CC BY
35
© О. В. Харченко
УДК 616 - 07: 616. 33 - 008. 3 О. В. Харченко
ДiAГHОCTИКA ДИСПЛАСТИЧНИХ 3MiH СЛИЗОВОГ ОБОЛОНКИ ШЛУНКА ЗА ДОПОМОГОЮ МЕТОДУ ISSR-PCR У ХВОРИХ НА ХРОНННУ ВИРАЗКУ
ДВАНАДЦЯТИПАЛОГ КИ Ш КИ
Полтавський нацюнальний педагогiчний унiверситет iM. В. Г. Короленка
(м. Полтава)
Дослiдження е фрагментом науково-дослщ-но! роботи Харювського нацiонального медичного унiверситету «Формування сучасних методiв xi-рургiчного лiкування i профiлактики ускладнень за-хворювань i травм органiв грудно! клiтки i черевно! порожнини», № держ. реестрацп 0110U002649.
Вступ. Дiагностика дисплази епггелт слизово! оболонки шлунка, як передраково! змiни е актуальною, але ттьки методу бiопсi! з подальшим псто-логiчним дослiдженням бiоптатiв недостатньо для виршення цiе! важливо! дiагностично! проблеми [2, 4]. Важка дисплазiя характеризована клiтинною ати-пiею, аызокарюзом, гiперxроматозом ядер, рiзким збiльшенням ядерно-цитоплазматичних стввщно-шень та розповсюдженою псевдостратифкащею. Середнiй вмiст ДНК i число клггин у фазi синтезу ДНК рiзко пiдвищенi [5].
Вiдомо, що злоякiсна трансформацiя мае певнi перебудови в геномi клiтин, це, в свою чергу, може бути виявлено при аналiзi геномно! ДНК [3, 4].
Пстолопчний метод е обов'язковим методом морфолопчно! дiагностики злоякiсниx пухлин, але у вирiшеннi диференцiйно-дiагностично! проблеми мiж дисплазiею i раком шлунка його роздтьно! здат-ностi недостатньо.
PCR е уыверсальною теxнiкою, яку активно вико-ристовують з середини 80-х роюв. Серед численних маркерiв, основаних на використаннi PCR, особли-ве мiсце займають тi, що е фрагментами ДНК, роз-ташованими мiж локусами iнвертниx повторiв ДНК: ISSR (Inter simple sequence repeats). Використанню цих маркерiв передуе вщкриття того факту, що еу-карюты геноми в середньому на 30-90 % представлен високо полiморфними повторюваними посл^ довностями. Повторювана ДНК виконуе своерщну функцiю з абсорбцп мутацiй в геномi [6].
Вщносна насиченiсть геномiв тими чи Ышими м^ кросателiтними послiдовностями е результатом дм багатьох факторiв, серед яких одним з основних е рiвень стабтьност мiкросателiтно! ДНК. 1нтенсивне подовжання мiкросателiтниx послiдовностей за ра-хунок реплкацмних помилок мае назву мiкросате-лiтно! експанси [7].
Бiльшiсть мiкросателiтниx мутацiй пов'язанi з iнсерцiями або деле^ями деяких повторiв, що вщ-буваються пiд час реплiкацi!. Таке порушення ста-бiльностi мiкросателiтiв частше всього вiдбуваеться завдяки утворенню петель на ДНК пщ час реплкацп («slippage») [8].
Характер i закономiрностi розподiлення в геномi мiкросателiтiв мае особливий Ытерес завдяки тiй рол^ яку вони грають в розвитку онкологiчниx захво-рювань [7, 10].
Метою даного дослщження стало вивчення ге-нотипування слизово! оболонки шлунка у хворих з хроычною виразкою дванадцятипало! кишки.
Об'ект i методи дослщження. В роботу покла-дено результати дослщження 50 спостережень слизово! оболонки операцмного матерiалу шлунюв, що резецiйованi з приводу хроычно! виразки дванадцятипало! кишки. Для дослщження брали зразки слизово! оболонки шлунка з ознаками дисплази рiзного ступеня, в якiй вивчали змши ДНК за допомогою по-лiмеразно! ланцюгово! реакцi! (PCR), яка е, на наш погляд, найбтьш оптимальним молекулярно-бюло-гiчним маркером для дослщження [8, 9].
Ыдивщуальне ДНК-типування (генотипування) зразюв слизово! оболонки шлунка проводили шляхом амплiфiкацi! ДНК в полiмеразнiй ланцюговiй реакцi! (PCR) з використанням ISSR - праймеру S2, який мав структуру: (AGC)6G [8].
Амплiфiкацiю проводили в 25 мкл реакцмно! сумiшi, що мютила 1Ч реакцiйний буфер з три-фосфатами, праймер наведенно! структури, Тад-полiмеразу («Тапотiлi», ВНД1 генетики, РоЫя), ДНК додавали в кiлькостi 10 - 20 нг на реакцю Температура вщпалу праймера становила 57е^ синтез фрагментiв ДНК проходив в 30 циклах амплiфiкацi! на термоциклерi (амплiфiкаторi) «Терцик» ТП4-ПЦР 01 («ДНК - технолопя», Росiя) в режимк I - 95°-2хв., II - 94°-30с, 57°-2хв, 72°-2хв., III - 72°-10хв. Елек-трофоретичне роздтення продуктiв амплiфiкацi! проводили в 2 %-му горизонтальному агарозному гелi (Вагофор, Латвiя) в 1Ч TBE-буферi з наступним !х фарбуванням протягом 10 хв в 0,5мкг/мл розчи-н бромистого етидiю i багаторазовою промивкою в проточнiй водi. Вiзуалiзацiю електрофореграм
Рис. 1. Розподшення ДHK-профiлiв слизовоУ оболонки шлунка у хворих з хронiчною виразкою дванадцятипалоГкишки. Д-1 -дисплазiя першого ступеня; Д-ll - дисплазiя другого ступеня першого варiанту; Д-11Г— дисплазiя другого ступеня другого варiанту; Д-lll - дисплазiя третього ступеня.
проводили на TpaHC^MÍHaTopi в ультрафюлетовому свiтлi з довжиною хвилi 365 нм з наступним фотографуванням. Ви-значення розмiрiв aмплiконiв виконували за допомогою маркера молекулярноУ маси 1000вр DNA-Ledder, pUC 19 DNA/ Msp I («Fermentas», Литва) [1].
Результати дослщжень та Гх обговорення. Генотипу-вання епiтелiю слизовоУ оболонки шлунка пащенпв хворих на хроычну виразку дванадцятипалоУ кишки, виявило рiзномa-нiтнi aмплiфiкaцiйнi профiлi ДНК слизовоУ оболонки шлунка.
Серед рiзномaнiття зразюв вдалося згрупувати ДНК-профiлi вщповщно до фенотипiчних ознак i видтити ПЛР-типи за максимумом вираження в кожному випадку (рис. 1).
Проф^ маркеру слизовоУ оболонки шлунка в нормi мюти-ли фрагменти розмiром 190, 180, 160, 140, 120, 110, 90, 70, 60 п. н. (пар нуклеотидiв) i були щентичы в межах своеУ групи, але суттево в^^знялись вщ ДНК-профiлiв iнших дослщжува-них груп. ДНК-проф^ розмiром 220, 210, 200, 190, 180, 160, 140, 120, 110, 100, 90 п. н. вщповщали фенотипу дисплазп еттелю першого ступеня (Д-1). Але фенотипи дисплазп етте-лю другого ступеня (Д-ll) в 90 % випaдкiв мали вaрiaнт ДНК-профiлiв розмiром 300, 260, 240, 220, 210, 190, 180, 160, 140, 120, 100 п. н. (перший вaрiaнт), решта ж мала ДНК-проф^ 500, 480, 440, 400, 360, 300, 240, 200, 140, 110, 100 п. н. (дру-гий вaрiaнт) (рис. 2), проте фенотипи дисплазп еттелю третього ступеня (Д-lll) мали ДНК-проф^ ттьки одного вaрiaнту розмiром 520, 500, 480, 460, 440, 420, 410, 380, 360,340,320 п. н. (рис. 3).
ДНК-проф^ слизовоУ оболонки шлунка, що вщповщали фенотипу Д-l мали певну подiбнiсть (63,6 % подiбностi) з маркером норми.
Фенотипу Д-ll вщповщали два вaрiaнти ДНК-проф^в з присутнiстю амплкоыв розмiром в межах 500 п. н. та без них. Останн мали значну подiбнiсть на рiвнi 36,4 % з ДНК-профтями слизовоУ оболонки шлунка типу Д-lll. Це свщчить, що ДНК-профiлi Д-ll зм^юються i мають перехiднi форми щодо ПЛР типу Д-lll.
ДНК проф^ слизовоУ оболонки шлунка з Д-lll мютили aмплiкони розмiром 520 п. н. i мали генетичну вщмнысть вщ
Рис. 2. Електрофореграми продуктiв амп-лiфiкату зразкiв ДНК слизовоУ оболонки шлунка Д-11: 1, 4 - амплiфiкацiйнi профiлi Д-ll першого варiанту; 2,3 - амплiфiкацiйнi профiлi Д-ll другого ва-рiанту; М - маркер розмiру фрагмен^в ДНК.
Рис. 3. Електрофореграми продуктiв амплн фiкату зразкiв ДНК слизово'Г оболонки шлунка: 1,2 - проф^ Д-lll; М - маркер розмiру фрагментiв ДНК.
Таблиця
Результати кореляцшного аналiзу мiж показниками дисплазГГ епiтелiю слизовоГ оболонки шлунка за фенотишчними ознаками та показниками за результатами генотипування у хворих з хротчною виразкою дванадцятипалоГ кишки
Ступшь дисплазп -ДНК-тип т1п Ступ1нь дисплазп -ДНК-тип тах
КоефМент кореляцп П1рсона гху 0,863 0,917
Иснота зв'язку сильний дуже сильний
КоефМент детерм1нацп й = 1^2 0,744 0,842
Критичне значення коеф1ц1ента кореляцп з в1рогщшстю 0,95 0,2732 0,2732
Критичне значення коеф1ц1ента кореляцп з в1рог1дн1стю 0,99 0,3511 0,3511
Пор1вняння коеф1ц1ента кореля-цИ гху з критичним (табличним) значенням гсг для значущост1 0,95 г > г ху сг г > г ху сг
Пор1вняння коеф1ц1ента кореляцп гху з критичним (табличним) значенням гсг для значущост1 0,99 г > г ху сг г > г ху сг
КоефМент ковар1ацп 78,673 100,898
Загальний результат статистично достов1р-на залежнють з ймов1р-н1стю 0,99 статистично досто-в1рна залежнють з ймов1рн1стю 0,99
шших груп спостереження, але були подiбнi в межах свое! групи.
ДНК-профл за результатами проведення типу-вання методом ^БЯ-РСЯ в кожному випадку вияв-ляються за максимальним вираженням дисплазп. Якщо фенотипiчно в слизовiй оболонцi шлунка вияв-лена одночасно дисплазiя вiд Д-1 до Д-111, то результат генотипування вщповщатиме максимальному показниковi Д-111 з ДНК-профтями, що мають амп-лiкони розмiром 520 п. н. Амплiфiкацiйнi профл Д-11 мають два варiанти, але другий варiант мае певну подiбнiсть до профiлiв Д-111.
Виявлення певно! залежностi мiж показниками ДНК-типування зразюв слизово! оболонки за методом ^БЯ-РСЯ i показниками ступеня вираження дисплазп епiтелiю слизово! оболоки шлунка хворих на хроычну виразку дванадцятипало! кишки за фе-нотипiчними ознаками проведено за допомогою ко-реляцмного аналiзу(табл.).
Мiж ступенем дисплазп еттелю слизово! оболонки шлунка за фенотитчними ознаками i показниками ДНК-типування зразюв слизово! оболонки шлунка коефМент кореляцi! Пiрсона г^ складае вщ-повiдно 0,863 i 0,917, що означае сильний i дуже сильний за тюнотою кореляцiйний зв'язок мiж показниками. Коефiцiент детермЫацп й = гхул2 склав 0,744 i 0,842 вiдповiдно. Критичне значення коефщ-ента кореляцi! з вiрогiднiстю 0,95 було 0,2732. Критичне значення коефщента кореляцi! з вiрогiднiстю 0,99 було 0,3511. Порiвняння коефщента кореляцi! гху з критичним (табличним) значенням гсг для значу-щост 0,95 вiдповiдало г^ > гсг. Порiвняння коефщен-та кореляцi! г з критичним (табличним) значенням
гсг для значущост 0,99 вщповща-ло гх > гсг. Коефiцiент коварiацi! був 78,673 та 100,898 вщповщ-но, що дае можливiсть зробити висновок статистично достовiр-но! залежност мiж названими показниками з ймовiрнiстю 0,99 (табл.).
Висновки. Дисплазi! епгге-лiю слизово! оболонки шлунка у хворих з хроычною виразкою дванадцятипало! кишки за результатами генотипування ет-телiю слизово! оболонки шлунка за реак^ею ^БЯ-РСЯ мають характеры змЫи, що знаходяться у вщповщнм залежностi з !хыми ДНК-профiлями.
Амплiфiкацiйний ДНК-про-фiль норми мае спектр ампл^ конiв розмiром в межах вiд 190 - 60 п. н., дисплазiя (Д-1) слабо виражена мае амплiфiкацiйний ДНК-профть зi спектром ампл^ конiв розмiром вiд 220 до 60 п. н., дисплазiя (Д-11) помiрно виражена в 90 % мае амплiфiкацiйнi ДНК-профл зi спектром амплкоыв розмiром 300 -100 п. н. (I - варiант) та в 10 % ДНК-профiлi 500 - 100 п. н. (II - варiант), що свщчить про генетичну неодно-рiднiсть дисплазiй другого ступеня. Дисплазiя Д-Ш мае один варiант амплiфiкацiйного ДНК-профiлю зi спектром амплкоыв 520 - 320 п. н. Реак^я ^БЯ-РСЯ виявляе подовження мiкросателiтних послiдовностей ДНК. Тобто за результатами генотипування епггелю слизово! оболонки шлунка ми спостертаем мiкроса-телггы експансi!. Вiдомо, що iнтенсивне подовження мiкросателiтних послiдовностей за рахунок реплка-цiйних помилок мае назву мiкросателiтно! експансi!.
1снуе сильний за тюнотою зв'язок мiж ступенем дисплазi! еттелт слизово! оболонки шлунка за фенотишчними ознаками i показниками ДНК-типування зразюв слизово! оболонки шлунка, коефщент коре-ляцi! Пiрсона гху склав вщповщно 0,863 та 0,917. За-гальний результат свiдчить про юнування статистично достовiрно! залежностi з ймовiрнiстю 0,99.
^БЯ-РСЯ е шформативним методом для виявлення змши генетично! структури епiтелiю слизово! оболонки шлунка. враховуючи доступнiсть, вiдносну простоту та можливють вiзуального зчитування результат без застосування спецiально! апаратури, з устхом використаний при вивченн ДНК-типування епiтелiю слизово! оболонки шлунка з фенотипами дисплазм епiтелiю i дозволяе виявити змiни, якi вних вщбуваються.
Перспективи подальших досл1джень. В по-дальшому маркер плануеться дослщити на практи-цi з метою дiагностики неопластичних змiн епiтелiю слизово! оболонки шлунка у хворих на виразкову хворобу шлунка.
Лiтература
1. Абрамов Д. Д. Точность метода полимеразной цепной реакции «в реальном времени» / Д. Д. Абрамов, Д. Ю. Трофимов, Д. В Ребриков // Прикл. биохимия и микробиология. - 2006. - Т. 42. - С. 485-488.
2. Аруин Л. И. Новая Международная классификация дисплазий слизистой оболочки желудка / Л. И. Аруин // Росс. журн. гастроэнтерол., гепатол., колонопроктол. - 2002. - № 3. - С. 15-17.
3. Канцерогенез / Под ред Д. Г. Заридзе. - Москва : Медицина, 2004. - 576 с.
4. Карселадзе А. И. Некоторые основополагающие понятия онкоморфологии в свете достижений современной молекулярной биологии / А. И. Карселадзе // Арх. пат. - 2009. - Вып. 5. - С. 17-21.
5. Серов В. В. Ранний рак желудка: морфология, гисто- и морфогенез / В. В. Серов, В. Б. Золотаревский, А. В. Берестова // Арх. патол. - 1990. - № 5. - С. 70-74.
6. Baldi P. Sequence analysis by additive scales: DNA structure for sequences and repeats lengths / P. Baldi, P. F. Baisnee // Bioinformatics. - 2000. - Vol. 16. - P. 865-889.
7. Freimer N. B. Microsatellites: evolution and mutational process / N. B. Freimer, M. Slatkin // Ciba Found Symp. - 1996. -№ 197. - Р. 51-67.
8. Mullis K. B. Specific syntesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction / K. B. Mullis, F. Faloona // Meth. Ensy-mol. - 1987. - № 155. - C. 335-350.
9. Tsanev R. Molecular mechanisms of cancer cells survival / R. Tsanev // J. BUON. - 2005. - № 10. - P. 309-318.
10. Wooster R. Instability of short tandem repeats (microsatellites) in human cancers / R. Wooster, A. M. Cleton-Jansen, N. Collins [et al.] // Nat. Genet. - 1999. - № 6. - Р. 152-156.
УДК 616 - 07: 616. 33 - 008. 3
ДiAГHОCTИКA ДИСПЛАСТИЧНИХ 3MiH СЛИЗОВОТ ОБОЛОНКИ ШЯУНКА ЗА ДОПОМОГОЮ МЕТОДУ ISSR-PCR У ХВОРИХ НА ХРОШЧНУ ВИРАЗКУ ДВАНАДЦЯТИПАЛОТ КИШКИ
Харченко О. В.
Резюме. Дiагностика, яка проведена за допомогою реакци ISSR-PCR показала змнни ДНК еттелт сли-зово! оболонки характеры для дисплазп епггелт рiзного ступеня тяжкост в слизовм оболонц шлунка у па-щенпв, щ як хворать на хроычну виразку дванадцятипало! кишки. У випадках iз указаними дисплазiями вщбулися змши у виглядi збтьшення розмiрiв амплкоыв, яю характеры для кожно! з груп. Указан змнни мають характер ммкросателггних експансй 1снуе сильний кореляцмний зв'язок ммж ступенем дисплази, що виявлена за фенотитчними ознаками та показниками характерними для ДНК-типування епггелт слизо-во! оболонки шлунка. КоефМент кореляци ГЛрсона rxy склав вщповщно 0,863 та 0,917. Загальний результат свщчить про юнування статистично достовiрно! залежност з ймовiрнiстю 0,99.
Ключовi слова:ДНК, амплкони, фенотип.
УДК 616 - 07: 616. 33 - 008. 3
ДИАГНОСТИКА ДИСПЛАСТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА ПРИ ПОМОЩИ МЕТОДА ISSR-PCR У БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКОЙ ЯЗВОЙ ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ
Харченко А. В.
Резюме. Диагностика проводимая при помощи реакции ISSR-PCR показала изменения ДНК эпителия слизистой оболочки характерные для дисплазии эпителия разной степени тяжести в слизистой оболочке желудка у пациентов болеющих хронической язвой двенадцатиперстной кишки. В случаях с указаными дисплазиями произошли изменения в виде увеличения размеров ампликонов, характерных для каждой из груп. Указаные изменения носят характер микросателлитных экспансий. Существует сильная кореля-ционная связь между степенью дисплазии определяемой по фенотипическим признакам и показателями характерными для ДНК-типирования эпителия слизистой оболочки желудка. Коэфициент кореляции Пирсона rxy составил соответственно 0,863 и 0,917. Общий результат свидетельствует о существовании статистически достоверной зависимости с вероятностью 0,99.
Ключевые слова: ДНК, ампликоны, фенотип.
UDC 616 - 07: 616. 33 - 008. 3
Diagnosis of Dysplastic Changes of Gastric Mucosa by the ISSR-PCR in Patients with Chronic Duodenal Ulcer
Kharchenko A. V.
Abstract. Diagnosis, made by the ISSR-PCR reaction, has shown mucosal epithelial DNA changes specific to the epithelial dysplasia of varied severity in gastric mucosa in patients with chronic duodenal ulcer.
Amplicated profiles of normal gastric mucosa marker enclosed fragments measuring 190 - 60 p. n. (pairs of nucleotides) and were identical within its group and significantly differed from the DNA-profiles of other subject groups. The DNA-profiles measured 220 - 90 p. n. corresponded to phenotype of
Stage I epithelial dysplasia (D-l). Stage II epithelial dysplasia (D-II) phenotypes in 90 % of cases possessed the variant of DNA-profiles measured 300 - 100 p. n. (the first variant) and the rest ones had the DNA-profiles measured
500 - 100 p. n. (the second variant). Stage III epithelial dysplasia (D-III) phenotypes had the DNA-profiles of single variant, measured 520 - 320 p. n.
D-II phenotype corresponded to two variants of DNA-profiles, containing amplicones measured within 500 p. n. and without them. The latter in 36,4 % resembled DNA-profiles of Type III gastric mucosa. It makes evident that D-II DNA-profiles are changing and have transitional forms to D-III DNA-profiles.
In cases with abovementioned dysplasia, changes in the form of enlargement of amplicones, specific to each group, have been observed. These changes are characterized as microsatellite expansion.
Genetic typing of gastric mucosa epithelium, made by the ISSR - PCR reaction found that gastric mucosa epithelial dysplasias in patients with chronic duodenal ulcer had undergone specific changes, related to their correspondent DNA-profiles.
Amplificated normal DNA-profile has the spectrum of amplicones measured within 190 - 60 p. n. ; low-grade dysplasia (D-I) has amplificated DNA-profile with spectrum of amplicones measured from 220 to 60 p. n. ; mediumgrade dysplasia (D-II) in 90 % has amplificated DNA-profile with spectrum of amplicones measured 300 - 100 p. n. (I - variant) and in 10 % has DNA-profile of 500 - 100 p. n. (II - variant), indicating about heterogeneity of Stage II dysplasias. D-III dysplasia has single variant of amplificated DNA-profile with spectrum of amplicones measured 520 - 320 p. n. The ISSR - PCR reaction made extension of microsatellite DNA-sequences evident. That is, the results of genetic typing of gastric mucosa epithelium founded microsatellite expansions. It is known that that intensive extension of microsatellite sequences due to replicative errors is called microsatellite expansions.
There is strong correlation between the stage of gastric mucosa epithelial dysplasia on phenotypical characteristics and indices of DNA-typing of gastric mucosa samples; Pearson correlation coefficient rxy was 0,863 and 0,917, respectively. The total results founded the existences of statistically significant dependence with 0,99 probability.
The ISSR - PCR reaction is the informative method to detect change of gastric mucosa epithelium genetic structure. Taking into account the availability, relative simplicity and possibility of visual reading of the results without special equipment it has been successfully used while studying the DNA-typing of gastric mucosa epithelium with phenotypes of epithelial dysplasia, providing with detection of change, they are experiencing.
Key words: DNA, amplicones, phenotype.
Рецензент - проф. Баштан В. П.
Стаття надшшла 10. 02. 2014 р.
