CC BY
36
Том 148, кн. 1
Естественные науки
2006
УДК 577.152.314:576.312
ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗЫ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ
З.И. Абрамова, М.М.Д. Нсангу,
Аннотация
Изучены цитоплазматические и ядерные белки лимфоцитов здоровых доноров и больных бронхиальной астмой. В апоптотирующих клетках периферической крови здоровых доноров выявлена ДНКаза, активируемая ионами Са2+ и М^2+. Лимфоциты больных бронхиальной астмой содержат ДНКазы, активность которых изменяется в зависимости от тяжести заболевания. В клетках больных возрастает активность Мп2+ -зависимой ДНКазы и подавляется активность Са2+, Мя2+ -зависимой ДНКазы. Учитывая роль Са2+, Mg2+-зависимой ДНКазы в апоптозе клеток, можно выдвинуть предположение о взаимосвязи торможения апоптоза лимфоцитов больных бронхиальной астмой с нарушением индукции «апоптотической» Са2+, Mg2+-зависимой нуклеазы.
Введение
Хронические обструктивные болезни легких (ХОБЛ) включают гетерогенную по своей природе группу легочных заболеваний - бронхиальная астма, эмфизема, хронический обструктивный бронхит, которые объединяет расстройство функций внешнего дыхания легких по обструктивному типу. Эти заболевания входят в число лидирующих причин по числу нетрудоспособности, инвалидности и занимают четвертое-пятое место в мире среди других причин смерти. В России данные медицинской статистики свидетельствуют о том, что болезни органов дыхания занимают по распространению первое место: 15073.2 на 100000 населения, далее следуют сердечно-сосудистые заболевания - 14385.4, нервной системы - 13491.0 [1]. Первичные механизмы патогенеза ХОБЛ находятся на молекулярно-клеточном уровне [2]. Именно этот уровень определяет индивидуализацию клинических проявлений ХОБЛ у больных. Несмотря на то, что патогенез гиперреактивности бронхов, возникающий на первой стадии воспаления, до настоящего времени полностью не ясен, предполагается, что он возникает в результате сложного взаимодействия Т-лимфоцитов, нейтрофилов, тучных клеток, макрофагов и тромбоцитов. Убедительно показано, что лимфоциты и другие клетки, мигрировавшие в легочную ткань, имеют строго определенный срок жизни, по истечению которого они подвергаются элиминации посредством запуска процесса их программированной клеточной гибели или апоптоза [3-5]. Исследования процессов апоптоза лимфоцитов у больных бронхиальной астмой свидетельствуют об относитель-
В. Г. Винтер
ной устойчивости данных клеток к апоптозу, что проявляется в замедлении фрагментации ДНК этих клеток при инкубации в среде in vitro [6, 7].
В свете этих данных объяснимо то внимание, которое уделяют ученые роли нуклеаз в апоптозе клеток. Польские ученые [8] выдвинули гипотезу, что важнейшим этапом апоптоза является активация нуклеаз. В работе [9] показано, что физико-химические характеристики двух нуклеаз - nuc-58 и nuc-40 -позволяют назвать их ДНКазами, ассоциирующимися с апоптозом в цитолити-ческих Т-лимфоцитах. Позднее было показано [10], что активность нуклеаз в клетках может зависеть от двух белковых молекул - неустановленной апопто-тической нуклеазы (мол. масса - 40000) и кислого белка (мол. масса - 30000), который стабилизирует и инактивирует нуклеазу. В работе [11] сообщается о ДНКазе человека, которая отличается от других предполагаемых апоптотиче-ских нуклеаз тем, что установлена ее ядерная локализация. Высказывалось предположение, что в качестве апоптотической могут выступать: RpS3, ДНК репарирующая эндонуклеаза [12], ДНКаза-гамма, выделенная из ядер тимоци-тов, находящихся на стадии апоптоза, вызванного радиационным облучением, которая затем была обнаружена при апоптозе Т-лимфоцитов при болезни Ку-куши [13].
Учитывая выше изложенное, мы изучили нуклеазную активность лимфоцитов - основных клеток-эффекторов иммунной системы организма при бронхиальной астме.
1. Условия эксперимента
Объектом исследования являлись лимфоциты периферической крови 20 больных бронхиальной астмой (БА) и 20 здоровых доноров. Диагноз атопиче-ской формы аллергического заболевания подтверждался аллергологическим анемнезом, положительными результатами кожных скарификационных и, в ряде случаев, внутрикожных проб с аллергенами.
Лимфоциты выделяли равновесным центрифугированием на преформиро-ванном градиенте перколла (р1.105, 1.095, 1.090, 1.085, 1.077, 1.070). В результате очистки степень чистоты полученных фракций лимфоцитов составила 8594%.
Оценка апоптоза лимфоцитов осуществлялась методом проточной цитоф-луорометрии на приборе Facscon (Becton Dickinson), который позволяет измерить процент апоптотических ядер после окраски пропидиум иодата. Апоптоз ядер определяется по ширине пика гиподиплоидной ДНК, который легко отличить от узкого пика клеток с нормальной (диплоидной) ДНК. Для исследования апоптоза лимфоциты переносили в среду RPMI-1640, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамин и антибиотики, инкубировали в течение 24 ч в атмосфере 5% СО2 при 37°С. В качестве индукторов апоптоза использовали дексаметазон, вводимый в культуральную среду до концентрации 5 мкМ.
Для получения белковых фракций использовали метод фракционирования белков хроматина лимфоцитов, основанный на последовательной диссоциации цитоплазматических и ядерных белков в растворах NaCl возрастающей ионной
силы. В результате при ступенчатом увеличении ионной силы раствора диссоциируются только определенные фракции белков. Для диссоциации использовали 0.01, 0.15, 0.4 М растворы NaCl в 0.01 М трис-буфере, рН 7.2.
Для амплификации ДНК pBR 322 использовали бактериальную культуру Eschericiha coli/ Hb 101 - pBR 322. Сбор бактерий, их лизис и выделение проводили по методу [15]. ДНК pBR 322 очищали от РНК гель-хроматографией на колонке Sepharose CL-4B.
Ферментативную активность исследуемых белковых фракций определяли по приросту продуктов гидролиза ДНК. Активность выражали в спектрофото-метрических единицах увеличения кислоторастворимых продуктов при гидролизе нативной ДНК или денатурированной ДНК при длине волны 260 нм за 60 мин. инкубации при 37°С на 1 мг белка (удельная активность) или на 1 мл ферментного раствора (общая активность).
Специфичность отношения ДНКаз ко вторичной структуре ДНК изучали электрофорезом в 0.7 %-ном агарозном геле, используя суперспиральную ДНК pBR 322 (форма I) и регистрируя переход формы I через форму II (открытое ковалентно-замкнутое кольцо) до формы III (линейная ДНК). Инкубационная проба содержала 100 мкл ДНК pBR 322 (20-50 мкг/мл) / 60 мкл 0.2 М трис-буфера (рН 7.2-7.3) / 20 мкл 0.025 MnCh или MgCb (50 мкМ) и CaCh (1 мкМ). Концентрация белка-фермента в исследуемых фракциях здоровых доноров и больных уравнивалась и составляла 0.45-1.0 мкг/мл. Реакцию останавливали добавлением 10%-ного раствора ДДС-Na / 0.1%-ного бромфенолового синего / 50%-ного глицерина. Контролем перехода форм ДНК служила проба ДНК, содержащая смесь форм I, II и III. Электрофорез проводили в горизонтальном направлении на пластинах размером 10x10x3 мм при силе тока 4 мА/см в течение 1.0-1.5 ч при 20°С. Белковые полосы выявляли на ультрахемископе после окраски гелей в растворе этидиум бромида (2 мкг/мл) в течение 40 мин.
Количественную оценку изменения активности ДНКаз (скорости гидролиза ДНК) больных бронхиальной астмой в зависимости от стадии развития болезни и здоровых доноров проводили флуорометрическим методом [16], определяя Т1/2 - время (в секундах), за которое 50% молекул ДНК (форма I) приобретают однонитевые разрывы. Для оценки результатов электрофоретического изучения продуктов реакции, полученных in vitro, использовали программу Imag Master, разработанную фирмой Pharmacia Biotech. Сканирование элек-трофореграмм проводили на сканере Sharp JX-330. В результате сканирования электрофореграмм формируется графическое (в виде пиков) изображение форм перехода ДНК и оценивается их площадь в процентах.
Для оценки достоверности полученных данных использовали двухвыбо-рочный /-тест для различных дисперсий.
2. Результаты исследования
Для апоптозирующих клеток характерна межнуклеосомная фрагментация ядерной ДНК, приводящая in vivo к образованию апоптотических телец. Нами проведено исследование оптических характеристик выделенных из периферической крови лимфоцитов больных (показателей прямого и бокового рассея-
ния - FSC и SCC), которые отличались от характеристик клеток относительно здоровых доноров. Результаты исследований показали, что инкубация лимфоцитов периферической крови больных бронхиальной астмой (рис. 1) и здоровых доноров (рис. 2) in vitro приводит с течением времени клетки к гибели. Часть клеток погибает по типу апоптоза. При этом отмечено, что количество клеток (в %) с гиподиплоидной ДНК через 72 ч инкубации среди лимфоцитов от здоровых доноров выше, чем среди лимфоцитов от больных бронхиальной астмой. При индуцированном апоптозе лимфоцитов от больных количество клеток с гиподиплоидной зоной увеличивалось незначительно по сравнению с лимфоцитами от здоровых доноров, что свидетельствовало об устойчивости лимфоцитов больных бронхиальной астмой к спонтанному апоптозу.
Полученную фракцию лимфоцитов использовали для изучения нуклеазной активности белков.
Определенные сложности при фракционировании белков лимфоцитов человека связаны с малым количеством получаемых клеток и проблемой сохранения целостности ядер при получении цитоплазматических и ядерных белков. Мы применили метод фракционирования белков хроматина, основанный на последовательной диссоциации белков в растворах NaCl возрастающей ионной силы, и использовали для этого 0.01, 0.15 и 0.4 М растворы NaCl в 0.01 М трис-буфере, рН - 7.2. Находящиеся в физиологической среде лимфоциты больных астмой после концентрирования и центрифугирования промывали в 0.32 М растворе сахарозы на 0.01 М трис-буфере (рН 7.2), содержащем 0.003 М CaCl2. Это сохраняло структуру лимфоцитов, затем осадок клеток промывали в трис-буфере с Ca +, растирали в стеклянном гомогенизаторе Поттера, заливали 5-кратным объемом этого же буфера, содержащего 0.01 М NaCl. После экстракции и центрифугирования получали фракцию цитоплазматических белков (фракция 0.01). Оставшийся осадок заливали одним объемом буфера без Са +, в результате ядра лизировались. Полученный нуклеопротеид последовательно экстрагировали буферами с различной ионной силой. Таким образом, было получено три белковые фракции лимфоцитов: фракция 0.01 (белки цитоплазмы), фракция 0.15 и фракция 0.4. При определении ДНКазной активности в них выяснилось, что после добавления к гомогенату лимфоцитов больных ионов Ca и Mg ДНКазная активность не обнаруживалась. При добавлении ионов Mn белки гомогената слабо гидролизовали высокополимерную нативную ДНК, но достаточно активно гидролизовали денатурированную ДНК. Удельная активность Mn^-зависимой ДНКазной активности гомогената составила, примерно, 4.0 ед. на мг белка. В отдельных белковых фракциях также была обнаружена ДНКазная активность, в частности, во фракции 0.4 она составила около 50 ед. на мг белка.
Таким образом, следует отметить, что в лимфоцитах больных более активно проявляется Mn -зависимая ДНКазная активность.
Для изучения отношения ДНКазной активности ко вторичной структуре ДНК мы использовали плазмидную ДНК pBR 322, на 90% представленную суперспиральной ДНК (форма I) (рис. 3), и активаторы - ионы Ca2+, Mg2+ и Mn2+.
Результаты показали, что в присутствии ионов Са2+ и Mg2+ все фракции белков лимфоцитов больных проявляли ДНКазную активность.
0 мин !
10» ю1 юг 103 ю1
контроль
24 ч
24 ч
99%
1 .
10 10 10
10 10
99%
hl—I
10 10 10
10 10
48 ч
48 ч
10 10 ю 10 10
10 10 10 10 10'
Рис. 1. Интенсивность спонтанного (а) и индуцированного (б) апоптоза лимфоцитов периферической крови здоровых доноров. Оценивается количество клеток (в %) с ги-подиплоидной ДНК (количество гиподиплоидной ДНК определяется по ширине пика на гистограмме)
а
б
Однако продукты реакции регистрировались только через 10-15 мин. после начала реакции. Отмечено, что если при добавлении к суперспиральной ДНК (форма I) белков цитоплазмы (фракция 0.01) через 15 мин. кроме кольцевой открытой ДНК (форма II) образуются молекулы линейной ДНК (форма III), то при взаимодействии белков хроматина (фракция 0.15) с суперспиральной ДНК линейная ДНК появляется только через 60-90 мин. после начала реакции. Во фракции 0.4 ДНКазой активности, переводящей ДНК формы II в линейную ДНК (форма III), обнаружено не было. Во всех случаях ДНКаза лимфоцитов здоровых доноров в присутствии ионов Са2+ и Mg2+ активнее гидролизовала субстрат, чем ДНКаза лимфоцитов больных бронхиальной астмой.
Иная картина наблюдалась при инкубации ДНК с белковыми фракциями лимфоцитов в присутствии ионов Mn . Продукты реакции выявлялись уже через 0.5-2.0 мин., причем ДНКазы фракции 0.01 (рис. 4) и 0.15 (рис. 5) гидро-лизовали суперспиральную ДНК до линейных молекул, а ДНКаза фракции 0.4 (рис. 6) - суперспиральную ДНК pBR 322 только до «открытого» кольца. Это позволило сделать предположение, что ДНКаза фракции 0.4 лимфоцитов имеет предпочтение к денатурированной ДНК и является эндонуклеазой.
24 ч
98% 1 ,
10" 10
10 ю^ ю'1
24 ч
I
97% 1 ,
||д'" ю1' ю2* 10^ 10^
0 мин
99% 1 ,
гГ 10 игто®т(И
48 ч
96% 1
ч
о" 1П1 ТО2, 10^ тИ'
48 ч
82% 1 .
о" 1 р1 юг 10*Д ю^'
контроль
72 ч
95% 1 ,
А
о" ю1' иг юД ю^
72 ч
77% 1 ,
I
" ют юГ"ю^ 1
Рис. 2. Интенсивность спонтанного (а) и индуцированного (б) апоптоза лимфоцитов больных астмой. Пояснения - на рис. 1
4
1 2
4 5
б
Рис. 3. (а) Этапы очистки ДНК рБЯ 322: 1 - Х-ДНК (контроль), 2 - ДНК после обработки фенолом, 3 - ДНК после обработки ацетатом аммония, 4 и 5 - РНК и ДНК после хроматографии на сефарозе 4В соответственно (электрофорез в 0.7%-ном агарозном геле). (б) Электронно-микроскопическое изображение ДНК рБЯ 322 после очистки на сефарозе 4В (форма I - стрелка)
а
б
3
а
К 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 - дорожки 0 2.5 5 10 20 60 0 2.5 5 10 20 60 - время, мин.
белки
здоровых
больных
Рис. 4. Продукты гидролиза ДНК рБЯ 322 белками цитоплазмы лимфоцитов (фракция 0.01) в присутствии ионов Мп2+; К - субстрат до реакции
К 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 - дорожки 0 2.5 5 10 20 60 0 2.5 5 10 20 60 - время, мин. белки здоровых больных
Рис. 5. Электрофореграмма ДНК рБЯ 322 после гидролиза белками фракции 0.15 лимфоцитов в присутствии ионов Мп2+; К - субстрат до реакции
Ц^ШиаЬВас
К 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 - дорожки 0 2.5 5 10 20 60 0 2.5 5 10 20 60 - время, мин. белки здоровых больных
Рис. 6. Электрофореграмма ДНК рБЯ 322 после гидролиза белками фракции 0.4 лимфоцитов в присутствии ионов Мп2+; К - субстрат до реакции
Табл. 1
Количественная оценка продуктов реакции гидролиза ДНК рБЯ 322 белками фракции 0.01
Здоровый донор Больной донор
№ дорожки К 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Время, мин. 0 2.5 5 10 20 60 0 2.5 5 10 20 60
Форма % % % % % % % % % % % % %
Д Н К I 78 63 56 54 27 20 12 74 54 40 32 11 2
Iii 4 8 16 41 49 6 10 14 22 47
II 22 37 40 38 57 39 39 26 40 50 54 67 51
Табл. 2
Количественная оценка продуктов реакции ДНК рБЯ 322 с белками фракции 0.15
Здоровый донор Больной донор
№ К 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Время мин. 0 2.5 5 10 20 60 0 2.5 5 10 20 60
Форма % % % % % % % % % % % % %
Д Н К I 80 66 22 12 5 3 2 62 35 13 11 5 2
III 5 8 10 15 28 5 28 32 36 59
II 20 34 73 80 85 82 70 38 60 59 57 59 39
Небольшое количество линейных молекул появлялось только через 60 мин. после начала реакции (рис. 6). Продолжение инкубации до 120 мин. не приводило к полному переходу кольцевой ДНК в линейную. Такую устойчивость релаксированной кольцевой ДНК к действию ДНКазы фракции 0.4 лимфоцитов нельзя было объяснить недостаточной дозой белка (0.45 мкг/мл), так как добавление десятикратного количества белка-фермента не приводило к значительному увеличению количества линейной ДНК (форма III).
Поэтому устойчивость ДНК формы II к обнаруженному ферменту мы объясняем тем, что ДНКаза специфична к однонитевым участкам ДНК, и при переходе ДНК из формы I в форму II в результате единичного разрыва, когда происходит мгновенное восстановление водородных связей в денатурированных участках, такая ДНК приобретает устойчивость к этому ферменту.
Таким образом, ДНКаза фракции 0.4 лимфоцитов напоминает Mn -зависимую эндоДНКазу печени крыс, описанную ранее в Казанском университете [17, 18].
Количественная оценка продуктов реакции (табл. 1-3) показала, что ДНКазы цитоплазмы (фракция 0.01) и хроматина (фракция 0.4) из лимфоцитов больных бронхиальной астмой и здоровых доноров незначительно различаются по активности (табл. 1 и табл. 3 соответственно).
Более выраженные различия выявлены во фракциях белков-ферментов здоровых доноров и больных, экстрагируемых при ионной силе 0.15 М NaCl (фракция 0.15). Из табл. 2 следует, что ДНКазы лимфоцитов больных почти в 2 раза
Табл. 3
Количественная оценка продуктов реакции ДНК рБЯ 322 с белками фракции 0.4
Здоровый донор Больной донор
№ К 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Время, 0 2.5 5 10 20 60 0 2.5 5 10 20 60
мин
Форма % % % % % % % % % % % % %
Д I 77 64 63 1
Н Iii
К II 23 36 100 100 100 100 100 37 99 100 100 100 100
активнее гидролизуют ДНК формы I до формы III. Но если ДНКаза больных активнее переводит ДНК формы II в форму III (т. е. идет активная фрагментация ДНК), то ДНКаза здоровых доноров активнее переводит ДНК формы I в форму II и далее гидролиз этой формы значительно замедляется.
Таким образом, можно предположить, что ДНКазы, ответственные за фрагментацию ДНК в апоптотических клетках при бронхиальной астме, локализуются во фракциях белков, связанных с хроматином.
Флуорометрический метод определения специфических и неспецифических эндонуклеаз основан на способности этидиум бромида (2,4-диамино-10-этил-9-фенилфенантрен бромид) интеркалировать между двумя парами оснований нативной ДНК. В случае взаимодействия этидиум бромида с ковалентно-замкнутой ДНК, когда свободного вращения нитей ДНК относительно друг друга не происходит, только незначительное количество красителя может ин-теркалировать между основаниями ДНК.
Следовательно, число молекул этидиум бромида, связанного на нуклеотид линейной ДНК, всегда больше числа молекул этидиум бромида, связанного замкнутой кольцевой ДНК аналогичного молекулярного веса. Таким образом, единичный разрыв в кольцевой ДНК в результате действия ДНКаз приводит к появлению свободных концов ДНК, что сопровождается увеличением количества молекул этидиум бромида, связанных с ДНК, и, соответственно, интенсивности флуоресценции. Кроме определения активности эндонуклеаз, данный метод позволяет судить о чистоте препаратов эндонуклеаз. Так, если в препарате эндонуклеазы присутствует экзонуклеазная активность, то после действия эндонуклеазы линейные молекулы ДНК становятся доступными действию эк-зонуклеаз. Гидролиз ДНК экзонуклеазами приводит к образованию моно- и олигонуклеотидов, в результате чего наблюдается уменьшение размеров фрагментов нуклеиновых кислот и снижение интенсивности флуоресценции.
Используя метод флуоресценции для сравнения свойств ДНКаз фракции 0.15 и фракции 0.4 из лимфоцитов больных бронхиальной астмой и здоровых доноров, мы подтвердили наличие различий в свойствах этих ферментов при гидролизе субстрата - суперспиральной ДНК. Из рис. 7 следует, что в результате гидролиза суперспиральной ДНК ДНКазой фракции 0.15 сначала идет усиление флуоресценции, что говорит об образовании релаксированной кольцевой ДНК, а затем значительное снижение интенсивности флуоресценции, т. е. ДНКаза или ДНКазы фракции 0.15 способны гидролизовать ДНК формы I
Рис. 7. Кинетика гидролиза суперскрученной ДНК рБЯ 322 белками хроматина лимфоцитов (фракция 0.15) в зависимости от времени инкубации; э/б - этидиум бромид
Рис. 8. Кинетика гидролиза суперскрученной ДНК рБЯ 322 белками хроматина лимфоцитов (фракция 0.4) в зависимости от времени инкубации; э/б - этидиум бромид
не только до релаксированного замкнутого кольца (форма II) и линейной ДНК (форма III), но и более коротких фрагментов молекул, включающих меньшее количество молекул этидиум бромида, чем линейная ДНК (форма III).
Результаты, представленные на рис. 8, подтверждают результаты рис. 6 о том, что ДНКаза фракции 0.4 лимфоцитов больных является эндонуклеазой, которая производит однонитевые разрывы, в основном, в денатурированном участке суперспиральных кольцевых молекул ДНК (форма I). Полученные при этом «открытые» кольцевые молекулы ДНК (форма II) устойчивы к действию данного фермента. Как видно из характера диаграммы (рис. 8), ДНКазы лимфоцитов больных и здоровых доноров различаются по скорости гидролиза суперспиральной ДНК и специфичности ко вторичной структуре ДНК, о чем свидетельствует динамика нарастания интенсивности флуоресценции, причем картина образования однонитевых разрывов в ДНК белками фракции 0.4 лимфоцитов от здоровых доноров похожа на картину гидролиза суперспиральной ДНК белками фракции 0.15.
Рис. 9. Кинетика гидролиза ДНК рБЯ 322 белками хроматина лимфоцитов здоровых доноров (а) и больных (б) бронхиальной астмой (фракция 0.4); где !о - интенсивность флуоресценции комплекса ДНК - ДНКаза (момент внесения фермента - 0 мин.); К -интенсивность флуоресценции комплекса ДНК - ДНКаза через время / (масштаб линейный)
5 время, мин.
Больной
_|_1_
1 2 3 4 5 время, ми!
б
а
Рис. 10. Определение Т1/2 (масштаб полулогарифмический); где !о - интенсивность флуоресценции комплекса ДНК - ДНКаза (момент внесения фенрмента - 0 мин.); К -интенсивность флуоресценции комплекса ДНК - ДНКаза через время /; !ор - флуоресценция в условиях, когда все молекулы ДНК открыты; Т1/2 - время, в течение которого половина молекул суперспиральной ДНК получила разрывы; Т1/2 для реакции ДНК с ДНКазой здорового донора - 1.5 мин. (а), Ту2 для реакции ДНК с ДНКазой больного бронхиальной астмой - 0.5 мин. (б)
Для изучения изменения активности ДНКазы фракции 0.4 (скорости гидролиза субстрата) в зависимости от степени тяжести астмы было отобрано 2 группы доноров по 9 человек. В состав группы больных бронхиальной астмой входило: 3 человека с легкой степенью заболевания, 3 человека со средней степенью тяжести заболевания и 3 человека с тяжелым течением болезни. Кинетика скорости гидролиза ДНК рБЯ 322 белками объединенных фракций 0.4 (полученная флуорометрическим методом определения активности эндонуклеаз) представлена на рис. 9. Результаты показали, что в среднем Т1/2 больных равно 53.56 ± 36.29 сек., а здоровых доноров равно 69.17 ± 34.93 сек., т. е. Ту2 больных примерно на 23% ниже, чем здоровых. Следовательно, для образования
Табл. 4
Количественная оценка скорости гидролиза ДНК рБЯ322 (форма I) ДНКазой хроматина суммарной фракции 0.4 больных бронхиальной астмой и здоровых доноров (в сек.)
Кол-во образцов Т1/2 больных БА < < Т1/2 здоровых Кол-во образцов Т1/2 больных БА > > Т1/2 здоровых
1 Тяж. 30 90 1 Лег. 72 52.5
2 ст. 58.5 67.5 2 ст. 140 120
3 16.5 22.5 3 45 30
4 Сред. 45 60
5 ст. 45 60
6 30 120
единичных разрывов в 50% молекул суперспиральной ДНК ДНКазе больных требуется меньше времени, чем ДНКазе клеток здоровых, что говорит о более высокой Мп -зависимой активности в клетках от больных доноров.
Однако среди больных скорость гидролиза ДНК белками-ферментами существенно различалась (табл. 4): в 6 случаях активность ДНКаз больных выше, чем активность здоровых доноров (Т1/2 больных БА < Т1/2 здоровых), в 3 случаях активность ДНКаз здоровых доноров была выше, чем у больных (Т1/2 больных БА > Т1/2 здоровых). При этом активность ДНКазы у двух из 9 больных значительно (в 3-4 раза) превышала активность ДНКазы здорового донора. В четырех случаях ДНКазная активность клеток больных превышала активность ДНКаз клеток здоровых доноров на 30-50%, т. е. установлена положительная корреляция между активностью Мп -зависимой ДНКазы и стадией развития болезни.
Время образования единичных разрывов в 50% молекул ДНК (Т1/2) больных составило (рис. 10) в среднем 0.5 мин., а здоровых доноров - 1.5 мин.
Таким образом, в клетках лимфоцитов больных выявлены две активности: Са , Mg -зависимая и Мп -зависимая ДНКазные активности. Причем в клетках больных выше Мп -зависимая ДНКазная активность, а в клетках здоровых доноров - Са2+, Mg2+-зависимая ДНКазная активность. Особенно выражены эти отличия во фракции белков, связанных с хроматином.
3. Обсуждение
Усилия исследователей при изучении апоптоза позволили в относительно короткий срок (с начала 1990-х гг.) сделать важные открытия при изучении молекулярных механизмов запуска этого процесса [19]. Существенные успехи достигнуты в понимании структуры и функционирования Ба8-рецептора и связанных с ним молекул, факторов, контролирующих апоптоз (Вс1-2, Вах и т. д.) и сериновых протеаз (каспаз) [20]. В то же время не установлена природа эндо-нуклеаз, осуществляющих расщепление ДНК при апоптозе, и не выяснено, каким образом протеолиз, осуществляемый каспазами, приводит к активации этих эндонуклеаз.
Тем не менее роль триггерного механизма, обеспечивающего вступление процесса апоптоза в необратимую стадию, отдают ферменту - эндонуклеазе. Активация эндонуклеазы сопровождается фрагментацией ДНК. Само по себе
это уже неизбежно обеспечивает гибель клетки. Установлено, что активация эдонуклеазы и гибель тимоцитов на раннем этапе зависят от значительного повышения в цитозоле концентрации Са , наибольшее количество которого имело внеклеточное происхождение. В работе [21] утверждается, что для лимфо-идных клеток характерен Са-зависимый путь апоптоза, а увеличение кальция -это фактор, провоцирующий апоптоз в тимоцитах [22] и лимфоцитах [21], и эти данные подтверждаются работой [23], в которой на В-лимфоцитах человека показано, что снижение кальция тормозит апоптоз этих клеток.
По данным литературы в апоптотирующих клетках периферической крови, в том числе в Т-лимфоцитах, определяются, как правило, эндонуклеазы, активируемые ионами Са2+ и Mg2+. Ядра тимоцитов содержат значительные количества Са , Mg -зависимой эндонуклеазы, как полагают, этот энзим активируется глюкокортикоидом. Однако в других Т-клетках, подверженных апоптозу, например, в тимоме 849, где происходит фрагментация ДНК при инкубации с дексаметазоном, эндонуклеаза не определялась. Является ли Са +, Mg +-зависи-мая эндонуклеаза единственным белком [24], синтез которого необходим, или существует множество эндонуклеаз в Т-клетках, необходимых для запуска апоптоза, - не установлено. Таким образом, вопрос об «апоптотических» нук-леазах в клетках периферической крови остается открытым.
Обращает на себя внимание апоптотическая ДНКаза-гамма, обнаруженная и выделенная из ядер тимоцитов крыс. Молекулярная масса фермента - 33 кДа, и для его работы требуются одновременно ионы Са и Мg , причем эта потребность частично подавляется ионами Mn2+ [13].
Учитывая полученные нами экспериментальные данные о снижении в лимфоцитах больных Са2+, Mg2+-зависимой ДНКазной активности, появлении Mn -зависимой ДНКазной активности и данные литературы о роли свободного кальция в апоптозе лимфоцитов, позволим себе высказать предположение, что причиной устойчивости к апоптозу лимфоцитов больных бронхиальной астмой является снижение концентрации внутриклеточного кальция и увеличение содержания ионов марганца, в результате чего запускается механизм активации Mn2+-зависимой эндонуклеазной активности. Это ведет к изменению характера фрагментации ДНК лимфоцитов, и, как следствие, идет нарушение процесса образования апоптотических телец, тем самым тормозится апоптоз лимфоцитов у больных бронхиальной астмой.
Summary
Z.I. Abramova, M.M.D. Nsangou, \V.G. Vinter. The DNAses of the peripheral blood
lymphocytes from patients with bronchial asthma.
We studied the cytoplasmic and nucleic proteins of lymphocytes from healthy donors and patients with bronchial asthma. In the peripheral blood cells of healthy donors undergoing apoptosis, we found a DNAse activated by Ca2+ and Mg2+ ions. Lymphocytes of patients with bronchial asthma contain DNAses, the activity of which depends on the gravity of the disease. In the cells of the patients the activity of the Mn2+-dependent DNAse increases, whereas the activity of the Ca2+, Mg2+-dependent DNase decreases. Taking into consideration the role of the Ca2+, Mg2+-dependent DNAse in apoptosis, we can propose that there is a link
between the reduction of the rate of apoptosis of lymphocytes of patients with bronchial
asthma and the disfunction of the induction of "apoptotical" Ca2+, Mg2+-dependent nuclease.
Литература
1. Новиков B.C. Программированная клеточная гибель. - СПб.: Наука, 1996. - 286 c.
2. Белушкина Н.Н., Хасан Хамад Али, Северин С.Е. Молекулярные основы апоптоза // Вопросы биол. мед. и фарм. химии. - 1998. - № 4. - С. 15-23.
3. ЯриллинА.А., НиконоваМ.Ф., ЯриллинаА.А., и др. Апоптоз, роль в патологии и значимость его оценки в клинико-иммунологическом обследовании больных // Медицинская иммунология. - 2000. - Т. 2, № 1. - С. 7-16.
4. AllesA., Alley K., Barrett J.C. et al. Apoptosis: a general comment // FASEB J. - 1991. -V. 5, No 8. - Р. 2127-2128.
5. Zhougl L., Sarafian T., Kane D. Bcl-2 inhibits death of central neuronalcells induced by multiple agents // Proc. Nat Acad. Sci. USA. - 1993. - V. 90. - Р. 4533-4537.
6. Melis M, Siena L, Pace E, Gjomarkaj M, et al. Fluticasone induces apoptosis in peripheral T-lymphocytes: a comparison between asthmatic and normal subjects // Eur Respir J. - 2002 -V. 19, No 2. - Р. 257-266.
7. Green D.R., Scott D.W. Activation-induced apoptosis in lymphocytes // Curr. Opin. Immunol. - 1994. - V. 6, No 3. - P. 476-487.
8. Szopa J., Adamiec R. Is the 65 kDa protein direct signal for the nuclease release from nuclear matrix, starting the apoptotic cascade? // Acta Bioch. Polonica. - 1993. - V. 40, No 2. - P. 209-212.
9. Deng G., Podac E.R. Deoxyribonuclease induction in apoptotic cytotoxic T lymphocytes // FASEB J. - 1995. - V. 9, No 8. - P. 665-669.
10. Enari M., Sakahira H., Yokoyama H. et al. A caspase-activated DNAse that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD // Nature. - 1998. - V. 391. - P. 43-50.
11. Yakovlev A.G., Wang G., Stoica B.A et al. A role of the Ca2+/Mg2+-dependent endonu-clease in apoptosis and its inhibition by Poly(ADP-ribose) polymerase // J. Biol.Chem. -2000. - V. 275, No 28. - P. 21302-21308.
12. Jang C.Y., Lee J.Y., Kim J. RpS3, a DNA repair endonuclease and ribosomal prottein, is involved in apoptosis // FEBS Lett. - 2004. - V. 560. - P. 81-85.
13. Higami Y., To K., Ohtani H. et al. Involvement of DNAse gamma in apoptotic DNA fragmentation in histiocytic necrotizing lymphadenitis // Virchows Arch. - 2003. -V. 443, No 2. - P. 170-174.
14. Nicoletti I., Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani F, Riccardi C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry // J. Immunol. Methods. - 1991. - V. 139. - P. 271-279.
15. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. - 479 с.
16. Винтер В.Г. Нуклеиновые кислоты опухолевых клеток // Бактериальные нуклеазы и их действие на опухолевый рост. - Казань: Изд-во Казан. ун-та, 1969. - С. 27.
17. Беляева М.И., Зоткина Н.Л., Винтер В.Г. Выделение и некоторые свойства ДНКа-зы хроматина ядер печени крыс // Биохимия. - 1970. - Т. 35. - С. 409-413.
18. Винтер В.Г., Зоткина Н.Л., Зо Сын Ха, Абрамова З.И. Очистка и иммунохимиче-ская характеристика Mn-зависимой ДНКазы хроматина // Биохимия. - 1993. -Т. 58, № 9. - С. 1394-1402.
19. Yoshida H. Machinary of programmed cell death // Nippon Ribsho. - 2005. - V. 63, No 4.- P. 401-406.
20. BoularesA.N., Ren T. Mechanism of acetaminophen-induced apoptosis in cultured cells: roles of caspase-3, DNA fragmentation factor, and the Ca2+ and Mg2+ endonuclease DNAS1L3 // Basic. Clin. Pharmacol. Toxicol. - 2004. - V. 94, No 1. - P. 19-29.
21. Oshimi Y., Miyazaki S. Fas antigen-mediated DNA fragmentation and apoptotic morphologic changes are regulated by elavated cytosolic Ca2+ level // J. Immunol. - 1995. -V. 154, No 2. - P. 599-609.
22. Beaver J.P., Waring P. A decrease in intracellular glutathione concentration precedes the onset of apoptosis in murine thymocytes // Europ. J. Cell. Biol. - 1995. - V. 68, No 1. -P. 47-54.
23. Green D.R., Scott D.W. Activation-induced apoptosis in lymphocytes // Curr. Opin. Immunol. - 1994. - V. 6, No 3. - P. 476-487.
24. King L.B., Vacchio M.S., Ashwell J.D. To be or not to be: mutually antagonistic deas signals regulate thymocyte apoptosis // Intern. Arch. Allergy Immunol. - 1994. - V. 105, No 4. - P. 355-358.
Поступила в редакцию 16.01.06
Абрамова Зинаида Ивановна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии нуклеиновых кислот Казанского государственного университета.
М.М. Дезире Нсангу - аспирант кафедры биохимии Казанского государственного университета.
