CC BY
348
© коллектив авторов, 2015
УДК 616-008.938.57-055.5/.7-053.2-074:543.42.062
Мамедов И.С., Золкина И.в., Сухоруков в.С.
ДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННЫХ НАРУшЕНИЙ ОБМЕНА ПУРИНОВ И ПИРИМИДИНОВ У ДЕТЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВЗЖХ-ЗЛЕКТРОСПРЕЙНОЙ ТАНДЕМНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
ГБОУ вПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России
Представлены данные о новом методе диагностики болезней обмена пуринов и пиримидинов с использованием ВЭЖХ в комбинации с электроспрейной масс-спектрометрией. Подробно описаны процедура анализа от преаналитическо-го этапа до интерперетации данных жидкостной хроматографии масс спектрометрии, контроль качества данных анализа, масс-спектрометрические параметры и хроматографические условия исследования пуринов, пиримидинов и их метаболитов. Приведены референсные значения для пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов и оснований в моче у здоровых индивидуумов, химическая структура пуринов, пиримидинов и их метаболитов, а также примеры хромато-масс-спектрограмм при различных наследственных нарушениях обмена пуринов и пиримидинов.
Статья предназначена для педиатров всех профилей, медицинских генетиков и врачей клинико-лабораторной диагностики.
К л ю ч е в ы е с л о в а: пурины; пиримидины; ВЭЖХ; электроспрейная тандемная масс-спектрометрия.
Для цитирования: Клиническая лабораторная диагностика. 2015; 60(6): 21-29. Mamedov I.S., Zolkina I.V., Sukhorukov VS.
THE DIAGNOSTIC OF HEREDITARY DISORDERS OF METABOLISM OF PURINES AND PYRIMIDINES IN CHILDREN USING HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY OF ELECTRO-SPRAY TANDEM MASS-SPECTROMETRY
The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia, 117997 Moscow, Russia The article presents data concerning new technique of diagnostic of diseases of metabolism ofpurines and pyrimidines using high performance liquid chromatography combined with electro-spray mass-spectrometry. The procedure of analysis is described in detail: from pre-analytical stage to interpretation of data of liquid chromatography mass-spectrometry, control of quality of data analysis, mass-spectrometry parameters and chromatographic conditions of analysis ofpurines, pyrimidines and their metabolites. The reference values are presented for purine and pyrimidine nucleosides and bases in urine of healthy individuals. The chemical structure of purines, pyrimidines and their metabolites and examples of chromato-mass-spectrograms under various hereditary disorders of metabolism ofpurines and pyrimidines are presented as well. The article is targeted to pediatricians of all profiles, medical geneticists and physicians of laboratory diagnostic.
Keywords: purines; pyrimidines; high performance liquid chromatography; electro-spray tandem mass-spectrometry
Citation: KlinicheskaiaLaboratornaiaDiagnostika. 2015; 60 (6): 21-29.
1. Введение. Врожденные (наследственные) болезни обмена пуринов и пиримидинов имеют широкий спектр клинических проявлений, которые включают среди прочего анемию, иммунодефицит, камни в почках, судороги, задержку психического развития, аутизм и задержку роста. В отличие от хорошо известных дефектов метаболизма пуринов большая часть из семи дефектов пиримидинового метаболизма описана совсем недавно. Генетические дефекты метаболизма интересны не только с биологической точки зрения, они могут иметь серьезные клинические проявления, такие как побочные реакции при лечении. Дефекты в катаболизме (деградации) пиримидинов могут быть ассоциированы с вариабельными клиническими фенотипами, тогда как одни и те же дефекты могут указывать на серьезные, опасные для жизни токсические последствия, например при лечении пиримиди-новым аналогом 5-флуороурацилом.
Наследственные нарушения обмена пуринов и пиримидинов - группа генетически обусловленных нарушений метаболизма, до сих пор мало изучались в Российской Федерации, несмотря на то что некоторые заболевания поддаются лечению. Во многом это обусловлено трудностями лабораторной диагностики данных заболеваний. С внедрением в клини-
Для корреспонденции: Мамедов Ильгар Салехович, [email protected]
For correspondence: Mamedov I.S., [email protected]
ческую практику метода высокоэффективной жидкостной хроматографии хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС) стала возможной диагностика большинства наследственных нарушений обмена.
Клиническая симптоматика наследственной патологии пуринового и пиримидинового обмена широко варьирует по степени тяжести даже среди родственников из одной семьи. Наиболее часто при данном нарушении метаболизма страдают центральная нервная система (ЦНС), почки и система крови [1]. Основным биохимическим признаком этих заболеваний является изменение содержания пуриновых и пирими-диновых азотистых оснований, нуклеозидов и их производных в биологических жидкостях [2] и лизатах клеток.
Поскольку клинический спектр данных нарушений очень широк, разработаны быстрые и специфичные методы скрининга для диагностики этих заболеваний у пациентов с потенциальной возможностью соответствующего лечения, для медико-генетического консультирования и для пренатальной диагностики. Мы применили новую методику общего скрининга пуринов и пиримидинов и два специфичных метода анализа метаболитов патологического пиримидинового катаболизма и патологического пути образования пиримидинов de novo с использованием ВЭЖХ в электроспрее с тандемной масс-спектрометрией мочи или пропитанных мочой стрипов фильтровальной бумаги. Эти методы позволяют провести полноценное скринирование/перескринирование у пациентов с риском.
Пуриновые рибонуклеозиды естественного происхождения
Пиримидиновые рибонуклеозиды естественного происхождения
NH,
\ I >
ноу> I
ОН ОН Аденозин
NH;
h/J^V^N
НО^О^ он он
Гуанозин
ТО
HO^OJ он он
Инозин
Пуриновые нуклеозидные основания естественного происхождения
NH,
Г г> H^X>
Sj^NH HJj'V^H
О
HN
Аденин
Гуанин
Sj-^nh
Гипоксантин
nh^nh^o
Ксантин
Пуриновые дезоксирибонуклеозиды естественного происхождения
NH2 О
О; ..XX!
но^о I он
Дезоксигуанозин
HN'
HO^OJ ОН
Дезокси аденозин
V^N
НО^О I ОН
Дезоксиинозин
Рис. 1. Структура пуриновых (дезокси)рибонуклеозидов и нуклеозидных оснований естественного происхождения.
2. Пурины и пиримидины. Гетероциклические азотистые основания - пурины и пиримидины - являются исходными структурными элементами молекул нуклеози-дов и нуклеотидов. Нуклеотиды принимают участие во множестве биохимических процессов. Наиболее известна роль пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов в качестве мономеров-предшественников при биосинтезе РНК и ДНК. Рибонуклеотиды выполняют в организме целый ряд важных функций: являются универсальными источниками энергии (например, АТФ), регуляторными сигналами, входят в состав коферментов (ФАД, НАД, НАДФ), служат переносчиками метильных групп (S-аденозилметионин), являются макроэргическими посредниками в углеводном обмене и синтезе липидов. Обмен пуринов и пиримидинов в организме состоит из трех основных путей - синтеза, катаболизма и взаимопревращений нуклеозидов и нуклео-тидов. Генетически обусловленные дефекты ферментов, принимающих участие в этих процессах, могут приводить к развитию заболеваний.
Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды - важнейшие соединения для большого числа биологических процессов, таких как синтез ДНК, РНК, фосфолипидов, гликогена и сиа-лизация и гликосиализация белков. Оба пурина и пиримидина могут быть синтезированы de novo в клетках млекопитающих через многоступенчатые метаболические процессы. Пуриновые нуклеотиды могут быть также синтезированы с помощью утилизации пуриновых оснований аденозина, гуа-нозина и гипоксантина. Утилизация патологическим путем пиримидиновых нуклеотидов происходит на уровне нукле-озидов уридина и цитидина. У пациентов с дефицитом пу-ринового и пиримидинового метаболизма обычно изменен уровень нуклеозидных оснований и/или (дезокси)рибону-клеозидов. Структура оснований пуринов и пиримидинов естественного происхождения и (дезокси)рибонуклеозидов показана на рис. 1 и 2.
NH2
О
HO-^O^I он он
Цитидин
HN
O^N НО^О^
он он
о н о
t« HN II
0 oWH
HO^O^j 0
он он он он
Уридин Псевдоуридин
Оротидин
Пиримидиновые нуклеозидные основания естественного происхождения
NHZ HNs|i О NH Цитозин
HN
O^NH Тимин
СН,
и
л
HN
O^NH Урацил
HN
O^NH
ОН
О
Оротат
Пиримидиновые дезоксирибонуклеозиды естественного происхождения
NH2
O^N НО^
ОН ОН Дезоксицитидин
HN
O^-N
HO^o^l он он
Тимидин
СН,
Рис. 2. Структура пиримидиновых (дезокси)рибонуклеозидов и нуклеозидных оснований естественного происхождения.
3. Клинические проявления нарушений обмена пуринов и пиримидинов и общие представления о патогенезе этих заболеваний. Первые признаки этих болезней могут манифестировать в разном возрасте, начиная от первых дней жизни. Преобладание в клинической картине симптомов поражения той или иной системы организма позволяет выделить среди наследственных нарушений обмена пуринов и пиримидинов группы заболеваний в соответствии с ведущим симптомо-комплексом (табл. 1).
Знание характерных клинических признаков позволяет выделить основные клинические показания для исследования обмена пуринов и пиримидинов:
- для болезней, протекающих с преимущественным поражением нервной системы, характерна задержка/отставание психического или психомоторного развития различной степени тяжести (от легкой до глубокой) с раннего возраста, часто сочетающаяся с мышечной гипотонией или гипертонусом, эпилептическими приступами, аутизмом [3];
- при заболеваниях с преимущественным поражением почек клиническая симптоматика обусловлена образованием в организме труднорастворимых соединений - мочевой кислоты, ксантина, 2,8-дигидроксиаденина, что проявляется дизметаболической нефропатией и/или мочекаменной болезнью. Поражение почек часто сочетается с ранним развитием подагрического артрита и иногда - с неврологическими нарушениями в виде сенсоневральной тугоухости, атаксии, экстрапирамидных расстройств, задержки психомоторного развития; у отдельных больных возможно развитие острой почечной недостаточности [4, 5];
- сочетанное тяжелое поражение нервной системы и почек наблюдается при синдроме Леша - Нихена, обусловленном полным отсутствием активности фермента ГФРТ. Для заболевания характерна задержка психомоторного развития с 3-месячного возраста и формирование к 6 - 12 мес жизни дистонической формы церебрального паралича в сочетании с аутоагрессивным поведением и уратной нефропатией [6-8];
Таблица 1
Основные клинические проявления, тип наследования, сроки манифестации и частота наследственных заболеваний, обусловленных нарушением обмена пуринов и пиримидинов
Заболевание Тип наследования Сроки манифестации Основные клинические проявления Частота встречаемости/ распространенность
Болезни с преимущественным поражением ЦНС
Дефицит аденилосукцинат лиазы (АДСЛ) АР Период новорож-денности - ранний детский возраст Задержка/отставание психоречевого и/ или двигательного развития; непостоянные признаки: эпилепсия и/или аутизм 5/2000 детей с недифференцированной патологией ЦНС [10]
Дефицит А1САИ трансформила-зы/ ИМФ-циклогидролазы (АТЮ) Предположительно АР Не установлена
Дефицит дигидропиримидин-дегидрогеназы АР Не установлена
Дигидропиримидинурия(дефицит дигидропиримидиназы) Дефицит бета-уреидопропионазы АР АР 1/10 000 в Японии [6]
Не установлена
Сочетание поражения почек и тяжелого поражения ЦНС
Синдром Леша-Нихена, обусловленный отсутствием активности фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (ГФРТ) Х-сцепленный С 3-4 мес до 1 года Дистоническая форма детского церебрального паралича в сочетании с аутоагрессией и уратной нефропатией 1/235 000 - 1/380 живорожденных [11]
Заболевания с преимущественным поражением почек
Парциальный дефицит активности ГФРТ - синдром Келли -Зигмиллера Х-сцепленный С детского возраста и старше Дисметаболическая нефропатия и/ или мочекаменная болезнь, обусловленные образованием кристаллов из труднорастворимых соединений - мочевой кислоты, ксанитана и 2,8-дигидроксиаденина; непостоянные признаки: артропатия/подагра, двигательные расстройства и/или задержка/ отставание психоречевого развития Не установлена
Гиперактивность фосфорибозил-пирофосфатсинтазы I (ФРПС I) Х-сцепленный С детского возраста и старше Не установлена
Наследственная ксантинурия (дефицит ксантиндегидрогеназы (ксантиноксидазы)) АР С 6 мес и старше 1/6000 - 1/69 000 [7, 8]
Дефицит аденинфосфорибозил-трансферазы (АФРТ) АР С периода ново-рожденности и старше Предположительно, 1/33 000 - 1/250 000 (Orphanet)
Наследственные иммунодефициты
Дефицит аденозиндезаминазы (АДА) АР С периода ново-рожденности до школьного возраста Рецидивирующие тяжелые инфекции; непостоянные признаки: неврологические нарушения 1/1 000 000 новорожденных (http://www. orphan-europe.com)
Дефицит пуриннуклеозидфосфо-рилазы (ПНФ) АР 1-6 лет, иногда в более старшем возрасте Не установлена
Наследственные анемии
Наследственная оротовая ацидурия АР 1,5 мес - 7 лет Анемия, устойчивая к терапии препаратами железа, витамином В12 и фолиевой кислотой; непостоянные признаки: задержка/отставание психомоторного развития, задержка физического развития; гемолитическая анемия Не установлена
Дефицит пиримидин-5-прайм-нуклеотидазы АР С детского возраста и старше Не установлена
П р и м е ч а н и е. АД - аутосомно-рецессивный тип наследования; ЛЮДИ - аминоимидазол-карбоксамидоризид; АТ1С - аминоимидазол-карбоксаминорибозид-трансамилаза/инозинмонофосфат-циклогидролаза.
- болезни, для которых характерна патология системы крови, проявляются либо гипохромной анемией, устойчивой к терапии препаратами железа, витамином В12 и фолиевой кислотой, либо гемолитической анемией. Анемия может сочетаться с задержкой/отставанием психомоторного развития и/или задержкой физического развития;
- нарушения обмена пуринов, для которых характерна патология системы иммунитета, клинически манифестируют повторными утяжеляющимися с возрастом инфекциями (синуситами, отитами, трахеобронхитами и пневмониями), возможно фатальное течение вакциноассоциированной инфекции. У больных с иммунодефицитными состояниями
нередко наблюдаются неврологические расстройства, включающие спастичность, нистагм, задержку психомоторного развития.
Изучению патогенетических механизмов наследственных нарушений обмена пуринов и пиримидинов придается особое значение, так как понимание этих механизмов во многом способствует разработке путей эффективного лечения и профилактики данных заболеваний.
Главными пуриновыми основаниями являются аденин и гуанин, пиримидиновыми - цитозин, тимин и урацил [9]. Указанные азотистые основания формируют основу структуры ДНК и РНК, а также ряда важнейших коферментов и
Таблица 2
Наследственные нарушения обмена пуринов и пиримидинов, выявляемые методом ВЭЖХ-МС
Заболевание Специфические метаболиты пуринов и пиримидинов в моче или в эритроцитах, определяемые с помощью ВЭЖХ- МС
Дефицит АДСЛ В моче: |Т сукциниладенозин (S-Аdo); |Т сукцинил-аминоимидазолкарбоксамидо-рибозид ^АЮАИ)
Дефицит АТ1С В моче: |Т аминоимидазолкарбоксамидо-рибозид (А1СА-рибозид); | S-Аdo; | SАIСАR
Дефицит дигидропиримидин дегидрогеназы В моче: |Т урацил и тимин
Дефицит дигидропиримидиназы В моче: |Т дигидроурацил; |Т дигидротимин; | урацил; | тимин
Дефицит Р-уреидопропионазы В моче: | бета-уреидопропионат; | бета-уреидоизобутират; ±| дигидроурацил; ±| дигидротимин; ±| урацил; ±| тимин
Синдром Леша - Нихена, обусловленный отсутствием активности фермента ГФРТ В моче: |Т мочевая кислота; | гипоксантин
Гиперактивность ФРПС I В моче: | гипоксантин, | ксантин
Наследственная ксантинурия - дефицит ксантиноксидоредуктазы (ксантиноксидазы) В моче: |Т ксантин; | гипоксантин
Дефицит АФРТ В моче: | 2,8-дигидроксиаденин
Дефицит АДА В моче: | аденозин; | дезоксиаденозин
Дефицит пурин-нуклеозид-фосфорилазы В моче: | инозин; | гуанозин; | дезоксиинозин; | дезоксигуанозин
Наследственная оротовая ацидурия I типа В моче: |Т оротовая кислота
Дефицит пиримидин-5-праймнуклеотидазы В эритроцитах: | пиримидиновых нуклеотидов - уридина и цитидина трифосфатов
П р и м е ч а н и е. | - повышение концентрации; |Т - значительное повышение концентрации; ± - непостоянные изменения.
циклических нуклеотидов. Поэтому поддержание баланса концентраций пуриновых и пиримидиновых оснований, ну-клеозидов, нуклеотидов и их производных для каждого типа клеток или отдельных органов во многом определяет успешное развитие и функционирование как всего организма, так и определенных тканей и органов.
Результаты изучения патогенетических механизмов отдельных нозологических форм наследственной патологии обмена пуринов и пиримидинов свидетельствуют о том, что нарушение активности ферментов, участвующих в обмене этих соединений, приводит к накоплению в клетках и биологических жидкостях субстратов дефектных ферментов. Избыток этих субстратов может сам по себе оказывать токсическое воздействие на определенные типы клеток и ткани; избыточное количество субстрата также может ме-таболизироваться в других биохимических путях с образованием токсичных для определенных клеток продуктов; возможно отрицательное влияние аккумулирующегося продукта на транспорт азотистых оснований и нуклеозидов внутрь клетки, что может нарушать функцию и жизненный цикл отдельных клеточных популяций [10, 11]. Внутриклеточные концентрации дезоксинуклеозидтрифосфатов имеют тесные механизмы регуляции, и нарушение баланса их содержания в клетке может иметь генотоксические последствия [12-14].
4. Лабораторная диагностика наследственных нарушений обмена пуринов и пиримидинов. Биохимическая диагностика включает рутинные и высокотехнологичные методы исследования. Ряд заболеваний, обусловленных нарушением обмена пуринов, можно заподозрить на основании изменения содержания мочевой кислоты в плазме крови и моче, так как мочевая кислота является конечным продуктом катаболизма пуринов [15, 16].
Основными биохимическими показаниями для исследования нарушения обмена пуринов являются:
повышенное содержание мочевой кислоты в сыворотке крови в сочетании с повышенной экскрецией мочевой кислоты с мочой;
низкое содержание мочевой кислоты в сыворотке крови в сочетании со снижением ее экскреции с мочой;
снижение значения коэффициента суточной экскреции уратов (Иг) с мочой по отношению к содержанию креатинина (Сг) в суточном анализе мочи (Иг/Сг) [17-20].
Таблица 3
Хроматографические параметры метаболитов и ионов метаболитов пуринов и пиримидинов [25-27]
Метаболит Время удерживания, мин Ионы-прекурсоры Фрагмент
Гуанозин 16,76 284,2 152,2
Инозин 16,1 269,1 137,1
Дезоксигуанозин 18,1 268,2 152,1
Аденозин 21,67 268,2 136,1
Уридин 10,24 245,1 113,0
Цитидин 6,51 244,1 112,0
Тимидин 19,01 243,2 127,1
Дезоксиуридин 13,49 229,1 113,0
Мочевая кислота 3,6 169,1 96,1
Оротовая кислота 3,4 157,1 111,0
Гуанин 2,7 152,0 135,0
Гидроксиметил-урацил 4,89 143,1 82,1
Аденин 6,0 136,1 119,0
Уреидопропионовая кислота 3,89 133,1 90,1
Тимин 10,7 127,1 110,0
Дигидроурацил 3,35 115,1 73,0
В-Аланин 2,72 90,1 90,1
Урацил 2,87 113,1 70,0
Дезоксиаденозин 9,78 252,1 136,1
Ксантин 3,66 153,1 110,0
Рис. 3. Высокоэффективные жидкостные хроматографические ионизационные тандемно-масс-спектрометрические профили образцов мочи у пациентов (по оси абсцисс - время в мин; по оси ординат - интенсивность сигнала) [21].
Исследование концентрации мочевой кислоты в биологических жидкостях проводится энзиматическим колориметрическим методом, доступным биохимическим лабораториям большинства поликлиник и многопрофильных стационаров. Для определения содержания метаболитов пиримидинов широкодоступных рутинных методов биохимических исследований не существует.
Для установления диагноза большинства наследственных нарушений обмена пуринов и пиримидинов требуется исследование специфических метаболитов в биологических жидкостях (чаще всего в моче) или в клетках крови методом ВЭЖХ-МС. Данный метод является быстрым, точным и специфичным для диагностики нарушений этого вида обмена [2]. ВЭЖХ-МС относится к высокотехнологичным методам исследования, требует специального оборудования и осуществляется в специализированных лабораториях и центрах, занимающихся наследственными болезнями обмена [21-24]. Спектр наследственных дефектов обмена пуринов и пиримидинов, выявляемых методом ВЭЖХ-МС, представлен в табл. 2.
Для подтверждения диагноза также используют методы определения активности ферментов в эритроцитах и куль-
турах клеток больных и молекулярно-генетические исследования, позволяющие выявить мутации в генах, кодирующих ферменты, участвующие в обмене пуринов и пирими-динов.
Метаболиты интересующей нас пробы мочи разделяются с использованием обратнофазовой ВЭЖХ в комбинации с электроспрейной ионизацией (ESI)MS/MS и детекцией, проведенной с использованием мультиреакционного мониторинга (МИМ-режим). В качестве внутреннего стандарта используются соединения, меченные стабильным изотопом [25].
4.1. Преаналитические процедуры. А. Подготовка образцов. Пробы мочи или пропитанные мочой стрипы фильтровальной бумаги (12x40 мм, тип 2992, Watman). Свежие образцы мочи хранятся при 4°С и анализируются в пределах 1 нед. Другой способ - хранить образцы мочи при -20°С. Перед анализом образцы мочи в жидком виде центрифугируются в течение 10 мин при 10 000 g.
Стрипы фильтровальной бумаги полностью погружают в мочу; избыточную мочу удаляют путем прижимания стрипов к стенке пробирки для тестирования. Высушивают стрипы при комнатной температуре [21].
Таблица 4
Масс-спектрометрические параметры для скрининга пуринов и пиримидинов в режиме позитивной электроспрейной ионизации (ESI), для оротовой кислоты - в режиме негативной ESI
Соединение Масса, г/моль Родительский ион, m/z Дочерний ион, m/z Пиковое напряжение, В Энергия столкновения (активации), эВ Внутренний стандарт
Урацил 112 113 70 35 18 1,3-15Ы2-урацил
Тимин 126 127 110 35 15 2Н4-тимин
Аденин 135 136 119 40 20 8-13С-аденин
Гипоксантин 136 137 110 40 20 Рибозо-1-13С-уридин
Гуанин 151 152 135 40 20 Рибозо-1-13С-уридин
5-Гидроксиметилурацил 142 143 82 27 15 1,3-15Ы2-урацил
Ксантин 152 153 110 35 20 Рибозо-1-13С-аденин
Оротовая кислота 156 155 111 20 10 1,3-15П2-оротовая кислота
Тимидин 242 243 127 30 10 Ме-13С-тимидин
Уридин 244 245 113 25 10 Рибозо-1-13С-уридин
Псевдоуридин 244 245 209 20 30 Рибозо-1-13С-уридин
Дезоксиаденозин 251 252 136 25 15 Рибозо-1-13С-аденозин
Дезоксиинозин 252 253 137 15 15 8-13С-аденин
Дезоксигуанозин 267 268 152 20 10 8-13С-аденин
Инозин 268 269 137 20 20 8-13С-аденин
Гуанозин 283 284 152 20 20 8-13С-аденин
Аденозин 267 268 136 30 15 Рибозо-1-13С-аденозин
Сукцинил-Аденозин 383 384 252 50 25 8-13С-аденин
Дезоксиуридин 228 229 113 20 10 Рибозо-1-13С-уридин
Б. Химические реагенты. Тимин, гипоксантин, ксантин, уридин, тимидин, аденин, инозин, аденозин и гуанозин преоб-ретались в фирме Calbiochem. Оротовая кислота, псевдоури-дин, 5-гидроксиметилурацил (5-OH-Me-Ura), дезоксиинозин, дезоксигуанозин, дезоксиуридин и формиат аммония заказывались в фирме Sigma. Дезоксиаденозин заказывался в фирме P-L Biochemicals. Урацил приобретался в компании Fluka. Ди-гидротимидин, дигидроурацил и N-карбамилбетааланин приобретался в фирме Sigma. 1,3-15П2-урацил, а, а, а,6-2Н3-тимин,
1,3-15П2-оротовая кислота, рибозо-1-13С-уридин, метил-13С-тимидин, 8-13С-аденин, рибозо-1-13С-аденозин, 5,6,6-2H3-Me-2Н3-дигидротимин, 13С4,15П2-дигидроурацил, 5,6,6-2Н3 Me-2H3-дигидротимин; 5-гидроксиметил-13С2, 2Н2-урацил приобретались в компании Cabridge Isotope Laboratories. Аналитически чистый метанол и муравьиная кислота приобретались в фирме Merck. Деионизированная вода заказывалась в фирме Millipore.
В. Приборная база. 1. ВЭЖХ - система, состоящая из двойного градиентного насоса серии Agilent 1200, ваку-
Таблица 5
Масс-спектрометрические параметры для скрининга пиримидиновой деградации в позитивном режиме EsI
Соединение Масса, г/моль Родительский ион, m/z Дочерний ион, m/z Пиковое напряжение, В Энергия столкновения (активации), эВ Внутренний стандарт
5-Гидроксиметилурацил 142 143 82 27 15 5-гидроксиметил-13С2, 2Н2-урацил
Тимидин 242 243 127 30 10 Ме-13С-тимидин
Урацил 112 113 70 35 18 15П2-урацил
Тимин 126 127 110 35 15 2Н4-тимин
Дигидротимин 128 129 69 35 18 2Н6-дигидротимин
Дигидроурацил 114 132 115 5 20 13С4, 15П2-дигидроурацил
N-карбамил-Р-аланин 132 133 90 30 8 15N2, 13С4-Ы-карбамил-Р-аланин
N-карбамил-Р-аминоизобутировая кислота 146 147 129 29 8 2Н6-Ы-карбамил-Р-аминоизобутировая кислота
Таблица 6
концентрация пуриновых и пиримидиновых метаболитов и оснований в моче в контрольной группе (п = 104)
Соединение Среднее ± SD, мкмоль на 1моль креатинина Размах, среднее ± 2SD
Урацил 11,8 ± 9,1 0 ± 30
^мин 0,5 ± 0,6 0 ± 1,7
Aденин 0,6 ± 1,0 0 ± 2,6
Гипоксантин 14,0 ± 6,6 0,8 ± 27
Гуанин 0,8 ± 1,0 0 ± 2,8
5-Гидроксиметилурацил 0,1 ± 0,4 0 ± 0,9
Ксантин 18,5 ± 6,3 5,9 ± 31
Оротовая кислота 1,1 ± 0,8 0 ± 2,7
^мидин 0,0 ± 0,1 0 ± 0,2
Уридин 1,0 ± 0,8 0 ± 2,6
Псевдоуридин 88,5 ± 30,8 27 ± 130
Дезоксиаденозин 0,0 ± 0,1 0 ± 0,2
Дезоксиинозин 0,0 ± 0,1 0 ± 0,2
Дезоксигуанозин 0,0 ± 0,05 0 ± 0,1
Инозин 1,3 ± 0,9 0 ± 3,1
Гуанозин 0,5 ± 0,5 0 ± 1,5
Aденозин 1,1 ± 0,8 0 ± 2,7
Сукциниладенозин 4,0 ± 1,7 0,6 ± 7,4
Дигидротимин 3,1 ± 2,1 0 ± 7,3
Дигидроурацил 6,3 ± 5,3 0 ± 17
К-карбамил^-аланин 11,0 ± 9,2 0 ± 29
К-карбамил-ß- аминоизобутировая кислота 1,8 ± ,3 0 ± 6,4
умного дегазатора и контроллера температуры хромато-графической колонки (все составляющие фирмы Agilent Technologies), соединенных с автосэмлером CTC HTS PAL. 2. Аналитическая колонка Zorbax Eclipse XDB8-C18 (4,0 х 150 мм; размер частиц 5 мкм; Agilent Technologies) и предохранительная колонка (предколонка) (Guard Colunm Cl8 ODS; 4,0 x 3,0 мм; Agilent Technologies). 3. Тандемный масс-спектрометр Agilent 6410 (QQQ Triple quad).
Г. Масс-спектрометрические параметры и хроматогра-фические условия. Общий скрининг пуринов и пиримидинов и скрининг пиримидиновых оснований и их дериватов были выполнены путем разделения составных частей на аналитической колонке Zorbax Eclipse XDB8-C18 при комнатной температуре. Подвижная фаза была следующей: 5 мМ ацетат аммония доводили до нужного объема 0,1% муравьиной кислотой - элюент А и элюент А:метанол (соотношение по объему 9:1) - элюент В. Градиент элюции был следующим (величина потока 0,5 мл/мин): 0-5 мин, 100% А к 100% В; 5-17 мин, 100% В к 100% А; 18-25 мин (величина потока 0,6 мл/мин), 100% А к 100% В. Все ступени градиента были линейны и анализировались. Общее время анализа, включающее балансировку, 25 мин.
Тандемный масс-спектрометр Agilent 6410(QQQ Triple quad) был использован в позитивном режиме ESI для общего скрининга пуринов и пиримидинов. Позитивный режим ESI также был использован для скрининга метаболитов патологической деградации пиримидинов. В качестве распыляющего газа применялся азот, в качестве рабочего газа - аргон, давление ячейки 0,3 Па. Исходная температура 300°С, напряжение в капилляре поддерживалось на уровне 4 кВ. Детектор был
использован в режиме МС/МС с применением мультиреак-ционного мониторинга для детекции специфического перехода ионов-прекурсоров во фрагмент для каждого анализа-та. Время удерживания метаболитов и ионы представлены в табл. 3.
Д. Калибровка. Калибровочные кривые получены для каждого анализата методом регрессии наименьших квадратов: отношение пиковой области анализата к его концентрации в калибровочной смеси. Калибровочные кривые являлись линейными для всех соединений в диапазоне концентраций 50 нг/мл — 1 мкг/мл; для мочевой кислоты диапазон концентраций был 0,5 — 10 мкг/мл.
Е. Контроль качества.1. Были проанализированы общая моча в чистом виде и общая моча с добавлением всех важных метаболитов; концентрации метаболитов сравнивали с предшествующими анализами этих двух контрольных образцов.
2. В том случае, если концентрация метаболита была выше, чем самое высокое значение концентрации калибровочной кривой, образец после разбавления опять подвергали анализу.
3. Параметры, такие как чувствительность системы ВЭЖХ-МС/МС, были установлены путем анализа стандартов, содержащих 20 нг/мл каждого анализируемого вещества.
4.2. Аналитика. А. Процедура пробоподготовки. К 500 мкл мочи добавляли 1,5 мл 5мМ ацетата аммония и смесь переносили на фильтр МШроге. 200 мкл отфильтрованной пробы переносили на микропланшет. 10 мкл образца инжектировали в ВЭЖХ-МС/МС систему.
Б. Обработка данных. Концентрации рассчитывали по формуле:
Сммоль/молькреат. = С(нг/мл) * а / М / Скреат., где Сммоль/молькреат. - концентрация вещества (в ммоль на 1 моль креатинина), С(нг/мл) - концентрация вещества (в нг на 1 мл мочи), М - молярная масса вещества, Скреат. - концентрация креатинина (в моль на л), а - коэффициент разбавления пробы.
В. Пропитанная мочой фильтровальная бумага. 1. Добавляли 20 мкл 18 (1) или 18 (2) на пропитанную мочой фильтровальную бумагу (см. выше).
2. После высушивания переносили стрип фильтровальной бумаги в 2-миллилитровую пробирку Эппендорф.
3. Добавляли 1,5 мл 75 % (об/об) метанола и подвергали воздействию ультразвуком в течение 10 мин.
4. Переносили экстракт в стеклянную колбу.
5. Испаряли экстракт при 40°С под постоянной струей азота.
6. Растворяли высушенный экстракт в 200 мкл 50 мМ уксусной кислоты (рН 4,0) и сонировали ультразвуком в течение 5 мин.
7. Центрифугировали образец при 1600 g в течение 5 мин.
8. Переносили супернатант в виалу.
9. Сохраняли 100 мкл супернатанта для определения концентрации креатинина.
10. Перед анализом методом ВЭЖХ-МС/МС кратко центрифугировали образец при 10 000 g в течение 2 мин.
11. Инжектировали (впрыскивали) 20 мкл в систему ВЭЖХ-МС/МС.
Г. Расчет. Концентрация каждого анализируемого вещества была определена путем измерения тангенса угла наклона в точке пересечения калибровочными кривыми, которые были получены методом регрессии (наименьших квадратов) для анализата: отношение площади (области) пика внутреннего стандарта к концентрации анализата в калибровочной смеси.
Калибровочные кривые являлись линейными для всех соединений вплоть до концентрации 1 мМ. Выше этой концентрации для большинства соединений происходило отклонение от линейного графика. Таким образом, в том случае,
Таблица 7
Принципы лечения больных с наследственными нарушениями обмена пуринов и пиримидинов
Заболевание
Способ лечения
Цель предлагаемой терапии и ее эффект
Синдром Леша-Нихена и парциальный дефицит ГФРТ; гиперактивность ФРПФС I; семейная ювенильная гипе-рурикемическая нефропатия; наследственная ксантинурия I типа (дефицит ксантиндегидрогеназы); дефицит АФРТ
Тяжелый комбинированный иммунодефицит, обусловленный недостаточностью аденозиндезаминазы
Парциальный Т-клеточный иммунодефицит, обусловленый недостаточностью пурин-нуклеозид-фосфорилазы
Наследственная оротовая ацидурия
Дефицит пиримидин-5-прайм-нуклеотидазы
Дефицит миоаденилат-дезаминазы (аденозин-монофосфат-дезаминазы I)
Дефицит АДСЛ, ATIC, дигидропиримидин-дегидрогеназы, дигидропиримидиназы и Р-уреидопропионазы
Медикаментозная терапия с помощью аллопуринола
Пересадка костного мозга; заместительная
ферментная терапия с использованием бычьих эритроцитов, обработанных поли-этиленгликолем (PEG-ADA);
Пересадка костного мозга
Уридин
Специфическое лечение отсутствует
Специфическое лечение отсутствует
Специфическое лечение отсутствует. Симптоматическая терапия: антиконвульсанты по показаниям, ноотропные препараты, корректоры поведения - по показаниям
Снижение образования труднорастворимых соединений, предотвращение развития нефролитиаза и подагрического артрита, у некоторых больных -профилактика формирования почечной недостаточности; препарат не влияет на неврологические расстройства
Полное или частичное восстановление функций иммунной системы; не влияет на неврологические расстройства
Полное или частичное восстановление функций иммунной системы; не влияет на неврологические расстройства
Исчезновение проявлений анемии, нормализация темпов физического развития, нормализация психомоторного развития при рано начатом лечении
Нет
Нет
Уменьшение эпилептических проявлений
если концентрация образца оказывалась выше линейного участка калибровочной кривой, образец разводился и измерялся снова. Если количество образца было лимитировано, концентрации вычислялись путем интерполяции на калибровочную кривую до концентрации 5 мМ.
4.3. Постаналитика. А. Интерпретация результатов. Концентрации метаболитов вне пределов референсных значений могут составлять типичный паттерн, указывающий на наличие врожденных нарушений пуринового и пирими-динового метаболизма. Типичные профили образцов мочи у пациентов показаны на рис. 3. Следует отметить, что различные величины экскрекции пуринов и пиримидинов могут также быть вторичным феноменом, который должен показывать другие метаболические расстройства, такие как дефицит в цикле мочевины. Следует учитывать, что повышенная концентрация отдельного метаболита или же комбинации метаболитов может являться результатом бактериальной контаминации, лечения или приема диетических смесей.
Б. Референсные значения. Референсные показатели для пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов и оснований в моче у здоровых индивидуумов (из контрольной группы; возраст < 3 года) показаны в табл. 4-6 [27-30].
5. Общие принципы лечения наследственных нарушений обмена пуринов и пиримидинов. Верификация нозологической формы нарушения обмена пуринов или пиримидинов проводится врачом-генетиком на основании совокупности клинико-генеалогических данных и результатов проведенных исследований. После установления диагноза назначается лечение, которое в зависимости от тяжести состояния больного и основных клинических проявлений может осуществляться на базе специализированных учреждений медико-генетического профиля, педиатрических и специализированных отделений многопрофильных стационаров или на базе поликлиник с участием врачей-педиатров, неонатологов, нефрологов, иммунологов, гематологов, психоневрологов [21, 26, 30].
Патогенетическое лечение наследственных нарушений пуринового и пиримидинового обмена остается малораз-работанным. До сих пор лечение многих форм этих заболеваний часто носит симптоматический характер. Основные принципы лечения больных с нарушением пуринового и пи-римидинового обмена представлены в табл. 7.
6. Заключение. Внедрение программы ранней диагностики наследственных заболеваний, обусловленных нарушением обмена пуринов и пиримидинов, при помощи метода ВЭЖХ-МС будет способствовать своевременному выявлению этой патологии, что сделает возможным быстрое и адекватное назначение эффективного лечения детям и осуществление профилактики данных заболеваний.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Simmonds H.A., Duley J.A., Fairbanks L.D., McBride M.B. When to investigate for purine and pyrimidine disorders: introduction and review of clinical and laboratory indications. J. Inherit. Metab. Dis. 1997; 20: 214-26.
2. Hartmann S., Okun J.G., Schmidt C-D., Garbade S.F. et al. Comprehensive Detection of Disorders of Purine and Pyrimidine Metabolism by HPLC with Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Clinical Chemistry. 2006; 52: 1127-37.
3. Merceles R., Martin J.J., DeHaene I., DeBarsy T.H., Van den Berghe G. Myoadenilate deaminase deficiency in a patient with facial and limb girdle myopathy. J. Neurol. 1981; 225: 157.
4. Harkness R.A., Coade S.B., Walton K.R., Wright D. Xanthine oxidase deficiency and 'Dalmatian' hypouricemia: Incidence and effect of exercise. J. Inherit. Metab. Dis. 1983; 6: 114.
5. Harkness R.A., McCreanor G.M., Simpson D., MacFadyen I.R. Pregnancy in and incidence of xanthine oxidase deficiency. J. Inherit. Metab. Dis. 1986; 9: 407.
6. Sumi S., Imaeda M., Kidouchi K., Ohba S., Hamajima N., Kodama K., Togari H., Wada Y. Population and family studies of dihydripy-
rimidinuria; prevalence, inheritance mode, and risk of fluorouracil toxicity. Am. J. Med. Genet. 1998; 63: 717.
7. Sebesta I., Krijt J., Kmoch S., Hartmannova H., Wojda M., Zeman J. Adenylosuccinase deficiency: clinical and biochemical findings in 5 Czech patients. J. Inherit. Metab. Dis. 1997; 20(3): 343-4.
8. Torres R.J., Puig J.G. Hypoxanthine-guanine phosophoribosyltrans-ferase (HPRT) deficiency: Lesch-Nyhan syndrome. Orphanet. J. Rare. Dis. 2007; 2: 48.
9. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. Гинодман Л.М. и Кандрора В.И., ред. Москва. 1993; Т. 2.
10. Scriver C.R., Beaudet A.L., Sly W.S., Valle D., Childs В., Kinzler K.W., Vogelstein B. "The Metabolic And Molecular Bases of InheritedDisaes" eight edition, 2001; II: 2528.
11. http://www.orpha.net/data/patho/GB/uk-APRT.pdf Simmonds HA. Adenine phosphoribosyltransferase deficiency. Orphanet Encyclopedia. 2003.
12. Mathews C.K. DNA precursor metabolism and genomic stability. The FASEB Journal. 2006; 20: 1300-14.
13. http://www.orphan-europe.com/
14. Fairbanks L.D., Marinaki A.M., Carrey E.A., Hammans S.R., Duley J.A. Deoxyuridine accumulation in urine in thymidine phosphorylase deficiency (MNGIE). J. Inherit. Metab. Dis. 2002; 25: 603-4.
15. Jaeken J., Van den Berghe G. An infantile autistic syndrome characterised by the presence of succinylpurines in body fluids. Lancet. 1984; 2: 1058-61.
16. Van Kuilenburg A.B.P. Dihydropyrimidine dehydrogenase and the efficacy and toxicity of 5-fluorouracil. Eur. J. Cancer. 2004; 40: 93950.
17. Jacomelli G., Michelia V., Peruzzi L., Notarantonioa L., Cerbonia B., Sestinia S. et al. Simple non-radiochemical HPLC-linked method for screening for purine metabolism disorders using dried blood spot. Clin. Chim. Acta. 2002; 324: 135-9.
18. Van Gennip A.H., Abeling N.G.G.M., Vreken P., van Kuilenburg ABP. Inborn errors of pyrimidine degradation: clinical, biochemical and molecular aspects. J. Inherit. Metab. Dis. 1997; 20: 202-13.
19. Van Kuilenburg A.B.P., Van Lenthe H., Tromp A., Veltman P.C.J., Van Gennip A.H. Pitfalls in the diagnosis of patients with a partial dihydro-pyrimidine dehydrogenase deficiency. Clin. Chem. 2000; 46: 9-17.
20. Van Kuilenburg A.B.P., Dobritzsch D., Meinsma R., Haasjes J., Waterham H.R., Nowaczyk M.J.M. et al. Novel disease-causing mutations in the dihydropyrimidine dehydrogenase gene interpreted by analysis of the three-dimensional protein structure. Biochem. J. 2002; 364: 157-63.
21. Ito T., van Kuilenburg A.B.P., Bootsma A.H., Haasnoot A.J., van Cruchten A.G/, Wada Y., van Gennip A.H. Rapid screening of high-risk patients for disorders of purine and pyrimidine metabolism using HPLC-electrospray tandem mass spectrometry of liquid urine or urinesoaked filter paper strips. Clin. Chem. 2000; 46: 445-52.
22. Analysis of Purine and Pyrimidine Metabolism Using 736 HPLC-ESI-MS/MS
23. Van Kuilenburg A.B.P., van Lenthe H., van Kuilenburg A.B.P. Ra-diochemical assay for determination of dihydropyrimidinase activity using reversed-phase high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 1999; 729: 307-14.
24. Van Kuilenburg A.B.P., Meinsma R., Beke E., Assmann B., Ribes A., Lorente I. et al. P-Ureidopropionase deficiency: an inborn error of pyrimidine degradation associated with neurological abnormalities. Hum. Mol. Genet. 2004; 13: 2793-801.
25. Van Kuilenburg A.B.P., Zoetekouw L. Determination of thymidine phosphorylase activity by a non-radiochemical assay using reversed-phase high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 2005; 820: 271-5.
26. Van Kuilenburg A.B.P., van Lenthe H., van Gennip A.H. A radiochemical assay for P-ureidopropionase using radiolabeled N-carbamyl-P-alanine obtained via hydrolysis of [2-14C]5,6-dihydrouracil. Anal. Biochem. 1999; 272: 250-3.
27. Van Lenthe H., van Kuilenburg A.B.P., Ito T., Bootsma A.H., van Cruchten A.G., Wada Y., van Gennip A.H. Defects in pyrimidine degradation identified by HPLC-electrospray tandem mass spectrometry of urine specimens or urine-soaked filter paper strips. Clin. Chem. 2000; 46: 1916-22.
28. Simmonds H.A. Purine and pyrimidine disorders. In: Blau N., Duran M., Blaskovics M.E., eds. Physician's Guide to the Laboratory Diagnosis of Metabolic Diseases. Chapman Hall Medical. London. 1996; 341-57.
29. Van Gennip A.H., Busch S., Elzinga L., Stroomer A.E.M., van Cruchten A., Scholten E.G., Abeling N.G.G.M. Application of simple chromatographic methods for the diagnosis of defects in pyrimidine degradation. Clin. Chem. 1993; 39: 380-5.
30. Van Lenthe H., van Kuilenburg A.B.P., Ito T., Bootsma A.H., van Cruchten A.G., Wada Y. et al. Defects in pyrimidine degradation identified by HPLC-electrospray tandem mass spectrometry of urine specimens or urine-soaked filter paper strips. Clin. Chem. 2000; 46: 1916-22.
Поступила 24.02.15 Received 24.02.15
