CC BY
106
УДК 57.0852
ДЕЙСТВИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА РАЗМНОЖЕНИЕ ДЕКОРАТИВНЫХ ЛУКОВ ПОДРОДА MELANOCROMMYUM В КУЛЬТУРЕ N VITRO
Декоративные луки рода Allium L. подрода Melanocrommyum являются высоко востребованными культурами в ландшафтном озеленении и флористике. Неприхотливость в уходе, засухо- и морозоустойчивость, раннее цветение, разнообразие окрасок, форм и размеров соцветий способствуют их использованию в альпинариях, рокариях, каменистых садиках, групповых посадках и бордюрах. Многие представители подрода являются эндемами Средней Азии и нуждаются в сохранении ex situ [1,2]. Как большинство геофитов, эфемероидные виды подрода Melanocrommyum отличаются низкой природной способностью к воспроизведению и являются объектами технологий размножения in vitro [10]. Чаще всего биотехнологические подходы применяются для размножения экономически важных пищевых видов луков. В качестве эксплантов для введения в культуру in vitro используют различные части луковиц, незрелые соцветия и бутоны, семена. Разработки технологий микроразмножения дикорастущих декоративных видов луков немногочисленны [1,2,12].
Целью настоящей работы является исследование морфогенной реакции экс-плантов, изолированных из луковиц шести видов декоративных луков подрода Melanocrommyum в культуре in vitro под воздействием регуляторов роста.
В качестве объектов исследования использовали виды Allium aflatunense B.Fedtsch, A. altissimum Regel, A. decipiens Fisch. ex Schult, A. karataviense Regel, A. schubertii Zucc., A. sewerzowii Regel, произрастающие на коллекционных участках лабораторий Гербарий и лекарственных растений ЦСБС СО РАН. Отобранные луковицы растений, находящихся в генеративном состоянии, хранили в течение трех месяцев при температуре +5°С. Затем их тщательно отмывали в проточной воде с использованием щетки и Domestos, освобождали от наружной чешуи. Так как степень контаминации луковиц очень высока, было разработано несколько способов стерилизации (табл. 1). После стерилизации луковицы 4-5 раз промывали в стерильной дистиллированной воде по 15 мин и освобождали от наружных запасающих чешуй. Луковички делили на четыре части, каждая из которых содержала почку возобновления, кусочек донца и запасающую чешую. Экспланты помещали на питательные среды Данстена и Шорта (BDS) [4], дополненные регуляторами роста: триапентино-лом (ТП), 6-бензиламинопурином (БАП), кинетином (КН) в различных концентрациях. Для дифференциации использовали среду BDS, дополненную 1мг/л ТП, для
Исследовали действие регуляторов роста (БАП, КН, ТП) на индукцию регенерации побегов 6 декоративных эндемичных видов луков из подрода Melanocrommyum. В качестве эксплантов использовали четвертинки луковиц, содержащих часть донца и почки возобновления. Наилучшие результаты получены для А. aflatunense и A. кarataviense на индукционной среде БЭЯ, содержащей 4.8 мг/л ТП. Установлено, что скорость размножения зависит от генотипа растений и используемых регуляторов роста.
E-mail: tanitall @mail.ru
Ключевые слова: подрод Melanocrommyum, декоративные эндемичные луки, культура in vitro, регуляторы роста.
Введение
Материалы и методы
укоренения - БББ, содержащую 50 г/л сахарозы, 2 г/л активированного угля и 1 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК). Условия культивирования: 25±1°С при 16/8 фотопериоде и освещении холодно-белыми флуоресцентными лампами 4000 лк. Опыты проводили в пятикратной повторности.
Таблица 1
Влияние способа стеризации на жизнеспособность эксплантов
A. altissimum, n=io
Стерилизующий Концентрация Экспозиция Доля эксплантов, %
раствор инфицированных жизнеспособных
Этиловый спирт 70% 40-50 сек
Сулема 0,2% 20-25 м и н 47% 53%
Перекись водорода 30% 7-іО мин
Сулема 0,2% і0-і5 м и н 93% 7%
Перманганат калия 2% 30 мин
Этиловый спирт 70% 40-50 сек
Сулема 0,2% 20-25 мин 3% 97%
Результаты и обсуждение
Хранение луковиц в течение трех месяцев при пониженной температуре позволило преодолеть летний покой, который характерен для луков после цветения [3].
Разработанные нами схемы ступенчатой стерилизации на модельном виде A. altissimum показали различный выход стерильных эксплантов (табл. 1). Наиболее эффективным оказался способ с использованием растворов перманганата калия, спирта и сулемы (97% стерильных эксплантов). Эту схему использовали для стерилизации луковиц всех изучаемых видов.
При культивировании в течение двух недель на поверхности срезов у некоторых эксплантов наблюдали интенсивное деление клеток и образование неморфогенной рыхлой каллусной ткани. Каллус формировался у эксплантов A. altissimum, A. decipiens, A. schubertii, A. sewerzowii на среде BDS, дополненной 4,8 мг/л ТП. В то время как у A. karataviense и A. aflatunense под воздействием этого же регулятора роста наблюдалась максимальная регенерация побегов (3,6 шт. и 2,8 шт. соответственно), минуя стадию каллусообразования (табл. 2). КН в концентрации 1 мг/л вызывал каллусообразование у A. sewerzowii и A. karataviense, увеличение концентрации этого цитокинина до 2 мг/л стимулировало прямой органогенез побегов (геммо-генез) у всех исследуемых видов. При использовании БАП в концентрации 3 мг/л слабый морфогенный ответ наблюдали только у A. decipiens (рис.1,б). У всех исследуемых видов лука отмечено образование почек на среде BDS, дополненной 2 мг/л КН (табл. 2, рис. 1, а, г).
Полученные данные показывают видоспецифичность морфогенетической реакции эксплантов на действие регуляторов роста (табл.2, рис.1). Успешность использования цитокининов без добавления ауксинов для стимуляции побегообразования, показана в ряде работ по клональному микроразмножению представителей рода Allium [5]. Из двух используемых нами цитокининов, наиболее эффективным оказался КН в концентрации 2 мг/л, что согласуется с данными, полученными при размножении in vitro A.cepa, A.tuberosum, A. ampeloprasum [6,8,9,11]. Интересные результаты получены при изучении действия 4.8 мг/л ТП на индукцию побегов: у ряда видов (A. schubertii, A. sewerzowii, A. decipiens, А. altissimum) наблюдали образование каллуса, в то время как у А. aflatunense и A. karataviense показана стимуляция способности к прямой регенерации путем геммогенеза. ТП, являющийся ретардантом, используют в технологиях микроразмножения для лучшей адаптации микроклонов ex vitro [7]. Эффективность этого соединения для стимуляции регенерации побегов из частей луковиц, содержащих кусочки донца и почек возобновления, нами выявлена впервые. Важно заметить, что на запасающих чешуях изучаемых видов, как органов с дифференцированными тканями, образовывался только неморфогенный кал-
лус. Способность к регенерации почек и луковиц проявили интенсивно растущие ткани донца и почек возобновления при воздействии определенных регуляторов роста в оптимальной концентрации (табл. 2, рис.1).
Таблица 2
Влияние регуляторов роста на регенерацию побегов у декоративных видов луков в культуре in vitro на среде BDS
Вид Регулятор роста Процент эксплантов формирующих побеги Количество побегов на эксплант
А aflatunense 1 мг/л КН 80 1±0.32
2 мг/л КН 60 1±0.45
3 мг/л БАП 0
4.8 мг/л ТП 100 2.8±0.37
А. altissimum 1 мг/л КН 60 1±0.45
2 мг/л КН 100 2.6±0.51
3 мг/л БАП 0 -
4.8 мг/л ТП 0
A. decipiens 1 мг/л КН 80 1.2±0.37
2 мг/л КН 80 2±0.71
3 мг/л БАП 80 0.8±0.39
4.8 мг/л ТП 0
A. karataviense 1 мг/л КН 0
2 мг/л КН 100 3±0.32
3 мг/л БАП 0 -
4.8 мг/л ТП 100 3.6±2.44
A. schubertii 1 мг/л КН 80 1±0.32
2 мг/л КН 80 1±0.32
3 мг/л БАП 0 -
4.8 мг/л ТП 0
A sewerzowii 1 мг/л КН 0
2 мг/л КН 60 1±0.45
3 мг/л БАП 0
4.8 мг/л ТП 0
- отсутствие морфогенной реакции; * образование каллуса.
Для дифференциации побегов концентрацию ТП в среде BDS снижали до 1 мг/л. Через 4-5 недель культивирования, побеги пересаживали на среду для укоренения, дополненную 50 г/л сахарозы, 2 г/л активированного угля и 1 мг/л ИМК. Повышенное содержание сахарозы способствовало формированию крупных луковичек, которые отделяли через 4-5 недель (рис. 1, д, е). Попытки использования части луковичек как источников эксплантов для следующего цикла микроразмножения не оказались успешными, поскольку, как и в природных условиях, так и в культуре in vitro, после формирования луковицы впадают в покой. Хранение луковиц в стерильных условиях при пониженных температурах (5°С) в течение 2 мес. позволяет преодолеть покой и использовать их в следующем цикле микроразмножения.
Часть луковичек переносили в условия ex vitro, используя в качестве субстрата смесь вермикулита и торфа (1:1). После прохождения покоя в течение двух месяцев при 5°С отмечали отрастание первого листа.
Таким образом, разработанная методика микроразмножения in vitro декоративных эндемичных видов луков подрода Melanocrommyum, позволяет получить из одной луковицы от 3 до 14 луковичек в зависимости от вида за 14-16 недель культивирования, в то время как в природных условиях одна материнская луковица в среднем за год дает 1-3 луковицы-детки.
Рис. 1. Микроразмножение декоративных луков in vitro: индукция почек а) A. karataviense, BDS+ 2 мг/л КН; б) A. decipiens, BDS+ 3 мг/л БАП; в) A. karataviense BDS+ 4,8 мг/л ТП; г) A. decipiens, BDS+ 2 мг/л КН; луковички перед посадкой ex vitro д) A. karataviense;
е) A. decipiens
Заключение
Проведенные исследования выявили видоспецифичность морфогенетического ответа луковичных эксплантов изучаемых объектов на действие регуляторов роста. Из используемых соединений только КН в концентрации 2 мг/л вызывал геммогенез у эксплантов всех изучаемых видов. Наиболее эффективным для стимуляции образования почек у А. aflatunense и A. karataviense оказался ретардант ТП в концентра-
ции 4.8 мг/л, хотя у других видов ТП способствовал каллусообразованию. Полученные микроклоны пополнили коллекцию in vitro редких и эндемичных видов Центрального сибирского ботанического сада СО РАН.
Список литературы
1. Байтулин И.О., Рахимбаев И.Р., Каменецкая И.И. Интродукция и морфогенез дикорастущих луков Казахстана. - Алма-Ата: Наука Казахской ССР, 1986. - 156 с.
2. Каменецкая И.И., Рахимбаев И.Р. Вегетативное размножение лука каратавского в
культуре изолированных тканей// Бюллетень ГБС. - 1984. - Вып. 131. - С. 63-65.
3. Филимонова З.Н. Период летнего покоя у диких луков// Сборник работ аспирантов. Ташкент: Академия наук Узбекской CCP, 1958. - Вып.2. - С. 63-76
4. Dunstan D.I., Short K.C. Shoot production from onion callus tissue culture// Sci Hortic. -1978.- Vol. 9. - Р. 99-110.
5. Gantait S., Mandal N., Das P.K. An Overview on in vitro Culture of Genus Allium// American Journal of Plant Physiology. - 2010. - Vol. 5 (6). - P. 325-337
6. Haque M.S., Wada T., Hattori K. Novel method of rapid micropropagation using cyclic bulblet formation from root tip explants in garlic// Breeding Sci. - 1998. - Vol. 48. - P. 293-299
7. Hazarika B.N. Acclimatization of tissue-cultured plants// Curr. Sci. 2003. Vol. 85. P. 1704-1712.
8. Kahane R., Rancillac M., de la Serve B.T. Long-trem multiplication of onion (Allium cepa L.) by cyclic shoot regeneration in vitro// Plant Cell Tissue Org. Cult. - 1992. -Vol. 28. - P. 281-288.
9. Kamstaityte D., Stanys S. Micropropagation of onion (Allium cepa L.) // Acta Univ.
Latviensis Biol. - 2004. - Vo l. 676. P 173-176
10. Kim K.W., De Hertogh A.A. Tissue culture of ornamental flowering geophytes//Hortic Rev. - 1997. - Vol. 18. - P. 87-169.
11. Pandey R., Chandel K.P.S., Rao R.S. In vitro propagation of Allium tuberosum Rottl. Ex Spreng. by shoot proliferation// Plant Cell Rep. - 1992. - Vol. 11. - P. 211-214.
12. Susek A., Javornik B., Bohanec B. Factors affecting direct organogenesis from flower explants ofAllium giganteum // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 2002. - Vol. 68. - P. 27-33.
EFFECT OF PLANT GROWTH REGULATORS ON THE PROPAGATION OF ORNAMENTAL ONIONS FROM SUBGENUS MEIANOCROMMYUM IN VITRO CULTURE
T.V. Poluboyarova T.I. Novikova
Central Siberian Botanical Garden Siberian Branch Russian Academy of Sciences, Zolotodolinskaya st. 101, Novosibirsk, 630090, Russia
The effect of plant growth regulators 6-benzylaminopurine (BAP), kinetin (KN), triapenthenol (TP) on the induction of shoot regeneration of 6 ornamental endemic species from subgenus Melanocrommyum was evaluated. The quarters of bulbs contained the parts of head-rounding and renewal buds were used as explants. The best results were obtained for А aflatunense and A. karataviense on BDS induction medium supplemented with 4.8 mg l -1TP. The rate of multiplication was found to depend on the plant genotype and plant growth regulators.
e-mail: tanita11 @mail.ru
Key words: subgenus Melanocrommyum, ornamental endemic onions, in vitro cultures, plant growth regulators.
