<0,01). На 5
Показатель 3 сутки 5 сутки 10 сутки
Контроль О.нанкреатит Контроль О.нанкреатит Контроль О.нанкреатит
n 8 8 8 9 8 8
Гемоглобин, г/л 109,38±0,53 108.25±0,75 107,63±0,82 107,89±0,95 108,13±0,85 108.25±0,84
pO2, мм рт.ст. 27,1±0,64 19.3±0,73* 25.1±0,67 15,8±0,36*# 26,6±0,60 22,6±0,75*#Y
SO2, % 27,4±0,70 23,0±0,71* 28.6±0,68 16,8±0,96*# 25,9±0,45 22,4±0,65*Y
p50реаЛ, мм рт.ст. 28,6±0,41 33,1±0,75* 28,8±0,46 32,7±0,45* 29,3±0,66 28,7±0,70#Y
p50сганд, мм рт.ст. 26,4±0,48 27,5±0,69 27,0±0,41 25,0±0,31*# 27,6±0,62 25,5±0,72*
Примечание: *- p<0.05 по отношению к контрольной группе, # - по отношению к третьим суткам, y- по отношению к пятым суткам
- 204
ние NO3-/NO2- на 3 сутки при ОП составляет 26,14±0,48, что значительно выше, чем в контрольной группе - 16,37±0,52, т.е. на 59,7% (р<0,01). К пятым суткам концентрация нитратов/нитритов увеличилась еще на 37,5% (р<0,001) и составила 35,94±0,95. На 10 сутки их концентрация уменьшилась до 28,19±0,74, т.е. на 21,6% (р<0,001), но продолжала оставаться выше, по сравнению с контрольной группой (17,91±0,30), на 57,4% (р<0,001).
Из представленных данных следует, что при ОП развивается метаболический ацидоз и снижается р02 крови, что приводит к развитию гипоксии. Для формирования кислородтранспортной функции крови имеют большое значение кислородсвязую-щие свойства крови, и, в частности, сродство гемоглобина крови (СГК). В организме СГК в значительной степени определяет диффузию кислорода из альвеолярного воздуха в кровь, а затем на уровне капилляров в ткань. Процесс присоединения кислорода к гемоглобину является ступенчатым, присоединение молекулы кислорода к одному гему приводит к изменению микроструктуры молекулы гемоглобина и приближению плоскости соответствующего гема к плоскости глобина. Целесообразность такого хода процесса оксигенации, т.е. нелинейной зависимости насыщения гемоглобина кислородом от рО2, проявляется в том, что содержание кислорода в крови может оставаться достаточно высоким даже при значительном снижении рО2 (при снижении рО2 со 100 до 70 мм рт.ст. фракция оксигемоглобина уменьшается лишь на 5%). Клиническое выражение подобной физиологической целесообразности наблюдается у тяжелобольных с дыхательной недостаточностью, когда при существенно сниженном рО2 (до 55-50 мм рт.ст.) остается достаточно высоким насыщение гемоглобина кислородом, что является одним из путей компенсации возникшей гипоксии [7]. При гемичес-кой гипоксии сдвиг КДО вправо, вызванный усилением синтеза 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ) в эритроцитах (Др50 - 2,5 мм рт. ст.), увеличивает количество поступающего в ткани кислорода на 15% [6]. Смещение КДО при ОП на 5 сутки вправо при реальных значениях рН и рС02, отражает усиление механизмов, направленных на компенсацию гипоксии.
В последние годы установлено, что оксид азота (N0) имеет большое значение для формирования кислородтранспортной функции крови. Он выполняет роль аллостерического эффектора в отношении гемоглобина, изменяя его сродство к кислороду через образование различных 1Ч0-производных гемопротеина, изменения внутриэритроцитарных механизмов его регуляции, действие пероксинит-рита [2]. Как видим из наших данных, концентрация нитрат/нитритов при ОП увеличивается, что отражает активизацию L-аргинин-N0 системы, которая обусловлена экспрессией индуцибельной изоформы N0-синтазы [8].
Заключение
Анализ проведенных исследований указывает, что при ОП развивается падение рО2, кривая диссоциации оксигемоглобина сдвигается вправо на пике патологии (5 сутки), но это не приводит к сни-
Рисунок 1 - Кривые диссоциации оксигемоглобина при реальных значениях рН, рСО2 у крыс на 5-е сутки: □ - контроль,♦ - острый панкреатит
Острый панкреатит
Контроль
Рисунок 2 — Концентрация нитратов/нитритов в плазме крови у крыс при остром панкреатит
Примечание: по оси ординат - NO3/NO2 мкмоль/л; по оси абсцисс - опытные группы: 1- 3-и сутки; 2- 5-е сутки; 3-10-е сутки; *- p<0,05 по отношению к контрольной группе, # - по отношению к 3 суткам, у — по отношению к 5 суткам
жению проявления гипоксии, что представляет интерес к поиску средств для коррекции данных нарушений, и что в дальнейшем позволит предложить целенаправленное воздействие на механизмы прогрессирования заболевания, а, следовательно, повысить эффективность лечения данной патологии.
Литература
1. Диагностика и хирургическое лечение панкреонекроза / Э.И. Гальперин [и др.] // Хирургия. - 2003. - №3. - С.55-59.
2. Зинчук, В.В. Участие оксида азота в формировании кисло-род-связывающих свойств гемоглобина / В.В. Зинчук // Усп. физиол. наук. - 2003. - Т. 34, № 2. - С. 33-45.
3. Коротков, Н.И. Миниинвазивные технологии в диагностике и лечении местных гнойных осложнений деструктивного панкреатита / Н.И. Коротков, А.В. Кукушкин, А.С. Метелев // Хирургия. - 2005.
- №3. - С. 40-44.
4. Острый панкреатит и травмы поджелудочной железы / Р.В. Вашетко [и др.] - Спб.: Издательство «Питер», 2000. - 320 с.
5. Решетников, Е.А. Диагностика и дифференцированное лечение острого панкреатита биллиарной этиологии / Е.А. Решетников, А.С. Миронов, Ю.Я. Малов // Хирургия. - 2005. - №11. - С. 25-27.
6. Роль гемоглобина в адаптации к гипоксии больных железо-дефицитной анемией / М.Г. Дмитриева [и др.] // Гематол. и трансфу-зиол. - 1994. - Т. 39, №1. - C. 13-15.
7. Рябов, Г.А. Гипоксия критических состояний / Г.А. Рябов. -М.: Медицина, 1988. - 288 с.
8. Bradycinin and ATP stimulate L - arginine uptake and nitric oxide release in vascular endothelial cells / R.G. Bogle [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1992. - Vol.80. - P. 926-932.
9. Chen, H.M. Hyperbaric oxygen therapy attenuates pancreatic microcirculatory derangement and lung edema in an acute experimental pancreatitis model in rats / H.M. Chen, M.H. Shyr // Pancreas. - 1998. -Vol.17, №1. - P. 44-49.
10. Fernandez-Cruz, L. Minimally invasive surgery of the pancreas in progress / L. Fernandez-Cruz, G. Cesar-Borges // Surg. - 2005. - Vol.4.
- P. 342-354.
11. Inhibition of TNF improves survival in an experimental model of acute pancreatitis / C.B. Hughes [et al.] // The American Surgeon. - 1996.
- Vol.62, №1. - P. 8-13.
12. Reevaluation of the Griess method for determining NO/NO2- in aqueous and protein-containing samples / K. Schulz [et al.] // Nitric Oxide.
- 1999. - № 3. - Р. 225-234.
13. Severinghaus, J.W. Blood gas calculator / J.W. Severinghaus // J. Appl. Physiol. - 1966. - Vol. 21, № 5. - P. 1108-1116.
14. Sweiry, J.H. Role of oxidative stress in the pathogenesis of acute pancreatitis / J.H. Sweiry, G.E. Mann // Scand. J. Gastroenterol. - 1996. -Vol.31(suppl 219). - P. 10-15.
_Поступила 20.04.09
#
15
