CC BY
176
64
Оригинальные исследования
ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИЯ ПИЩЕВОДА НИЗШИХ ПРИМАТОВ
Е.А. Губарева 1, С. Сьоквист2, А.С. Сотниченко 1, МЛ. Лим 2, Н. Фелиу-Торрес 2,
К.А. Даниленко 1, С.В. Орлов 5, С.Н. Чвалун 4, Т.Е. Гоигорьев 4, С.Н. Крашенинников 4,
В.А. Порханов 3, И.С. Поляков 3, Е.В. Куевда 1, И.С. Гуменюк1, П. Маккиарини 12
1 Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар, Россия
2 Каролинский институт, Стокгольм, Швеция
3 Научно-исследовательский институт - Краевая клиническая больница № 1 им. С.В. Очаповского, Краснодар, Россия
4 Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Москва, Россия
5 Научно-исследовательский институт медицинской приматологии РАМН, Адлер, Россия
Non-human primate oesophagus decellularization
E.A. Gubareva 1, S. Sjoqvist2, AS. Sotnichenko 1, Mei Ling Lim 2, N.F. Torres 2, K.A. Danilenko 1,
S.V. Orlov 5, S.N. Chvalun 4, T.E. Grigoriev 4, S.N. Krasheninnikov4, VA. Porhanov 3, I.S. Polaykov 3,
E.V. Kuevda 1, I.S. Gumenyuk 1, P. Macchiarini12
1 Kuban State Medical University, Krasnodar, Russia
2 Karolinska Institute, Stockholm, Sweden
3 S.V. Ochapovsky Scientific Research Institute - Regional Clinical Hospital №1, Krasnodar, Russia
4 National Research Centre «Kurchatov Institute», Moscow, Russia
5 Research Institute of Medical Primatology of RAMS, Adler, Russia
Трансплантация является эффективным методом лечения пациентов, страдающих различными заболеваниями в терминальной стадии, но связана с постоянным недостатком донорских органов и необходимостью пожизненной иммунносупрессивной терапии. Получение тканеинженерных конструкций методом децеллюляризации с последующей рецеллюляризацией может стать альтернативным методом лечения за счет восстановления, замены и регенерации клеток, тканей и органов с нарушенными функциями. Основной целью данного исследования явилось получение децеллюляризированных матриксов пищевода у низших приматов и их последующая патоморфологическая характеристика. Для децеллюляризации пищевода был использован модифицированный детергентно-энзиматический метод с применением дезоксихолата натрия и ДНКазы. Проведенные морфологические исследования подтвердили сохранность архитектоники ткани, отсутствие клеток и ядерного материала. Изучение биомеханических свойств каркаса показало сходные прочностные характеристики нативного и децеллюляризированного образцов, однако, более высокую разрывную деформацию. Полученные результаты позволяют продолжать исследования по изучению возможности использования децеллюляризированного матрикса пищевода низшего примата для рецеллюляризации с последующей дифференцировкой, реваскуляризацией и реиннервацией при проведении гетеро- и ортотопических трансплантаций.
Ключевые слова: тканевая инженерия, пищевод, де-целлюляризация, внеклеточный матрикс, биологический каркас, белки внеклеточного матрикса, биомеханика.
Введение
Во всем мире ежегодно более чем у 500 000 человек диагностируют рак пищевода [1] и по современному прогнозу эта цифра увеличится до 850 000 человек к 2030 г. [2]. Рак пищевода среди злокачественных заболеваний является одним из наиболее агрессивных по течению и неблагоприятных по прогнозу для жизни пациентов. В структуре всех злокачественных заболеваний рак пищевода составляет 3% и занимает 6-е место, среди опухолей желудочно-кишечного тракта — 3-е место (после рака желудка и прямой кишки). Пик заболеваемости приходится на возраст 50—60 лет [3]. Около 30%
е-mail: [email protected]
Transplantation is an effective treatment option for patients suffering from different end-stage diseases; however it is associated with a constant shortage of donor organs and lifelong immunosuppressive therapy. Obtainment of tissuengineered scaffolds using decellularization with the following recellularization may become an alternative treatment option due to restoration, replacement and regeneration of damaged cells, tissues and organs. The main objective of this research is obtainment of decellularized esophagus matrices in non-human primate models followed by pathomorphological evaluation. A modified detergent-enzymatic method involving sodium deoxycholate and DNAse was used for esophagus decellularization. The conducted morphological investigation proved preservation of tissue architectonics as well as absence of cells and nuclear material. Evaluation of biomechanical properties of the scaffold revealed similar mechanical strength characteristics in native and decellularized samples; however, rupturing deformation was higher. The obtained results allow continuing research on the possibility of using decellularized esophagus matrix in non-human primate models for recellularization with the following differentiation, revascularization and reinnervation for hetero- and orthotopic transplantations.
Keywords: tissue engineering, oesophagus, decellularization, extracellular matrix, biological scaffold, extracellular matrices proteins, biomechanics.
пациентов с раком пищевода, а также пациенты с травматическими и врожденными нарушениями (частота встречаемости от 1:2500 до 1:4500 новорожденных) нуждаются в резекции пищевода.
Существуют разнообразные тактики по восстановлению пассажа пищи, в том числе с формированием неопищевода из участка желудка [4], толстого и тонкого отделов кишечника [5]. Однако, данные реконструктивные операции очень сложны, связаны со значительным количеством послеоперационных осложнений [6], а также высокой летальностью [7]. В течение двух лет после подобных операций многие пациенты страдают от дисфагии в результате
Гены & Клетки Том IX, № 4, 2014
Оригинальные исследования
65
образования стриктур и, как правило, нуждаются в повторных эндоскопических вмешательствах для бужирования пищевода [8].
Тканевая инженерия, которая позволяет создавать биологическую конструкцию для замены поврежденного или удаленного органа в лабораторных условиях, обладает огромным потенциалом для улучшения качества жизни таких больных. Кроме того, пациенты, которые сегодня считаются неоперабельными из-за плохого клинического статуса, могут получить шанс на выздоровление.
Предыдущие исследования в области тканевой инженерии пищевода были сосредоточены на применении децеллюляризированного матрикса подслизистой оболочки тонкого отдела кишечника свиньи для пластики пищевода. К сожалению, использование данного материала для замещения пищевода у свиней оказалось безуспешным [9] из-за высокой частоты развития послеоперационных стенозов. Применение децеллюляризированного матрикса подслизистой оболочки тонкого отдела кишечника свиньи оказалось успешным лишь только при замещении им небольших дефектов в нативном пищеводе, в то время как сегментарная имплантация подобного каркаса была неудачной ввиду развивающейся дисфункции пищевода [10]. Также подобный матрикс использовался и у собак. Было показано отсутствие полной эпителизации и регенерации скелетной мускулатуры в трансплантате [11]. R. Ackbar и соавт. (2012) провели успешную децеллюляриза-цию пищевода овец с сохранением его ультраструктуры [12]. Totonelli G и соавт. в 2013 г. опубликовали работу, посвященную созданию децеллюляризиро-ванного пищевода свиньи при помощи детергентэнзиматического метода и изучили ультраструктуру полученного каркаса, успешно показав возможность использования подобного матрикса в тканевой инженерии пищевода [13].
S. Sjoqvist и соавт. (2014) описывают методику создания децеллюляризированного каркаса пищевода крысы, повторяющего архитектонику нативного органа, устойчивого к механическим нагрузкам и индуцирующего васкуляризацию [14]. Засеянные на каркас мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) были способны к спонтанной дифференцировке в эпителио- и мышечноподобные структуры. Рецеллюляризированный каркас использовали для ортотопической трансплантации иммунокомпетентным крысам. Все животные выживали в течение 14 дневного эксперимента с пересаженным графтом верхней трети пищевода. В экспланти-рованных трансплантатах показана регенерация всех основных клеток и тканей пищевода, в том числе эпителия, мышечных волокон, нервов и сосудов.
Тканеинженерная конструкция пищевода, на создание которой направлена данная работа, при успешных доклинических исследованиях, может в будущем спасти жизнь и обеспечить ее высокое качество большому числу пациентов с приобретенными и врожденными заболеваниями пищевода, включая протяженный стеноз, атрезию пищевода, трахео-пищеводные фистулы, ожоги, рак.
Материал и методы
Эксплантация органов
Для создания децеллюляризированного матрикса тканеинженерного пищевода использовали органы
2 мужских особей макак-резус (Macaca mulatta). Все манипуляции с животными осуществляли с соблюдением правил проведения работ с использованием экспериментальных животных (протокол локального этического комитета № 30/1). Материал получили в условиях операционной ГБУЗ «Научно-исследовательский институт — краевая клиническая больница №1 имени профессора С.В. Очаповского» министерства здравоохранения Краснодарского края. Далее пищевод транспортировали в лабораторию в охлажденном растворе PBS -/- (Gibco, Англия) при температуре + 4°С. Время доставки составило не более 2 ч. В стерильных условиях с помощью пинцета и ножниц пищевод отделяли от окружающей его соединительной ткани. Один пищевод децеллюляризи-ровали, а другой использовали в качестве нативного контроля. Для проведения децеллюляризации краниальную и каудальную части пищевода канюлировали пластиковыми катетерами в соответствии с их диаметром. Орган присоединяли к перистальтическому насосу посредством соединительных трубок и помещали в специализированный биореактор ORCA (Harvard Apparatus, США).
Децеллюляризация пищевода
В оригинальном протоколе [14] проводилась де-целлюляризация пищевода крысы детергент-энзима-тическим методом, включающим в себя 2 цикла перфузии органа 4% раствором дезоксихолата натрия с 2000 ЕД ДНК-азы I в течение 30 мин и два цикла перфузии пищевода деионизированной водой также в течение 30 мин, причем во время второго цикла децеллюляризации в деионизированную воду был добавлен 2mM раствор ЭДТА. В завершение ткани пер-фузировали раствором PBS -/- в течение 60 мин.
С целью оптимизации протокола для проведения последующей децеллюляризации пищевода, нами было увеличено время воздействия, состав и порядок перфузии децеллюляризирующими растворами. Таким образом, для децеллюляризации пищевода де-тергент-энзиматическим методом проводили 2 цикла обработки пищевода (деионизированная вода — 1 ч; дезоксихолат натрия 4% + 2mM раствор ЭДТА 1 час; PBS -/— 10 мин; свиная панкреатическая ДНКаза-I 2000 ЕД /200 мл PBS +/+ - 1 ч ), PBS -/- 200 мл -18 ч. Перфузию пищевода осуществляли со скоростью 150 мл/мин. Все растворы были стерильными, комнатной температуры (рис. 1 А, Б).
Патоморфологический анализ
Полученные образцы нативного и децеллю-ляризированного пищевода фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, дегидратировали и заключали в парафин по стандартной методике. С помощью микротома получали срезы толщиной 5 мкм. Для общегистологической оценки препаратов проводили окраску срезов гематоксилином и эозином (Histolab, Швеция). Клеточные ядра визуализировали с использованием флуорофора (4',6-диамидино-2-фенилиндола) DAPI (Sigma-Aldrich, США). Для изучения структуры внеклеточного матрикса (ВКМ) срезы окрашивали по ван Гизону (Histolab, Швеция), трихромом по Массону (Richard-Allan Scientific, США). Изучение микропрепаратов проводилось на микроскопе Olympus BX51 (Япония). Количественное определение содержания ДНК
Гены & Клетки Том IX, № 4, 2014
66
Оригинальные исследования
Количественную оценку содержания ДНК в нативных и децеллюляризированных органах проводили с использованием наборов реактивов (DneasyBlood and Tissue Kit, Qiagen, Швеция) по стандартным протоколам по описанной ранее методике [17]. Исследование материала осуществлялось на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., США).
Оценка биомеханических свойств
Сравнительные биомеханические тесты образцов нативного и децеллюляризированного пищевода проводили на универсальной испытательной машине фирмы «Инстрон» модели 5965 (США). Все испытания проводились в воздушной среде при комнатной температуре, до момента испытания образцы хранились в среде фосфатного буфера при 4°C. Препари-
рованные образцы пищевода (рис. 2 А,Б) растягивали с постоянной скоростью 20 мм/мин в продольном направлении. Начальное расстояние между зажимами составляло 10 мм.
Статистический анализ
Статистическую обработку полученных данных осуществляли методами вариационной статистики на персональном компьютере с использованием программного обеспечения Excel for Office. Полученные результаты выражали в виде средних значений (M) и ошибки среднего (m). При сравнении средних значений изучаемых групп процент возможной ошибки находили по таблице t-критерия Стьюдента для парных сравнений, выражаемый в виде значений достоверности различия — «р», где р<0,05 считалось статистически достоверным.
Рис. 1.
Пищевод низшего примата до (А] и после (Б) проведения децеллюляризации
Рис. 2.
Пример препарирования образца пищевода:
А — исходный вид;
Б — вид перед испытаниями
Результаты
При морфологическом исследовании образцов нативного и децеллюляризированного пищевода было отмечено, что ткани органа после удаления клеток теряли характерный темно-красный цвет и становились молочно-белыми, что характерно для всех децеллюляризированных органов и соотносится с литературными данными [15—21]. Просвет пищевода становился более широким из-за отсутствия мышечной ткани.
Окраска нативных тканей гематоксилином и эозином (рис. 3) показала, что слизистая оболочка органа представлена многослойным плоским неорогове-вающим эпителием, подслизистая основа — рыхлой волокнистой соединительной тканью, мышечная оболочка состоит из циркулярного и продольного слоев мышечной ткани. В препаратах децеллюляри-зированной ткани пищевода не были визуализированы сохранные ядра клеток, стенка пищевода имела характерное пористое строение. Децеллюляризиро-ванная ткань в сравнении с нативной фактически не
окрашивалась как оксифильным, так и базофиль-ным красителями.
Окраски тканей нативного и децеллюляризиро-ванного пищевода по ван Гизону, трихромом по Массону, тропным к соединительнотканным волокнам, в нативной ткани позволила подробнее визуализировать волокна внеклеточного матрикса, их гистоархитектонику и локализацию в пищеводе. Окрашенные соединительнотканные волокна преимущественно локализовались в области базальной мембраны эпителия, в подслизистом, а также в мышечном слоях. В децеллюляризированной ткани внеклеточный матрикс, состоящий преимущественно из коллагена, оставался неизмененным (рис. 4 А—Г). Набухания либо иных патологических изменений структуры, архитектоники, ориентации волокон, тинкториальных свойств соединительной ткани обнаружено не было.
При окрашивании флуорофором DAPI (4',6-ди-амидино-2-фенилиндолом) в парафиновых срезах нативных органов отмечалось интенсивное свечение ядер, в децеллюляризированных — свечение полностью отсутствовало (рис. 4 Д—Е).
Гены & Клетки Том IX, № 4, 2014
Оригинальные исследования
67
Рис. 3.
Пищевод до (А, В) и после (Б, Г) децеллюляризации, парафиновые срезы.
A, Б — эпителиальный и подслизистый слои;
B, Г — мышечный слой. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.х10
Рис. 4. Пищевод до (А, В, Д) и после (Б, Г, Е) децеллюляризации, парафиновые срезы.
Окраска: А,Б — по Ван Гизону;
В, Г — трихромом по Массону;
Д, Е - DAPI
Определение остаточного содержания ДНК — важный этап оценки полученного матрикса после проведенной децеллюляризации. Количественный анализ показал, что содержание ДНК в децеллю-ляризированном пищеводе снижалось до 29% (293,59±27,09 нг/мг в нативном пищеводе и 75,49±7,46 нг/мг — в децеллюляризированном). Полученные результаты свидетельствовали об эффективности децеллюляризации, после которой матрикс был в значительной степени (р = 0,0011) очищен от ядерного материала (рис. 5).
Для более полной и всесторонней морфологической характеристики тканевых структур децеллюля-ризированного матрикса проводили измерение его прочностных свойств при помощи механического тестирования. В результате проведения биомеханических испытаний были получены кривые растяжения в координатах напряжение-деформация. Типичные кривые растяжения приведены на рис. 6.
Из графика следует, что при данных условиях испытаний нативные и децеллюляризированные образцы имеют близкую прочность, однако различаются по модулю упругости и предельной деформации. Кривые растяжения имеют несколько характерных областей: начальная область до 75% характеризуется невысоким модулем упругости, затем наклон резко увеличивается, и наконец, при напряжении 750 МПа образцы начинают разрушаться. Децел-люляризированные образцы имели более низкое значение модуля упругости, но более высокую разрывную деформацию.
400
300
200
100
Нативный Децеллюляризованный
пищевод пищевод
0
Рис. 5. Количественный анализ содержания ДНК в нативной и децеллюляризированной ткани пищевода низшего примата
Гены & Клетки Том IX, № 4, 2014
68
Оригинальные исследования
Нативный пищевод
Рис. 6. Типичные кривые растяжения образцов пищевода вдоль продольной оси
Обсуждение
Имеющийся опыт децеллюляризации пищевода мелких лабораторных животных позволил транслировать данную методику с оптимизацией протокола по времени экспозиции и концентрации децеллюля-ризирующих растворов на наиболее приближенную к клинике модель низших приматов. В ходе проведения децеллюляризации пищевода нами, на основе литературных данных, были выбраны предварительные критерии оценки качества децеллюляризации матриксов, включающие в себя: отсутствие клеток, определяемых различными методами микроскопии; количественный анализ ДНК, указывающий на остатки ядерного материала; биомеханическую прочность матриксов.
Децеллюляризация — это процесс, направленный на удаление клеток из ткани с сохранением внеклеточного матрикса (ВКМ) и трехмерности структуры органа [19, 22], с использованием различных методов воздействия на клетки. Подробное рассмотрение данной проблемы показало, что внеклеточные матриксы обладают всеми характеристиками, необходимыми для создания естественного каркаса тканеинженерного органа или ткани [23].
Перспективы применения децюллюляризирован-ных матриксов определяются выработкой специфичных для каждой ткани методов их получения, и является ключевым моментом комплексной их оценки. Именно поэтому так важен подбор правильного протокола децеллюляризации, при котором сводится к минимуму структурное повреждение, даже в пределах родственных видов тканей. Полученные децел-люляризированные каркасы по данным литературы способны стимулировать клеточную пролиферацию, хемотаксис, ответное ремоделирование тканей, однако, при этом они не должны содержать продуктов деградации клеток, остатков химических детергентов, которыми их обрабатывали [22, 24].
Для проведения децеллюляризации могут использоваться различные методы: физические, ферментативные и химические [22]. Каждый химический агент воздействует на орган определенным образом. При выборе правильной временной экспозиции детергентов, способа децеллюляризации ткани мы учитывали ее анатомо-гистологические особен-
ности, так как неудачно и неправильно выбранный детергент мог привести к разрушению структуры матрикса и потере его механических и биологических свойств. В данной работе также принималось во внимание, что при выборе детергентно-энзима-тического метода для децеллюляризации органа или ткани химический агент повреждает матрикс в той или иной степени, таким образом, важно было ми-нимализировать последствия.
Децеллюляризированные донорские органы не должны содержать клеток, в том числе клеточных компонентов: цитоплазму и ядра. Их присутствие во ВКМ может способствовать нарушению клеточной биосовместимости /n vitro и вызывать побочные реакции в условиях in vivo при последующей рецеллюляризации [24, 25]. Поскольку при методах децеллюляризации невозможно удалить 100% клеток, существуют различные методы количественной оценки оставшихся компонентов клеток, таких как двухцепочечная ДНК, митохондрии или мембран-ассоциированные молекулы, например, фосфолипиды. Пороговая концентрация остаточного клеточного материала в ВКМ, которая может быть достаточной для развития нежелательного эффекта, не была подробно изучена и может изменяться в зависимости от источника ВКМ, типа ткани, в которую он был имплантирован, и иммунной системы реципиента. В настоящее время не определены количественные критерии эффективности децеллюляризации. Анализ современной научной литературы показал, что изучение развития ремоделирующего эффекта и возникновения побочных явлений на клеточном и организменном уровнях, были предложены минимальные критерии для оценки эффективности децеллюляризации [22]. Эти критерии носят феноменологический характер, они были определены на основе многолетнего опыта изучения каркасов тонкой кишки и мочевого пузыря, которые способствовали тканеспецифичному ремоделированию тканей после имплантации. Более поздние работы поставили эти критерии под сомнение, так как менее эффективно децеллюляризированные ткани показывали аналогичные результаты после имплантации при сравнении с эффективно децеллюляризированными тканями. Хотя эти критерии дают много полезной информации, можно утверждать, что они определяют денуклеаризацию тканей, а не децеллюляризацию. Будущие исследования должны расширить знания в этой области, чтобы показать, насколько эффективно клеточно-ассоциированные белки удаляются и какие последствия эти белки оказывают при ответе на имплантацию для расширения нашего понимания адекватности децеллюляризации тканей [26].
При отработке протокола децеллюляризации пищевода низших приматов время экспозиции детергентов и энзимов было увеличено в два раза в сравнении с оригинальным протоколом децеллю-ляризации пищевода крыс [14], так как при меньшем времени воздействия световая микроскопия показывала наличие неразрушенных клеток и клеточных ядер. Увеличение же концентрации децел-люляризирующих растворов напротив приводило к разрушению внеклеточного матрикса с потерей механических свойств, поэтому исходная концентрация изменена не была. С учетом того, что внутриклеточные и мембранные компоненты являются антигенами, которые обладают возможностью инициировать иммунное отторжение при трансплантации [27, 28]
Гены & Клетки Том IX, № 4, 2014
Оригинальные исследования
69
был проведен количественный анализ ДНК в тканях, показавший снижение уровня ДНК в четыре раза по сравнению с исходным количеством.
Полученные данные механического тестирования образцов нативного и децеллюляризированного пищевода, вероятно, служат доказательством того, что в нативном образце прочные коллагеновые волокна погружены в клеточную матрицу, которая, обеспечивает связанность композиционной системы и придает образцу дополнительную жесткость. Большая деформируемость децеллюляризированных образцов пищевода, скорее всего, обусловлена значительным вкладом пластической деформации, при которой несвязанные коллагеновые волокна в условии отсутствия клеток могут легко выпрямляться и скользить друг относительно друга, обеспечивая высокую разрывную деформацию. Таким образом, несмотря на близкую прочность нативных и децеллюляризи-рованных образцов, имеются различия в разрывной деформации, которая повышается после проведенной децеллюляризации.
Заключение
Тканеинженерные конструкции пищевода, полученные методом децеллюляризации и позволяющие создавать участки органа, пригодные для трансплантации, помогут снизить потребность в подобных
ЛИТЕРАТУРА:
1. Wheeler J. B., Reed C. E. Epidemiology of esophageal cancer. Surg. Clin. North Am. 2012; 92: 1077-87.
2. Bloom D., Cafiero E., Jane-Llopis E. et al. The global economic burden of noncommunicable diseases. Program on the Global Demography of Aging; 2012. Report No.: 8712
3. Янкин А.В. Рак пищевода: от статистики к диагностике. Практическая онкология. 2003; 4(2): 61-5.
4. Poghosyan T., Gaujoux S., Chirica M.. et al. Functional disorders and quality of life after esophagectomy and gastric tube reconstruction for cancer. J. Visc. Surg. 2011; 148: 327-35.
5. Cowles R. A., Coran A. G. Gastric transposition in infants and children. Pediatric surgery international. 2010; 26: 1129-34.
6. Smithers B. M., Gotley D. C., Martin I. et al. Comparison of the outcomes between open and minimally invasive esophagectomy. Ann. Surg. 2007; 245: 232-40.
7. Stein H. J., Feith M., Bruecher B. L. et al. Early esophageal cancer: pattern of lymphatic spread and prognostic factors for longterm survival after surgical resection. Ann. Surg. 2005; 242: 566-73.
8. Teoh A. Y. B., Chiu P. W. Y., Wong T. C. L. et al. Functional performance and quality of life in patients with squamous esophageal carcinoma receiving surgery or chemoradiation: results from a randomized trial. Ann. Surg. 2011; 253: 1-5.
9. Doede T, Bondartschuk M, Joerck C. et al. Unsuccessful alloplastic esophageal replacement with porcine small intestinal submucosa. Artif Organs. 2009; 33(4): 328-33
10. Lopes M.F., Cabrita A, Ilharco J. et al. Esophageal replacement in rat using porcine intestinal submucosa as a patch or a tube-shaped graft. Dis Esophagus. 2006; 19(4): 254-9.
11. Tan B., Wei R.Q., Tan M.Y. et al. Tissue engineered esophagus by mesenchymal stem cell seeding for esophageal repair in a canine model. J Surg Res. 2013; 182(1): 40-8.
12. Ackbar R., Ainoedhofer H., Gugatschka M. et al. Decellularized ovine esophageal mucosa for esophageal tissue engineering. Technol Health Care. 2012; 20(3): 215-23.
13. Totonelli G., Maghsoudlou P., Georgiades F.et al. Detergent enzymatic treatment for the development of a natural acellular matrix for oesophageal regeneration. Pediatr Surg Int. 2013; 29(1): 87-95.
14. Sjoqvist S., Jungebluth P., Lim M. L. et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nature communications. 2014; 5: 3562
реконструктивных вмешательствах с высокой степенью риска для пациентов и, как следствие, улучшить прогноз и выживаемость пациентов после операций. При этом разрабатываемые для оценки качества децеллюляризированных матриксов критерии должны быть комплексными и не ограничиваться только параметрами полного удаления клеток, способных вызвать иммунную реакцию отторжения, но и учитывать степень сохранности белков ВКМ, отсутствие токсичности, возможность восстановления биомеханических характеристик, каркас должен не нарушать клеточной адгезии, полностью воссоздавать трехмерную структуру органа, участвовать в клеточной дифференцировке in vivo, стимулировать реваскуляризацию и реиннервацию после трансплантации. Будущие исследования по децеллюляризации и рецеллюляризации пищевода низших приматов расширят представления о патофизиологических механизмах регенерации органов и тканей.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда для проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными группами (номер проекта 14-45-00018 от 15.10.2014 года).
15. Ott H.C., Matthiesen T.S, Goh S.K. et al. Perfusion decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 2008; 14: 213-21.
16. Badylak S.F., Taylor D., Uygun K. Whole-Organ Tissue
Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-
Dimensional Matrix Scaffolds, Annu. Rev. Biomed. 2011; 13: 27-53.
17. Губарева Е.А., Сотниченко А.С., Гилевич И.В. и др. Морфологическая оценка качества децеллюляризации сердца и диафрагмы крыс Гены и клетки. 2012; VII (4): 38-45.
18. Sellaro T.L., Ravindra A.K., Stolz D.B. et al. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 2007; 13(9): 2301-10.
19. Ott H.C, Taylor D., inventors; Regents of the University of Minnesota, assignee. Decellularization and recellularization of organs and tissues. US patent 20090202977. 2009 Aug 13.
20. Wainwright J.M., Czajka C.A., Patel U.B. et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue engineering: Part C; 2010; 16(3): 525-532.
21. Сотниченко А.С., Губарева Е.А., Гилевич И.В. и др. Децел-люляризированный матрикс сердца крысы как основа для создания тканеинженерного сердца. Гены и клетки. 2013; VIII (3): 86-94.
22. Crapo P.M., Gilbert T.W., Badylak S.F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials 2011; 32: 3233-43.
23 Badylak S.F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 2007; 28: 3587-93.
24. Nagata S., Hanayama R., Kawane K. Autoimmunity and the clearance of dead cells. Cell. 2010; 140(5): 619-30.
25. Zhang Q., Raoof M., Chen Y. et al. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature 2010; 464(7285): 104-7.
26. Gilbert T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. 2012. 113(7): 2217-2222.
27. Cooper D.K., Good A.H., Koren E. et al. Identification of alpha-galactosyl and other carbohydrate epitopes that are bound by human anti-pig antibodies: Relevance to discordant xenografting in man. Transpl Immunol. 1993; 1:198-205.
28. Galili U. The alpha-gal epitope (Gal alpha 1-3Gal beta 1-4GlcNAc-R) in enotransplantation. Biochimie. 2001; 83:557-563.
Поступила: 19.10.2014
Гены & Клетки Том IX, № 4, 2014
