CC BY
88
Химия растительного сырья. 2011. №4. С. 19-23.
УДК 547.458.84:57.083.13:577.175.6 ДЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТОВ НА СОЛОМУ ЗЛАКОВ
© М. Ф. Борисенков1, А.А. Шубаков1, Л. С. Кочева2, А.П. Карманов3
1 Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, ул. Первомайская, 50, Сыктывкар, 167982 (Россия), e-mail: [email protected]
2Сыктывкарский государственный университет, Октябрьский пр., 55,
Сыктывкар, 167001 (Россия)
3Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, ул. Коммунистическая, 28, Сыктывкар, 167982 (Россия)
В результате ферментативной обработки соломы злаков целловиридином ГЗх, а также твердофазного ее культивирования с мицелиальнымгрибом Trichoderma viride ВКПМ 13/10 получены лигноуглеводные комплексы, из которых выделены лигнины. После ферментативной обработки in vitro лигноуглеводных комплексов наблюдается увеличение их адсорбирующей способности в отношении прогестерона и антиоксидантной активности выделенных из них лигни-нов на 16,4 и 74,4% соответственно.
Ключевые слова: солома злаков, мицелиальный гриб Trichoderma viride, целловиридин ГЗх, сорбционная способность, прогестерон, лигнин, антиоксидантная активность.
Принятые сокращения: АОА - антиоксидантная активность; ТФК - твердофазное культивирование; ФГ - ферментативный гидролиз; м.с.з. - мелкодисперсная солома злаков; к.с.з. - крупнодисперсная солома злаков; С-ТФК -образец к.с.з. после ТФК; СФГ - образец м.с.з. после ФГ; СФГ-1, СФГ-2, СФГ-5, СФГ-10 - образцы к.с.з. после соответственно 1, 2, 5, 10 сут. ФГ; АФБ - общая целлюлазная активность по осахариванию фильтровальной бумаги; мкМ -микромоль; кКл - килокулон; МКЦ - мелкокристаллическая целлюлоза; РВ - растворимые сахара.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов: РФФИ (проект 04-04-96022), Президента РФ для
поддержки ведущих научных школ (НШ-2383.2008.4), президиумаРАН «Фундаментальные науки - медицине»,
а также интеграционнътх проектов, выполняемътх в УрО РАН совместно с СО РАН и ДВО РАН.
Введение
Снижение эффективности антиоксидантной защиты и нарушение баланса половых стероидных гормонов в организме человека являются основными причинами ускоренного старения и развития ассоциированных с возрастом патологий [1]. Растительные полимеры, в частности лигнины, обладают целым рядом уникальных свойств, позволяющих снизить риск развития возрастных заболеваний. Лигнины с большой эффективностью адсорбируют на своей поверхности холестерин [2], поэтому препараты на их основе используются для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний. Ранее нами было показано, что лигноуглеводные комплексы и лигнины, входящие в их состав, обладают высоким сродством к половым стероидным гормонам [3], а также антиоксидантными свойствами [4]. Это дает надежду на то, что в будущем на основе лигнинов и лигноуглеводных комплексов будут получены препараты, относящиеся к классу геро-протекторов с широким спектром физиологического действия. Актуальной задачей исследований в этом направлении является отработка методов избирательного повышения полезных физиологических свойств лигноуглеводных комплексов. Перспективные виды растительного сырья для создания такого рода препаратов - злаковые растения, которые характеризуются высоким содержанием лигнинов.
Цель настоящего исследования - изучение возможности использования ферментного препарата це-ловиридина ГЗх, а также метода твердофазного культивирования мицелиального гриба Trichoderma viride для повышения сорбционной активности лигноуглеводного комплекса и антиоксидантной активности лиг -нинов, входящих в его состав.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Объекты исследования. В исследованиях использовали солому злаков, представленных тремя видами: канареечник тростниковидный (Phalaroides arundinacea), мятлик болотный (Poa palustris) и вейник седеющий (Calamagrostis canescens). Смесь злаков (1 : 1 : 1) измельчали на зерновой лабораторной мельнице ЗЛМ (Россия) до частиц со средними размерами 3-5 мм (крупнодисперсная солома злаков - к.с.з.). При дополнительной обработке к.с.з. на шаровой мельнице КМ-1 (Германия) до порошкообразного состояния получали мелкодисперсную солому злаков (м.с.з.).
Твердофазное культивирование (ТФК) гифомицета Trichoderma viride ВКПМ 13/10 на соломе злаков. ТФК проводили на к.с.з. в металлических лотках (100 * 100 * 12 см), в которые вносили по 7,8 кг простерилизованной соломы слоем высотой 5 см. Субстрат увлажняли до 80% стерильной питательной средой Чапека и обрабатывали 5-суточным посевным материалом мицелиального гриба Trichoderma viride ВКПМ 13/10, выращенного в жидкой среде указанного ниже состава. Лотки закрывали полиэтиленовой пленкой с несколькими отверстиями для аэрации. В ходе ферментации поддерживали влажность 80% путем обработок субстратов стерильной средой Чапека. ТФК проводили в течение 30 сут. при 24 °С. По окончании ТФК были отобраны пробы субстратов и высушены при 60 °С. Навески воздушно-сухих субстратов экстрагировали 0,05 М ацетатным буфером (pH 5,0) при перемешивании в течение 1 ч. После экстракции суспензии были профильтрованы через бумажные фильтры под вакуумом, и в полученных фильтратах определяли содержание растворимых сахаров по методу Нельсона-Сомоджи [5, 6], а также общую целлюлазную активность по осахариванию фильтровальной бумаги (АФБ) [7]. Полученный продукт - С-ТФК промывали ацетатным буфером, высушивали до постоянного веса и анализировали на содержание лигнина. Посевной материал гриба Trichoderma viride ВКПМ 13/10 выращивали в колбах с объемом питательной среды 200 мл при перемешивании (220 об./мин) при 24 °С. Среда имела следующий состав (г/л): глюкоза - 10,0; NH4NO3 - 2,0; KH2PO4 - 1,0; MgSO4x7H2O - 0,5; KCl - 0,5; раствор микроэлементов - 1 мл/100 мл среды. Раствор микроэлементов имел следующий состав (г/л): MnSO4x5H2O - 0,08; CuSO4x5H2O - 0,4; ZnSO4x7H2O - 0,8; Co(NO3)2x6H2O - 0,1; FeSO4x7H2O - 0,1; (NH4)6Mo7O24x4H2O - 0,3; H3BO3 - 0,06; CaCl2x6H2O - 1,0. Исходное значение pH среды составляло 5,0 без дальнейшего регулирования в процессе культивирования.
Обработка соломы злаков ферментным препаратом. Использовали коммерческий ферментный препарат целловиридин ГЗх (Приволжский биохимзавод). В препарате определяли АФБ и ксиланазную активность [8]. За единицу АФБ принимали такое количество фермента, которое освобождало из бумаги «Ватман №1» 1 мкМ эквивалентов глюкозы за 1 ч. За единицу активности ксиланазы принимали такое количество фермента, которое освобождало из ксилана («Serva», Германия) 1 мкМ эквивалентов ксилозы за 1 мин. Ферментативный гидролиз мелкодисперсной соломы злаков проводили в течение 1 сут. при комнатной температуре (20 °С). В пластмассовые лотки вносили по 100 г м.с.з., заливали 1900 мл ацетатного буфера (pH 5,0) с растворенным целловиридином в концентрации 52,6 мг/мл. Смеси тщательно перемешивали и после 1 сут. аликвоты смесей фильтровали через бумажные фильтры под вакуумом. В фильтратах определяли содержание растворимых сахаров, а образцы промывали ацетатным буфером и высушивали. Объединенный препарат - СФГ анализировали на содержание лигнина и сорбционную способность. В другой серии экспериментов проводили ферментативный гидролиз крупнодисперсной соломы. В колбы вносили по 1 г к.с.з., заливали 19 мл ацетатного буфера (pH 5,0) с растворенным целловиридином в концентрации 3,7 мг/мл. После тщательного перемешивания смесей колбы инкубировали в статических условиях при комнатной температуре (20 °С). Через 1, 2, 5 и 10 сут. содержимое колб фильтровали через бумажные фильтры под вакуумом. В фильтратах находили содержание растворимых сахаров, а субстраты промывали ацетатным буфером и высушивали. Таким образом, получены образцы СФГ-1, СФГ-2, СФГ-5 и СФГ-10.
Определение сорбционной активности образцов по отношению к прогестерону в условиях in vitro. В пробирки добавляли прогестерон до конечной концентрации 3,5-3,7 нг/мл, 300 мг препарата и 5 мл 0,05 М фосфатного буфера (pH 7,4) с 0,1% бычьим сывороточным альбумином. Суспензию инкубировали при интенсивном встряхивании на шейкере в течение 30 мин при комнатной температуре. После окончания инкубации препарат осаждали центрифугированием при 3000 об./мин. В надосадочном растворе определяли содержание прогестерона иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов фирмы «АлкорБио» (СПб.) и вычисляли его количество, которое было адсорбировано исследуемым препаратом. Сорбционную активность препаратов выражали в процентах адсорбции гормона, приняв за 100% общее количество гормона в инкубационной среде.
Выделение лигнинов и приготовление их водных растворов. Содержание лигнина в субстратах до и после биообработки определяли по методу Комарова, а выделяли по методу Пеппера [9]. Водные растворы лигнинов готовили, как описано в работе [11]. Навеску диоксанлигнина массой 1 г заливали 40 мл
0,1 н NaOH и выдерживали в течение 1 ч, затем добавляли 40 мл воды и 4 г катионообменной смолы КУ-2. Процесс проводили при перемешивании на магнитной мешалке и при постоянном контроле величины pH с помощью рН-метра до достижения pH 7,0, после чего смолу отфильтровывали на бумажном фильтре «синяя лента» и получали прозрачный раствор лигнина.
Определение антиоксидантной активности. Антиоксидантную активность (АОА) лигнинов определяли методом кулонометрического титрования [10] с использованием кулонометра «Эксперт-006» фирмы «Эконикс-Эксперт» (Москва). АОА лигнинов (количество электричества Q, затрачиваемое на титрование единицы массы исследуемого вещества) рассчитывали по формуле Q = (100xIxt) / 100хУал, где I - сила тока, a; t - время достижения конечной точки титрования, с; Уал - объем аликвоты, мл. АОА выражали в килокулонах на 100 г вещества (кКл/100 г).
Результаты и их обсуждение
Влияние ферментативной обработки на состав лигноуглеводных комплексов. Выбранные методы биообработки соломы - ферментативный гидролиз препаратом целовиридином ГЗх и ТФК гифоми-цета Trichoderma viride ВКПМ 13/10 затрагивают, в первую очередь, целлюлозные и гемицеллюлозные компоненты растительной ткани. Можно ожидать, что биохимическое воздействие на клеточные оболочки приведет к увеличению в субстрате содержания лигнина, его сорбционной поверхности и активированию функциональных групп.
После 30 сут. выращивания T. viride 13/10 на крупнодисперсной соломе злаков (к.с.з.) содержание растворимых сахаров в фильтрате составляет 0,8+0,1 г/л, а общая целлюлазная активность по АФБ -270,8+20,4 ед./мл. Доля лигнина увеличивается от 19,1% в исходной к.с.з. до 22,6% через 30 сут. ТФК. В результате ферментации солома приобретает темно-коричневую окраску, характерную для препаратов лигнина. Поскольку содержание лигнина в субстрате возрастает незначительно (табл.), то очевидно, что гриб воздействует в основном на поверхностный слой лигноцеллюлозного комплекса соломы. В таблице представлены данные по содержанию лигнина в препаратах до и после ферментативного гидролиза и твердофазного культивирования гриба T. viride 13/10 на соломе злаков.
Как известно, целловиридин ГЗх - комплексный ферментный препарат, обладающий высоким уровнем целлюлолитической и низким уровнем лигнинолитической активности. Целловиридин ГЗх катализирует расщепление целлюлозы и способствует разрушению клеточных оболочек. Наряду с ферментами целлюлаз-ного комплекса препарат содержит геммицелюлазы, среди которых большое значение для расщепления ара-биноксиланов злаковых культур имеет ксиланаза. Общая целлюлазная активность целловиридина по АФБ составляет 1036+118 ед./г ферментного препарата (ф.п.), ксиланазная активность - 380+24 ед./г ф.п.
Через 1 сут. после обработки к.с.з. целловиридином масса соломы уменьшилась на 25%, а содержание растворимых сахаров увеличилось от 0,06+0,02 г/л в исходном субстрате до 7,5+0,5 г/л после обработки. При пролонгации ферментативной обработки соломы до 10 сут. содержание растворимых сахаров возросло незначительно, масса соломы уменьшилась также незначительно (на 28%). По-видимому, оптимальное время ферментативного гидролиза соломы составляет 1 сут., в течение которых проявляется основной эффект действия целлюлаз и ксиланаз целловиридина на субстрат. Доля лигнина после ферментативного гидролиза в течение 1, 2, 5 и 10 сут. хотя и ненамного, но последовательно повышалась до 22,5% (табл.).
Характеристика процесса ФГ и ТФК соломы
Препарат Продолжительность обработки, сут. Выход, % Содержание растворимых сахаров, г/л Содержание лигнина, %
Солома 0 100 0,06+0,02 19,1
СФГ 1 65,8 27,8+2,5 25,7
СФГ-1 1 75,0 7,5+0,5 21,9
СФГ-2 2 75,5 7,8+0,6 22,2
СФГ-5 5 74,0 8,1+0,4 22,4
СФГ-10 10 72,0 8,5+0,5 22,5
С-ТФК 30 * 0,8+0,1 22,6
* Не определяли.
В следующей серии экспериментов проводили ферментативный гидролиз мелкодисперсной соломы (м.с.з.) в течение 1 сут. при комнатной температуре. Содержание растворимых сахаров увеличилось от
0,06+0,02 г/л в исходном субстрате до 27,8+2,5 г/л в конце эксперимента. В исходном субстрате и в соломе после ферментативного гидролиза содержание лигнина составило 19,1 и 25,7% соответственно (табл.). Таким образом, при ферментативном гидролизе мелкодисперсной соломы наблюдается заметно более существенный прирост (на 6,6%) содержания лигнина в конечном продукте, чем при ФГ крупнодисперсной соломы (на 3,4%).
Влияние ферментативной обработки на сорбционные свойства лигноуглеводных комплексов.
Исходный растительный материал в виде измельченной соломы характеризуется достаточно высокой адсорбцией прогестерона (68%; рис. 1) в выбранных условиях эксперимента. Ферментативная обработка приводит к дальнейшему увеличению величины адсорбции, что обусловлено, как показывает сравнительный анализ полученных данных, не только простым повышением содержания лигнина. Так, обработка м.с.з. целловиридином ГЗх (препарат СФГ) увеличивает сорбционную способность на 5,8% (рис. 1), хотя в этом препарате содержание лигнина наибольшее (табл.). Как показали измерения, наибольший прирост адсорбирующей активности в отношении прогестерона (на 16,4%) наблюдается после твердофазной обработки к.с.з. злаков грибом Т. уігіСє 13/10. Очевидно, что на сорбционную способность препаратов влияет не только уровень лигнификации, но и качественное состояние лигноуглеводного комплекса в целом. Для сравнения на рисунке 1 приведен показатель адсорбции прогестерона на чистой целлюлозе, точнее, на МКЦ, который составил 15,9%. Эти результаты согласуются с представленными ранее данными [3] о слабой адсорбирующей способности целлюлозы. Повышение адсорбции прогестерона на лигноуглеводных препаратах, полученных в результате обработки соломы злаков целловиридином ГЗх и твердофазного культивирования Т. уігіСє 13/10 на соломе, по-видимому, обусловлено происходящим при этом высвобождением дополнительного количества активных кислородсодержащих функциональных групп - СООН, ОНфен., следствием чего является увеличение сорбционной способности.
Влияние ферментативной обработки на антиоксидантную активность лигнинов. Ранее нами было установлено, что лигнины обладают антиоксидантной активностью [4]. Причем АОА лигнинов изменяется в широких пределах в зависимости от растительного сырья, из которого они получены, и метода их выделения. Как показали исследования, ферментативная обработка оказывает влияние на АОА лигнинов. Препарат лигнина, выделенный из исходной соломы, обладает умеренной антиоксидантной активностью (41,7+4,2 кКл/100 г). Твердофазная ферментация соломы грибом Т. уігіСє 13/10 приводит к заметному снижению (на 27%) АОА содержащегося в ней лигнина (рис. 2). Ферментативный гидролиз соломы целловиридином ГЗх, напротив, приводит к значительному увеличению АОА лигнина, выделенного из обработанного препарата (на 74,4%).
100
90
80
70
* 60 к 5
ю 50 а о
5 40
30 20 10 0
С С-ТФК С-ФГ МКЦ
90 80 70 § 60 я 50 , 40 5? 30 20 10 0
Рис. 1. Сорбционная активность препаратов по отношению к прогестерону: С - препарат соломы злаков; С-ТФК - препарат соломы, обработанный Т. уігісіг ВКПМ 13/10; СФГ - препарат соломы, обработанный целловиридином ГЗх; МКЦ -препарат микрокристаллической целлюлозы
Рис. 2. Антиоксидантная активность лигнинов. С-Л - препарат, выделенный из исходной соломы; С-ТФК-Л - препарат, выделенный из соломы, обработанной Т. уігіСв ВКПМ 13/10; С-ФГ-Л -препарат, выделенный из соломы, обработанной целловиридином ГЗх
Выводы
1. Ферментативная обработка соломы грибом Trichoderma viride ВКПМ 13/10 приводит к увеличению содержания в ней лигнинов и к повышению на 16,4% сорбционной способности образцов в отношении полового стероидного гормона прогестерона.
2. Антиоксидантная активность лигнина, выделенного из соломы, подвергнутой ферментативному гидролизу целловиридином ГЗх, на 74,4% выше, чем у лигнина, выделенного из необработанной соломы.
Авторы выражают благодарность зав. отделом геоботаники и проблем природовосстановления Учреждения РАН Института биологии Коми НЦ УрО РАН д.б.н. С.В. Дегтевой за определение видового состава злаков.
Список литературы
1. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. СПб., 2003. 468 с.
2. Леванова В.П. Лечебный лигнин. СПб., 1992. 136 с.
3. Борисенков М.Ф., Карманов А.П., Кочева Л.С. Физиологическая роль лигнинов // Успехи геронтологии. 2005. Вып. 17. С. 34-41.
4. Кочева Л.С., Борисенков М.Ф., Карманов А.П., Мишуров В.П., Спирихин Л.В., Монаков Ю.Б. Исследование структуры и антиоксидантных свойств лигнинов пшеницы и овса // Журнал прикладной химии. 2005. Т. 78, №8. С. 1367-1374.
5. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose // J. Biol. Chem. 1944. V. 153. Pp. 375-380.
6. Somogyi M. A new reagent for the determination of sugars // J. Biol. Chem. 1945. V. 160. Pp. 61-68.
7. Родионова H.A., Тиунова H.A., Фениксова P.В. Методы определения целлюлазной активности // Прикл. био-хим. микробиол. 1966. Т. 2, вып. 2. С. 197-205.
8. Ghose T.K., Bisaria V.S. Measurement of hemicellulase activities. Part 1 : Xylanases // Pure. Appl. Chem. 1987. V. 59, N12. Pp. 1739-1752.
9. Pepper J.M., Baylis P.E., Adler E. The isolation and properties of lignin obtained by the acidolysis of spruce and aspen woods in dioxane-water // Can. J. Chem. 1959. V. 37, N8. Pp. 1241-1245.
10. Заявка на патент 2003132741/13 РФ. Способ определения интегральной антиоксидантной емкости продуктов питания и напитков / И.Ф. Абдуллин, Н.Н. Чернышева, Г.К. Зиятдинова, А.А. Лапин // БИ. 2005. №12.
11. Патент 2277099 РФ. Способ получения водорастворимого лигнина / А.П. Карманов, Л.С. Кочева, М.Ф. Борисенков, С.В. Загирова // БИ. 2006. №15.
Поступило в редакцию 5 марта 2011 г.
