CC BY
41
Є
Действие липосом и липосомальной формы цефтриаксона на заживление кожной раны у крыс
H. Л. КУРИЛКО1, А. К. КИЯМОВ2, М. А. ИВАНОВА2,
Е. П. ПАШКОВ2, М. Т. АЛЕКСАНДРОВ2, Г. М. СОРОКОУМОВА1, В. И. ШВЕЦ'
' Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова, Москва 2 Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова, Москва
Impact of Liposomes and Ceftriaxone-Entrapped Liposomes on Skin Wound Healing in Rats
N. L. KURILKO, A. K. KIYAMOV, M. A. IVANOVA, E. P. PASHKOV,
M. T. ALEKSANDROV, G. M. SOROKOUMOVA, V. I. SHVETS
M. V. Lomonosov Moscow State Academy of Fine Chemistry Technology, Moscow
I. M. Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow
Получены «пустые» липосомы и липосомальные формы цефтриаксона (ЦТ). Для создания липосом использовали липвды природного происхождения — фосфатидилхолин (ФХ) из сои и холестерин. Оптимизированы условия получения липо-сомальных форм препарата с тем, чтобы содержание антибиотика в липосомах было максимально возможным. Исследована эффективность действия «пустых» липосом и липосомального антибиотика на заживление кожной раны крыс. Гнойную рану создавали на кожной поверхности спинки крысы путём нанесения раны с последующим инфицированием её Б.соИ 109 кл/мл. Лечение раствором антибиотика, «пустыми» липосомами и липосомальным ЦТ начинали через 48 часов. Показано, что применение «пустых» липосом из ФХ способствует более быстрому заживлению рамы по сравнению с контролем и с лечением водным раствором ЦТ. Лечение раны липосомальной формой ЦТ (ФХ/ЦТ) в 2 раза ускоряет заживление ран относительно контроля и водного раствора ЦТ.
Ключевые cAoea: тжная рана крыс, aumcomm, фocфamuдuлxoлuн, цефтриакс-oH.
«Empty» liposomes and ceftriaxone (CT)-entrapped liposomes were developed. Lipids of natural origin, i. e. soybean phosphatidyl choline (PhCh) and cholesterol were used for the design. The conditions for production of the CT-entrapped liposomes were optimized to provide the maximum content of the antibiotic in the liposomes. The effect of the «empty» liposomes and the antibiotic-entrapped liposomes on healing of skin wounds was studied on rats. The wound on the skin surface of the rat back was purulent due to contamination with E.coli (109 cells/ml). The treatment with the antibiotic solution, «empty» liposomes or CT-entrapped liposomes was started in 48 hours. The use of the PhCh «empty» liposomes promoted more rapid healing of the wound vs. the control or the treatment with CT aqueous solution. The treatmen of the wound with the CT-entrapped PhCh liposomes provided 2 times more rapid healing vs. the control or the use of the CT aqueous solution.
Key words: skin wound in rats, liposomes, phosphatidyl choline, ceftriaxone.
Введение
В России ежегодно регистрируется более 12 млн больных с ушибами, ранами, переломами костей верхних и нижних конечностей, что очень часто приводит к развитию гнойныгх процессов. Изменяющиеся представления о раневом процессе, динамичное развитие хирургии и антимикробной химиотерапии постоянно предъявляют новые требования к алгоритмам лечения раневой инфекции [1].
Использование таких препаратов, как мазь Вишневского, ихтиоловая мазь, стрептоцидовая,
© Коллектив авторов, 2009
Адрес для корреспонденции: 117105 Москва, Нагатинская ул., д. 3а. Редакция журнала «Антибиотики и химиотерапия»
тетрациклиновая, фурацилиновая и гентамици-новая мази на жировой основе слабо улучшают процесс лечения. Кроме того, формирование устойчивости микроорганизмов к старым препаратам, широко используемым в клиниках, диктует необходимость внедрения новых групп лекарственных средств с широким спектром активности или создания новыгх форм уже известных лекарственный препаратов [1].
Применение липосом в фармакологии и медицине в настоящее время, пожалуй, наиболее активно развивающееся направление практического их использования. Включение в липосомы известныгх лекарственных препаратов позволяет уменьшить их возможные негативные эффекты,
-е-
e
повышает эффективность действия препаратов за счёт пролонгированного высвобождения лекарств и возможности доставки препарата внутрь клетки микроорганизма, вызывающего развитие заболевания [2]. Для лечения патологических процессов, протекающих в ране, требуется использование комплекса лекарственных средств, активных в отношении определённых микроорганизмов, или же препаратов с широким спектром антимикробного действия, а также средств, регулирующих иммунологическую реактивность организма.
Цефалоспорины в настоящее время занимают важное место при лечении различных инфекций, развившихся в стационаре [3]. В схемах начальной эмпирической терапии инфекций различной локализации предпочтение отдаётся также препаратам цефалоспоринового ряда, таким как: цефазолин (ЦЗ) — антибиотик II поколения, цефоперазон (ЦП) и цефтриаксон (ЦТ) — антибиотики III поколения.
Ранее проведён ряд исследований липо-сомальных форм цефалоспориновых антибиотиков, например, в работе [4] была исследована продолжительность действия липосомального ЦЗ при внутримышечном введении, а авторы другой работы [5] анализировали распределение липосомального ЦЗ в тканях внутренних органов крысы (печени, селезёнки и лёгких), эффективность действия липосомного ЦП на развитие экспериментальной стафилококковой пневмонии оценивали в работе [6], а в работе [7] изучали эффективность ЦП при лечении лёгочной инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa. Во всех перечисленных работах для приготовления липо-сом использовали, как правило, фосфатидилхо-лин (ФХ) и холестерин (Хол) и показано явное преимущество липосомальных форм антибиотиков по сравнению с их растворами.
В литературе отсутствуют данные о создании и исследовании липосомальной формы цефтри-аксона, хотя он широко используется при лечении гнойных инфекций.
Целью данной работы было создание липосомальной формы ЦТ, определение эффективности включения субстанции ЦТ в липосомы и изучение биологического действия липосомального ЦТ на модели гнойной раны на коже крысы.
Материал и методы
В работе использовали цефтриаксон (Лек, Словения), холестерин (Sigma, США), соевый фосфатидилхолин — препарат Lipoid S-100 (Lipoid, Германия). Все растворители х. ч., фирмы Химмед (Россия).
Липосомы получали с помощью экструдера Liposo Fast Basic (Avestin, США), микрошприцов Hamilton (Швейцария) и поли-карбонатных ядерных фильтров (Тензор, Россия) на 200 нм.
Электронные спектры растворов ЦТ и спектр мутности липосом получали на спектрофотометре Bekman DU-7 (США), рН среды измеряли с помощью рН-метра — милливольтметра рН-150 (РИАЛ, Россия).
Липосомы из ФХ и Хол в молярном соотношении (7:3) получали диспергированием липидной пленки в 0,1 М буферном растворе (трис/НС1, рН 7,4) с последующей экструзией дисперсии. Концентрация липидов — 40—80 мг/мл. Концентрации антибиотиков изменялись от 10 до 200 мг/мл.
Отделение свободного ЦТ от включённого в липосомы проводили методом гель-фильтрации на сорбенте Sephadex 0-25 (АтегеИаш Biosciences, США). Определение степени включения ЦТ в липосомы проводили спектрофотометрически при длине волны 272 нм. Коэффициент экстинкции в воде £272=29530 л/моль-см. Растворимость ЦТ в воде — 500 мг/мл [8].
Результаты и обсуждение
При получении липосомального препарата ЦТ, хорошо растворимого в воде, необходимо подобрать концентрацию антибиотика и липидов, а также липидный состав липосом так, чтобы содержание этого антибиотика в липосомах было наибольшим и чтобы высвобождение его из липосом было постепенным, т. е. оптимизировать условия получения липосом. Этому и была посвящена первая часть работы.
Подбор условий получения липосом, содержащих ЦТ, заключался в определении зависимости степени включения антибиотика в липосомы от таких параметров, как:
1) концентрация ЦТ при постоянном составе и концентрации липидов;
2) концентрация липидов при их постоянном составе и при постоянной концентрации ЦТ;
3) липидный состав липосом при постоянных концентрациях ЦТ и липидов.
Зависимость включения ЦТ в липосомы от его концентраций. Дисперсии больших одноламеллярных везикул (БОЛВ) получали путем диспергирования пленки липидов ФХ/Хол (7:3 по молям) 40 мг/мл в 0,1М трис/НС1 буфере (pH 7,4), содержащем ЦТ с последующей экструзией полученной дисперсии через поликарбонатный ядерный фильтр с размером пор 200 нм. В разные пробы добавляли раствор антибиотика различной концентрации. Липосомы отделяли от свободного антибиотика методом гель-фильтрации. Включённый в липосомы антибиотик определяли спектрофотометрически. Зависимость включения антибиотика в липосомы от его концентрации приведена на рис 1. Как видно из полученный данныгх, включение ЦТ растёт при увеличении начальной концентрации антибиотика в растворе. Этот результат вполне понятен, так как молекула ЦТ, имея три функциональные группы, со значениями рКа 3, 3,2 и 4,1 [9], способна ионизироваться при рН 7,4 и представлять собой анион. Как известно, заряженная молекула, хорошо растворимая в воде, плохо преодолевает гидрофобный липидныш бислой, которым окружено внутреннее водное пространство липосом. Таким образом, при формировании липосом содержание ЦТ в водном пространстве липосом тем боль-
О
Рис. 1. Зависимость включения ЦТ в липосомы от его начальной концентрации.
Состав липосом ФХ/Хол 7:3( по молям), начальная концентрация липидов - 40 мг/мл, 0,1М трис НСІ буфер, pH 7,4.
Рис. 2. Изменения оптической плотности дисперсии липосом из ФХ (1) и ФХ/Хол 7:3 (по молям) (2) при добавлении концентрированного раствора ЦТ (Сцт —400 мг/мл) во времени.
ше, чем больше его начальная концентрация в растворе. Однако эффективность включения антибиотика в липосомы не велика и составляет порядка 6%.
Зависимость включения ЦТ от концентрации липидов. Для выбора более оптимального количества липидов определяли зависимость включения ЦТ в липосомы от концентрации липидов.
Образцы липосом были приготовлены с различной концентрацией липидов состава ФХ/Хол 7:3 (по молям) и при постоянной концентрации ЦТ 100 мг/мл с помощью метода описанного выше. Анализ данных по включению ЦТ в липосомы после проведения гель-фильтрации показал, что увеличение концентраций липидов от 40 мг/мл до 80 мг/мл приводит к увеличению включения антибиотика от 6,4 мг/мл (эффективность включения — 6,4%) до 10 мг/мл (эффективность включения — 10%) соответственно. Это объясняется тем, что при увеличении концентрации липидов увеличивается количество липосом, а следовательно, растет и общая доля внутрилипосомного водного пространства, соответственно увеличивается и количество ЦТ, включённого в липосомы [9]. Однако стоит отметить, что количество включённого антибиотика хоть и увеличивается, но не пропорционально увеличению концентрации липидов. Возможно, такой результат объясняется проницаемостью липидного бислоя для ЦТ и постепенной утечкой антибиотика из липосом в процессе гель фильтрации. Поэтому, мы решили определить включение ЦТ в липосомы, состоящие из липидов, которые формируют
более жесткий бислой. Известно [10], что холестерин, располагаясь в жирно-кислотной области бислоя делает, его более жёстким.
Влияние липидного состава липосом на включение ЦТ. Липосомы из ФХ, смеси ФХ/Хол (7:3 по молям) и ФХ/Хол (1:1 по молям) были приготовлены по описанной выше схеме. Результаты исследований по включению ЦТ в липосомы представлены в табл.1.
Полученные данные показывают, что введение холестерина в липидный бислой обеспечивает большее включение ЦТ в липосомы. Однако образец с содержанием Хол 50% (по молям) был нестабилен при хранении и показал меньшее включение антибиотика в липосомы.
Для проверки предположения о том, что липидный бислой является проницаемым для ЦТ и поэтому включение антибиотика в липосомы не велико, и для определения того, насколько долго ЦТ может находиться внутри липосом, мы провели эксперимент по определению «набухаемос-ти» липосом. Такой метод оценки проницаемости липосом был предложен ранее в работе [11]. Для этого к суспензии липосом, оптическая плотность которой составляла 0,20—0,22 при длине волны 450 нм, добавляли раствор антибиотика с концентрацией 400 мг/мл и следили за изменением величины оптической плотности. Динамика изменения значений оптической плотности дисперсии липосом из ФХ и ФХ/Хол (7:3 по молям) при добавлении концентрированного раствора ЦТ представлена на рис. 2. После добавления раствора ЦТ к липосомам наблюдалось резкое понижение оптической плотности,
Таблица 1. Включение ЦТ в липосомы различного липидного состава Слип. трис/ИС! буфер pH 7,4 — 40 мг/мл, Сцт — 100 мг/мл, 0,1 М
Соотношение ФХ:Хол (по молям) 1:0 7:3 1:1
Количество включенного ЦТ, мг/мл 5,6 6,4 3,4
О
Є
Таблица 2. Рост £со//при посеве на твердую среду через 2 и 24 часа после инкубации с различными концентрациями раствора ЦТ и липосомального ЦТ
Препараты Концентрация ЦТ в препарате, мг/мл
G,G6 G,125 G,18 G,25 G,375 G,5
Водный раствор ЦТ:
через 2 ч + + + + — —
через 24 ч + + + + — —
Липосомальный ЦТ:
через 2 ч + + + + — —
через 24 ч + + + — — —
Примечание. Условные обозначения : КОЕисх. - 108 кл/мл, концентрация липосом из ФХ - 1 мг/мл; «+» - наличие роста; «-» - отсутствие роста.
Таблица 3. Изменение площади (в мм2) кожной раны крыс в динамике при лечении различными препаратами
День эксперимента Контроль Раствор ЦТ «Пустые» липосомы Липосомальный ЦТ
1-й 158+8,6 150+11,3 148+7,5 197+10,7
5-й 154+7,2 150+10,5 129+8,4 131+12,1
7-й 120+7,5/ 122+9,4 81+3,1 92+11,7
10-й 77+8,7 92+9,8 39+2,5 41+5,1
14-й 59+7,4 49+7,9 18+1,5 15+3,4
19-й 21+5,2 27+6,1 16+1,3 9,7+1,7
Примечание. Полученные результаты представлены в виде - ±Ax (p=0,95).
что объясняется уменьшением размеров липосом под действием осмоса за счёт выхода воды из липосом, затем наблюдался рост оптической плотности. При сравнении образцов из ФХ и ФХ/Хол можно отметить, что рост оптической плотности был более быстрым в образце из ФХ — 0,0067 ед за 5 мин (0,0015 ед/мин) относительно 0,0015 ед за 5 мин в образце из ФХ/Хол (0,0003 ед/мин), т.е. в 5 раз быстрее. Эта разница в скорости входа ЦТ объясняется тем, что холестерин уплотняет структуру бислоя, что было показано ранее [10]. Из полученных данных можно сделать вывод, что скорость входа/выхода ЦТ в/из липосом зависит от их липидного состава.
Таким образом, по результатам проделанных экспериментов в качестве оптимальных условий для получения липосом с ЦТ можно выбрать следующие параметры: липиды состава ФХ или ФХ/Хол. (7:3 по молям), Слип — 40 мг/мл, Сцт — 80 мг/мл, 0,1 М трис/HCl буфер pH 7,4.
Влияние липосомального ЦТ на бактерии E.coli и заживление инфицированной кожной раны крыс. Антибиотики цефалоспоринового ряда действуют бактерицидно, угнетая синтез клеточной стенки микроорганизмов. In vitro они подавляют рост большинства грамположительных и грамотрицательных бактерий, устойчивы в отношении бета-лактамаз. Они часто используются в медицине, однако при этом антибиотики имеют значительный спектр побочных действий, в том числе аллергические реакции. Включение этих антибиотиков в липосомы, возможно, позволит снизить дозу, увеличить эффективность препаратов за счёт внутриклеточной доставки и пролонгированного действия липосом посредством постепенного их высвобождения в месте инфицирования.
Следующим этапом данной работы было исследование действия липосомального ЦТ на Escherichia coli. Эксперимент проводили следующим образом: в 96-луночный планшет вносили суспензию клеток, затем в лунки добавляли препараты (водный раствор ЦТ и липосомальный ЦТ) в разных концентрациях, содержимое лунок перемешивали и культивировали в термостате при 37°С в течение 24 часов. За состоянием культуры следили, высевая пробы на твердую среду через 2 часа и через сутки после введения препаратов. Результаты опыта по действию ЦТ на E.coli приведены в табл. 2.
При посеве культуры из тех лунок, где к клеткам были добавлены водный раствор ЦТ и его липосомальная форма в концентрации 0,06 и 0,125 мг/мл, наблюдался рост бактерий. В случае, когда в лунке концентрация водного раствора ЦТ составляла 0,18 мг/мл, через 2 часа рост практически не происходил, но посев через сутки показал рост микроорганизмов. Полностью подавление роста E.coli происходило при добавлении водного раствора ЦТ и его ли-посомальной формы в концентрациях 0,375 и 0,5 мг/мл. Наиболее интересным представляется результат, полученный при действии ЦТ в концентрации 0,25 мг/мл: через 2 часа инкубации с раствором и липосомальной формой ЦТ рост бактерий на твердой среде практически не наблюдался, но через сутки посев из ячейки с раствором ЦТ показал рост E.coli, а с липо-сомальным ЦТ — нет. Исходя из этого, можно предположить, что липосомы с ЦТ подавляют рост E.coli в меньшей концентрации, чем нели-посомальный препарат. Возможно, это объясняется пролонгированным действием липо-
-о-
О
Рис. 3. Относительная скорость заживления кожной раны крыс.
Изменение размеров площади раневой поверхности в %
(^заживл. ран (^нач. раны ^кон. раны) /^нач. раны
х 100%, где:
^заживл. ран “ СКороСТЬ Заживления ран, 5нач.раны “ ПЛощадь раны в первый день лечения, Бкон. раны - площадь раны в последний день лечения.
сомальных препаратов за счёт постепенного выхода антибиотика из липосом.
В ходе дальнейших исследований было определено, что концентрация ЦТ 0,5 мг/мл действует и на большее количество клеток (109 кл/мл). Поэтому на заключительном этапе исследований в опытах на животных была выбрана концентрация ЦТ 0,5 мг/мл.
В работе использовали белых крыс массой 300—350 г (четыре группы по 8 животных в каждой группе). Крысам под наркозом состригали шёрстку, затем создавали кожную рану размером приблизительно 15х15 мм и в рану вносили 1 мл суспензии клеток Е.соН (109 кл/мл).
Лечение начинали через сутки после инфицирования раны и проводили следующими препаратами: раствор ЦТ, «пустые» липосомы и липосом-альный ЦТ. Липосомы получали стандартным методом из ФХ.
Препараты наносили на размягчённую под действием вазелинового масла корочку раны и околораневую поверхность кожи 1 раз в сутки в течение 5 дней. На каждую рану препарат наносили в объёме 0,5 мл.
Контрольной группе наносили только вазелиновое масло. Другим группам наносили препараты в следующих концентрациях: ЦТ — 0,5 мг/мл, липосомы ФХ — 1 мг/мл и липосомальный ЦТ (Слип. — 1мг/мл и Сцт — 0,5 мг/мл). За скоростью заживления следили по размерам площади раны в течение 19 дней. Результаты измерения и расчёт площади ран приведены в табл. 3.
Начальные размеры ран в группах различались, поэтому более правильно рассматривать ре-
зультаты эксперимента в % относительно начального размера ран. Данные по скорости заживления ран приведены на рис 3.
Исходя из полученных результатов, стоит отметить, во-первых, что во всех группах заживление ран шло с разной скоростью. С 5-го дня в группе, которую лечили липосомальным ЦТ, сразу заметно уменьшение размеров раны относительно всех других групп. На 7-й день после начала лечения во всех группах крыс, кроме групп, в которых раны промывали водным раствором ЦТ, наблюдалось лучшее заживление, чем в контроле. По итогам 10-го дня можно выделить группу, которую лечили липосомами и липосомальным ЦТ: раны этих животных заживали быстрее, чем в других группах. На 14-й и 19-й дни отмечено, что липосомы и липосомальный ЦТ проявляли больший эффект при заживлении ран, к этому времени размеры ран составляли не более 11 и 5% от начальной площади ран соответственно.
Таким образом, мы видим, что применение «пустых» липосом дает устойчивое улучшение состояния кожной раны, её быстрое заживление и еще лучший результат достигается при применении липосомального ЦТ. Промывание раны раствором ЦТ не приводит к ускорению заживления раны. Ранозаживляющий эффект «пустых» липосом был обнаружен [12] при лечении операционной раны лёгкого и кожи морской свинки. В приведённой работе липосомы животным вводили инъекционно, внутрилёгочно, в мышцу и кожу.
Важно отметить, что нами лечение инфицированной раны кожи крыс проводилось препаратами только в течение 5 дней и заключалось в ежедневном однократном орошении раны раствором или дисперсией препаратов. В результате было отмечено, что ускорение заживления раны при использовании липосом наступает в два раза быстрее, чем в контроле. Можно предположить, что дальнейшие исследования по подбору концентраций препаратов и схем лечения позволят получить еще более значимые результаты.
Заключение
Установлены оптимальные концентрации цефтриаксона и липидов, липидный состав липосом, позволяющие получить липосомальную форму препарата, содержащую максимально возможное количество антибиотика и характеризующуюся его постепенным высвобождением. Исследование действия липосомального антибиотика на рост Е.еоН показало, что липосомальный цефтриаксон подавляет роста микроорганизма при более низких концентрациях, чем водный раствор этого антибиотика. Сравнительное изучение эффективности лечения гнойной раны на коже крыс цефтриаксоном в
-О-
e
свободной и липосомальной формах показало, что заживление раны, обрабатываемой липосомальным препаратом, происходит в два раза быстрее, чем при использовании традиционного водного раствора антибиотика.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гайдуль К. В., Муконин А. А. Раневая инфекция: этиология, диагностика и антимикробная терапия. 2005; 32.
2. Дудниченко А. С, Краснопольский Ю. М., Швец В. И. Липосомаль-ные лекарственные препараты в эксперименте и клинике. Харьков, 2001; 50.
3. Яковлев С. В. Современное значение цефалоспориновых антибиотиков при лечении инфекций в стационаре. Антибиотики и хи-миотер 2001; 46: 5: 4—8.
4. Arakawa E., Imai Y, Kobayashi H. et al. Application of drug-containing liposomes to the duration of the intramuscular absorption of water-soluble drugs in rats. Chem Pharm Bull 1975; 23: 2218—2222.
5. Schiffelers R. M., Storm G., ten Kate M. T. et al. In vivo synergistic interaction of liposome-coencapsulated gentamicin and ceftazidime. J Pharmacol Exper Ther 2001; 298: 1: 369—375.
6. Ротов К. А., Тихонов С. Н. Изучение лечебного эффекта липосо-мальных антибиотиков при деструктивной пневмонии в эксперименте. Антибиотики и химиотер 2005; 50: 6: 8—9.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что липосомальный цефтриаксон можно рассматривать в качестве перспективной формы препарата для лечения воспалительных и раневых процессов.
7. Di Rocco P. H., Nacucchio M. C., Sordelli D. O. et al. The effect of liposomal cefoperazone against Pseudomonas aeruginosa in a granulocytopenic mouse model of acute lung infection. Infection 1992; 20: 6: 360—364.
8. Van Krimpen P. C., Van Bennekom W. P., Bult A. Penicillins and cephalosporins: physicochemical properties and analysis in pharmaceutical and biological matrices. Pharm Weekblad 1987; 9: 1—23.
9. Kirby C., Gregoriadis G. Dehydration-rehydration vesicles: a simple method for high yield drug entrapment in liposomes. Biotechnology
1984; 2: 979—984.
10. Ивков В. Г., Берестовский Г. Н. Липидный бислой биологических мембран. М.: 1982; 224.
11. Mukhopadhyay S., Chakrabarti P. Altered permeability and /3-lactam resistance in a mutant of Mycobacterium smegmatis. Antimicrob Agents Chemother 1997; 8: 1721—1724.
12. Корнилова 3. X., Селищева А. А., Перельман М. И. Влияниие липосом из фосфатидилхолина на регенерацию операционной раны лёгкого морской свинки. Бюлл экспер биол мед 2001; 6: 2: 228—231.
