CC BY
69
Оригинальные исследования
55
Децеллюляризация как способ предотвращения активации иммунного ответа на аллогенные легочные клапаны сердца
Д.С. Сергеевичев 1, В.В. Сергеевичева 2, А.И. Субботовская1, М.Б.Васильева 1,
А.А. Докучаева 1, А.М. Караськов 1, В.А. Козлов 2
1 Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. академика Е.Н. Мешалкина МЗ РФ, Новосибирск
2 Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск
Decellularization as a prevention of immune response activation to allogeneic pulmonary valves
D.S. Sergeevichev1, V.V. Sergeevicheva 2, A.I. Subbotovskaya 1, M.B. Vasilyeva 1, A.A. Dokuchayeva 1,
A.M. Karaskov1, V.A. Kozlov2
1 E.N. Meshalkin Novosibirsk Research Institute of Circulation Pathology, Novosibirsk
2 Research Institute of Clinical Immunology, SB of the RAMS, Novosibirsk
Изучение механизмов аллореактивности и разработка методов профилактики отторжения трансплантированных органов являются приоритетными задачами клинической иммунологии. Освобождение сосудистых и клапанных протезов от клеточного детрита является эффективным способом снижения их иммуногенности в посттрансплантационный период и, как следствие, продления их функциональной полноценности. Однако ключевые механизмы реализации иммунной реактивности реципиента при имплантации бесклеточных биоматриксов изучены мало.
Нами предложен биоинженерный способ предотвращения активации лимфоцитов в ответ на стимуляцию аллогенными тканями. В данной работе исследовано влияние предимплантационной децеллюляризации клапанов сердца человека на in vitro экспрессию регуляторов активации лимфоцитов CD28 и CD152. Ко-инкубирование мононукле-арных клеток крови с фрагментами нативных аллогенных клапанов сердца приводило к достоверному повышению экспрессии лимфоцитами CD8+28+ с 37,9% до 44,5%, CD8+152+ с 0,3% до22,6%, CD4+28+с 96,4% до 98,4%, CD4+152+с 0,04% до 43,8%, (p<0,05). Аналогичные результаты были получены при ко-культивировании моно-нуклеарных клеток крови с фрагментами криоконсервированных клапанов сердца. Напротив, не было выявлено различий в количественной экспрессии CD28+ и CD152+ Т-лимфоцитами после инкубирования мононуклеарных клеток с децеллюляризованными клапанами в сравнении с контролем, что свидетельствует об отсутствии реакции на бесклеточный аллогенный соединительнотканный матрикс клапанов сердца.
На основании результатов данного исследования с позиций прикладной иммунологии показано трансплантационное преимущество децеллюляризованных клапанных аллопротезов в сравнении с нативными и криоконсервированными, а также выявлены перспективные молекулы-мишени реализации трансплантационного иммунитета, представляющие возможный терапевтический интерес.
Ключевые слова: трансплантационный иммунитет, аллографт, CD28, CTLA-4 (CD152), лимфоциты.
Протезирование и трансплантация клапанов сердца и магистральных сосудов в настоящее время являются обычными способами лечения их необратимой дисфункции. Несмотря на разнообразие вариантов механических, синтетических, биологических
e-mail: [email protected]
The top priority of clinical immunology is the study of alloreactivity mechanisms and development of methods for prevention of transplanted organs rejection. The discharge of vascular and valvular prostheses from a non-functional cellular debris is effective way to reduce their immunogenicity in the post-transplant period and to extend their functional usefulness. Obviously, removal of the maximum amount of HLA-determinants in cell membranes using decellularization should lead to reduction of complication after heart valves allogeneic transplantation. However, the key mechanisms of the immune response during acellular biomatrix implantation are insufficiently studied.
In this study we investigated the influence of preimplantation treatment of human cardiac valves on the in vitro expression of important lymphocytes regulators CD28 and CD152 (CTLA-4). We found a significant rise expression of CD8+28+ from 37,9% to 44,5%, CD8+152+ from 0,3% to 22,6%, CD4+28+ from 96,4% to 98,4% and CD4+152+ from 0,04% to 43,8%, p<0,05 on lymphocytes after cultivation with native valves fragments and valves after cryopreservation, that indicated T-cells activation in the presence of cellular antigens. In contrast, no difference was found in the quantitative expression of CD28 and CD152 on T-lymphocytes after culturing with decellularized valves in comparison with the control, that indicating the absence of T-cell response to allogeneic acellular tissue matrix of the heart valves.
Thus, from the point of applied immunology was shown that transplantation of decellularized allogeneic valve is preferable in comparison with native and cryopreserved grafts. Also identified candidate molecules of the transplantation immunity represent a possible therapeutic interest.
Key words: transplantation immunity, cardiac allograft, CD28, CTLA-4 (CD152), lymphocytes.
и комбинированных протезов, проблема создания «идеального» клапанного либо сосудистого протеза остаётся актуальной задачей биоинженерии [1]. При всех преимуществах биологических клапанов по сравнению с искусственными остаётся нерешённым
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013
56
Оригинальные исследования
вопрос предотвращения динамической биодеградации аллографта после имплантации реципиенту вследствие развития иммуноопосредованного воспаления [2]. Это имеет важное значение в ранние сроки после имплантации, когда само оперативное вмешательство приводит к появлению множества воспалительных медиаторов, что и создает основу для локального воспаления. Основными антигенами в реализации отторжения при имплантации клапанных аллографтов являются их белковые структуры и HLA-комплексы [3, 4]. В то же время, сведений о клеточных реакциях реципиента в ответ на ацеллюлярные соединительнотканные структуры недостаточно. Существуют отдельные публикации, подтверждающие отсутствие индукции гуморального иммунного ответа при трансплантации децеллюля-ризованного клапана [4]. В плане снижения имму-ногенности трансплантата перспективным является способ децеллюляризации графтов и удаление вместе с клеточными элементами максимального количества антигенных детерминант [5, 6].
Значимость сигнального пути CD28/B7 в формировании трансплантационного иммунитета неоспорима и активно изучается. Только при костимуляции CD28 в процессе презентации антигена Т-лимфоцит становится функционально активным, пролиферирует и синтезирует интерлейкин-2. Недостаточная экспрессия CD28 на лимфоцитах, либо конкурентное блокирование рецептора растворимыми формами В7, вызывают анергию Т-лимфоцитов [7].
Роль рецептора CTLA-4 не столь однозначна и в последнее время его изучению посвящено множество исследований [8—10]. Общепринятым считается, что экспрессия CTLA-4 неконститутивна и наблюдается при активации лимфоцитов, а его связывание с В7 на антиген-презентирующих клетках (АПК) приводит к противоположному для CD28 эффекту: ингибированию роста и пролиферации активированных CD4+ и CD8+ лимфоцитов, что рассматривается как механизм негативной регуляции иммунного ответа и поддержания толерантности иммунитета. Механизм этого процесса точно не установлен. Предположительно, происходит нарушение процессов распознавания Т-клеточными рецепторами чужеродного пептида или взаимодействие ко-стимуляторных молекул (CD28, CD80, CD86), либо активируется супрессорная функция T-регуляторных лимфоцитов.
Понимание реализации этих механизмов и их терапевтическая коррекция может стать клинически значимым подходом в индукции аллотолерантности реципиента при трансплантации органов. Поэтому цель нашего исследования заключалась в сравнительном исследовании способности аллоантигенных структур клапана сердца индуцировать экспрессию активационных молекул лимфоцитов в аллогенной системе мононуклеарных клеток (МНК) in vitro до и после децеллюляризации.
Материал и методы
Проведение исследований было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «ННИИПК им. акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России.
Легочные клапаны сердца (ЛК) были выделены из трупного материала с помощью метода прецизионной микродиссекции с использованием «чистого», но не стерильного способа забора. Время теплой
ишемии составляло менее 12 ч, общий период отсутствия кровообращения не превышал 18 ч. Критерии забора тканей, противопоказания к применению и условия выбраковки были определены согласно рекомендациям Европейского Банка Тканей [11].
Клапаны первой группы (нативные, n = 5) хранились 14 сут. в питательной среде RPMI 1640 (Био-лот, Россия) с добавлением цитотоксических дозировок антибиотиков широкого спектра действия. ЛК второй группы (криосохраненные, n = 4) были помещены в индивидуальные полимерные криопакеты в растворе, содержащем RPMI 1640, 10% ДМСО (Sigma, США), 1% альбумина человека (Микроген, Россия) и 10000 ед. гепарина (Синтез, Россия). С помощью градиентной заморозки клапаны сердца были криоконсервированы и хранились 2 нед. при -150°С. Непосредственно перед началом эксперимента ткани были разморожены на водяной бане и трижды отмыты от криопротектора в фосфатном буфере ex tempore. Третья группа клапанов (n = 5) была децеллюляризована согласно методике, предложенной М.Б. Васильевой (2012) с модификациями Д.С. Сергеевичева (2013) с последующим микроскопическим контролем эффективности де-целлюляризации [12, 13].
Гистологический контроль ЛК осуществлялся до и после децеллюляризации. Фиксацию материала проводили в течение 24 ч в 10% забуференном формалине, гистологическую проводку и подготовку парафиновых блоков — по стандартным методикам. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм были получены с помощью полуавтоматического ротационного микротома Microm HM340 (Carl Zeiss, Германия). Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическую реакцию с антителами к виментину (клон V9) проводили в автоматическом иммуностейнере Ventana Benchmarck XT с системой детекции Ultra View Alkaline Phosphatase Red (Roche, США). Для визуализации и документирования результатов использовали микроскоп Axioskop 40FL с видеокамерой Axiocam MRc и комплект программного обеспечения Axiovision 4.7 (Carl Zeiss, Германия).
Из краевых участков створок клапанов всех групп методом штампования были получены фрагменты одинакового размера, около 4x4 мм, и помещены в 24-луночный планшет. Мононуклеарные клетки (МНК) были выделены из крови здоровых волонтеров с помощью центрифугирования на градиенте Limpholyte-H (Cedarlane, Канада) по общепринятым методикам.
После отмывки и оценки жизнеспособности, составлявшей более 96%, МНК были перенесены на фрагменты ЛК в 24-луночные планшеты в концентрации 105 кл/лунку с добавлением 2 мл питательной среды, Megacell RPMI 1640 (Sigma, США), содержавшей 10% фетальной сыворотки (Stem Cell, Канада), 50 мМ L-глутамина и 100 мкг гентамицина. В качестве одной контрольной группы (группа
4) были использованы МНК, культивированные без добавления фрагментов ЛК. Для оценки неспецифической функциональной экспрессии мембранных маркеров во второй контрольной группе (группа 5) был использован митоген конканавалин А (conA) в концентрации 10 мкг/мл также без добавления ЛК. Планшеты инкубировали в С02-инкубаторе 72 ч.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013
Оригинальные исследования
57
На 3 сут. МНК из каждой лунки были собраны в отдельные пробирки и дважды отмыты фосфатным буфером. Для исследования популяции Т-лимфо-цитов во взвеси МНК к ним добавляли моноклональные антитела CD4-APC, CD8-APC-A700, CD3-APC-A750, CD45-KrOr CD152-PE, CD28-PC5.5
(Beckman Coulter, США) и инкубировали согласно рекомендациям производителя. Анализ содержания лимфоцитов, несущих маркеры CD4+/CD28 + , CD8+/CD28 + , CD8+/CD152+ и CD4+/CD152 + выполнен с помощью цитофлюориметра Navios и программного обеспечения Kaluza v.1.2 (Beckman Coulter, США).
Полученные данные были обработаны с использованием программы Statistica 8.0 (StatSoft, США). Для всех имеющихся выборок данных проверяли гипотезу нормальности распределения по критерию Шапиро — Вилка. Для оценки статистической значимости различий показателей между группами
использовали U-критерий Манна — Уитни при уровне значимости p<0,05.
Результаты
При микроскопическом анализе гистологических препаратов стенки ЛК после децеллюляризации клеточные элементы (клетки, их фрагменты) не определялись, при этом базальная мембрана была хорошо сохранена и четко визуализирована. Сохранялось нормальное строение, распределение и взаимоориентация волокон соединительнотканного каркаса легочного аллографта. Для иммуногистохимического исследования были использованы антитела к виментину, белку промежуточных филаментов цитоскелета, что позволило более наглядно оценить эффективность децеллюляризации. Остатки клеточных мембран, коньюгированные с красным хромогеном, в небольшом количестве обнаруживались преимущественно в среднем слое (рис.1).
Рис. 1.
Стенка легочного ствола, поперечный срез:
A, В - до децеллюляризации (нативный материал);
Б, Г - после децеллюляризации.
Окраска: А, Б - гематоксилин, эозин;
B, Г - иммуногистохимическая реакция с антителами к виментину. Ув.: х100
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013
58
Оригинальные исследования
При исследовании популяционного состава Т-лимфоцитов различий в экспрессии CD3, CD4 и CD8 в экспериментальных группах 1—3 выявлено не было. Показана закономерно высокая стабильная конститутивная экспрессия CD28 на CD4+ лимфоцитах во всех группах (около 97%), но только треть CD8+ лимфоцитов экспрессировали CD28 в контрольной группе 4 (табл.). Стимуляция conA (контрольная группа 5) достоверно увеличивала экспрессию CD28 как на CD4+ так и CD8+ лимфоцитах, что свидетельствует об их функциональной полноценности и способности отвечать на экзогенные воздействия.
Следует отметить, что экспрессия CTLA-4 CD3+/ CD4+- и CD3+/CD8+-лимфоцитами в контрольной
группе 4 практически отсутствовала (0,04% и 0,3% соответственно), а conA не влиял на его экспрессию (рис. 2). Однако инкубирование МНК доноров с необработанными фрагментами клапанов (группы 1 и 2) через 72 ч приводило к достоверному увеличению экспрессии как CD28, так и CD152 CD4+- и CD8+-лимфоцитами в сравнении с контрольной группой 4. В то же время, если индукция экспрессии CD28 возрастала на несколько процентов (при этом статистически значимо), то экспрессия CD152 увеличивалась на порядок. Следует особенно отметить, что инкубирование МНК с бесклеточными аллогенными тканевыми матриксами не приводило к экспрессии Т-лимфоцитами активационных маркеров CD28 и CD152.
Распределение экспрессии мембранных маркеров на CD3+-лимфоцитах на 3 сут. инкубирования с фрагментами легочного клапана (M±m)
Группа CD4+/CD28+ CD4/CD152+ CD8+/CD28+ CD8+/CD152+
1. Нативный 97,65±0,11* 43,86±0,24* 44,52±0,85* 22,66±1,28*
2. Криосохраненный 98,37±0,24* 40,17±2,27* 43,83±1,18* 24,94±0,14*
3. Децеллюляризованный 96,12±0,33 0,07±0,03 38,31±0,61 0,26±0,14
4. Контроль 96,43±0,09 0,04±0,02 37,89±0,08 0,30±0,05
5. Cona, контроль 98,50±0,21* 0,48±0,21 51,31±1,42* 1,41±0,55
— различия при сравнении с контрольной группой 4 статистически значимы, p<0,05.
А
Б
В
Г
Д
Е
Ж
З
И
К
Рис. 2. Динамика экспрессии CD28 и CD152 маркеров на CD3+/CD4+ (a-e) и CD3+/CD8+ (f-j) лимфоцитах среди различных групп, где:
a, f - группа контроля; b, g - группа со стимуляцией conA; с, h - группа нативных ЛК; d, i - группа криосохраненных ЛК; e, j - группа децеллюляризованных ЛК
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013
Оригинальные исследования
59
Обсуждение
Успехи прикладной биоинженерии могут быть достижимы только при тщательном и детальном понимании антигенных взаимоотношений тканей, клеток иммунного ответа, биоматриксов и синтетических материалов в создаваемой биоинженерной конструкции как на клеточном, так и молекулярном уровне.
Роль постимплантационной воспалительной биодеградации клапана в современной кардиохирургии, возможно, не столь актуальна, так как абсолютная потребность в повторных операциях относительно невелика. Однако имплантация аллографта является хорошо отработанной и клинически эффективной моделью для изучения фундаментальных механизмов формирования дисфункции не только сердечно-сосудистых протезов, но и других тканевых трансплантатов. Механизмы реализации отторжения через антигены систем АВО и HLA известны. Но роль минорных антигенов в стимуляции иммунного ответа в период состояний, сопровождающихся системным воспалительным ответом, до конца не изучена, а способы их профилактики не разработаны.
Значимым механизмом формирования трансплантационного иммунитета является активация CD28/CTLA-4/B7 — рецепторного комплекса на лимфоцитах и АПК [14-16]. Увеличение в культуре доли как CD4+-, так и CD8 + -лимфоцитов, экспрессирующих CD28 и CD152, является отражением активации иммунного ответа. Причём, взаимодействие ко-стимуляторной молекулы CD28 c лигандами В7 (CD80/86) на АПК приводит к активации Т-клеток, а связывание CTLA-4 на лимфоцитах индуцирует Т-клеточную анергию [16]. Превалирование того или иного взаимодействия в процессе презентации антигена может определять исход иммунной реакции: либо формирование клона активных Т-клеток и реализация отторжения, либо формирование толерантности [7]. Показано, что дисбаланс в экспрессии или гиперстимуляции CD28 реализуется как в виде трансплантационных неудач, так и в развитии аутоиммунных заболеваний [17, 18]. Экспрессия маркера негативной регуляции иммунного ответа — CD152 (CTLA-4) — отражает одновременное формирование механизма обратной связи, ограничивающего чрезмерную активацию эффекторных Т-лимфоцитов.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Cornwell K.G., Landsman A., James K.S. et al. Extracellular matrix biomaterial for soft tissue repair. Clin. Podiat. Med. Surg. 2009; 26(4): 507-23.
2. Troost E., Meyns B., Daenen W. et al. Homograft survival after tetralogy of Fallot repair: determinants of accelerated homograft degeneration. Euro. Heart J. 2007; 28(20): 2503-9.
3. Verghese S., Cherian K.M. HLA expression in aortic and pulmonary homografts: effects of cryopreservation. Indian Heart J. 2002; 54(4): 394-8.
4. Bloch O., Golde P., Dohmen P.M. et al. Immune response in patients receiving a bioprosthetic heart valve: lack of response with decellularized valves. Tissue Engineering, Part A 2011; 17(19-20): 2399-405.
5. Lehr E.J., Rayat G.R., Chiu B. et al. Decellularization reduces immunogenicity of sheep pulmonary artery vascular patches. J. Thor. Cardiovasc. Surg. 2011; 141: 1056-62.
Рассматривается ряд механизмов CTLA-4-опосредованного ингибирования иммунного ответа. Рецептор CTLA-4 является членом семейства CD28-активационных молекул, и через конкурентное авид-ное связывание с CD80 и CD86 на АПК CTLA-4 и CD28 реализуют оппозитные влияния на Т-хелперы [19, 20]. Если CD28 конститутивно экспрессируется на мембране лимфоцитов, то CTLA-4 появляется спустя некоторое время после активации лимфоцитов, что и было показано в эксперименте.
В нашем исследовании в качестве комплекса антигенов, стимулирующих иммунный ответ, были использованы фрагменты клапанов сердца. Клеточные мембраны эндотелия, фибробластов и др., в норме находящихся на поверхности и в пространстве соединительнотканного матрикса и несущих детерминанты HLA, являются естественными аллоантигенами для АПК и лимфоцитов реципиента. Поэтому, повышение экспрессии CD4+/CD28 + лимфоцитов реципиента в присутствии клеточного детрита донорского клапана является логичным. Оно отражает формирование аллореактивной популяции лимфоцитов в присутствии АПК, что в условиях in vivo может являться патогенетическим фактором инициации асептического воспаления клапана.
Функциональный антагонизм CD28 и CTLA-4 на Т-лимфоцитах может говорить как о развитии иммунной реакции против аллоантигенов, так и о реализации механизмов, ограничивающих ее в рамках поддержания гомеостаза иммунной системы. Поэтому следует предположить, что в ответ на аллоантиген иммунная система реципиента реализует как аллореактивные, так и толерогенные механизмы формирования иммунного ответа.
Отсутствие достоверной стимуляции активационных Т-клеточных рецепторов CD28 и CTLA-4 при культивировании МНК с бесклеточным клапаном экспериментально обосновывает иммунологическую целесообразность децеллюляризации алло- и ксенобиопротезов для предотвращения их воспалительной деградации после имплантации. В настоящее время изучаются терапевтические эффекты анти-CD28 и анти-CTLA^ моноклональных антител при лечении онкологических и аутоиммунных заболеваний [14, 15, 18]. Использование для регуляции пострансплантационного иммунитета блокаторов рецепторных путей CD28 и CTLA-4 перспективно и представляет несомненный интерес, однако нуждается в дополнительных исследованиях.
6. Zhou J., Fritze O., Schleicher M. et al. Impact of heart valve decellularization on 3-D ultrastructure, immunogenicity and thrombogenicity. Biomaterials 2010; 31(9): 2549-54.
7. Guinan E.C., Gribben J.G., Boussiotis V.A. et al. Pivotal role of the B7: CD28 pathway in transplantation tolerance and tumor immunity. Blood 1994; 84(10): 3261-82.
8. Tsai M.K., Ho H.N., Chien H.F. et al. Multiple negative feedbacks on CD152 expression in allograft tolerance. Transplantation 2005; 79(2): 174-81.
9. Schmidt-Lucke C., Aicher A., Romagnani P. et al. Specific recruitment of CD4+CD25++ regulatory T cells into the allograft in heart transplant recipients. Amer. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2007; 292(5): H2425-31.
10. Duan Z., Zhang Y., Pan F. et al. Association between CTLA4 gene polymorphisms and acute rejection of kidney transplantation: a meta-analysis. Nephrology 2012; 25(6): 996-1002.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013
60
Оригинальные исследования
11. Jashari R., Goffin Y., Vanderkelen A. et al. European homograft bank: twenty years of cardiovascular tissue banking and collaboration with transplant coordination in Europe. Transpl. Proc. 2010; 42: 183-9.
12. Васильева М.Б., Сергеевичев Д.С., Юношев А.С. и др. Морфофункциональная оценка ферментативного и детергентного способов децеллюляризации сердечных аллографтов. Патология кровообращения и кардиохирургия 2012; 2: 77-80.
13. Сергеевичев Д.С., Сергеевичева В.В., Субботовская А.И. и др. Токсическое влияние детергентов на мезенхимальные стромальные клетки человека при заселении графтов. Патология кровообращения и кардиохирургия 2013; 2: 67-71.
14. Alegre M., Fallarino F., Zhou P. et al. Transplantation and the CD28/CTLA4/B7 pathway. Transpl. Proc. 2001; 33(1-2): 209-11.
15. Studer S.M., George M.P., Zhu X. et al. CD28 down-regulation on CD4 T cells is a marker for graft dysfunction in lung transplant recipients. Amer. J. Resp. Crit. Care Med. 2008; 178(7): 765-73.
16. Poirier N, Azimzadeh A.M, Zhang T. et al. Inducing CTLA-4 - dependent immune regulation by selective CD28 blockade promotes regulatory T cells in organ transplantation. Scien. Transl. Med. 2010; 2(17): 17ra10.
17. Dai S.X., Wu G., Zou Y. et al. Balance of CD8+ CD28+ / CD8+ CD28- T lymphocytes is vital for patients with ulcerative colitis. Digest. Dis. Sci. J. 2013; 58(1): 88-96.
18. Kucharska A.M., Gorska E., Wasik M. et al. Altered expression of T lymphocyte surface markers in children with chronic autoimmune thyroiditis. Nat. J. Physiol. Pharm. Pharmacol. 2008; 59, Suppl. 6: 375-82.
19. Greene J.L., Leytze G.M., Emswiler J. et al. Covalent dimerization of CD28/CTLA-4 and oligomerization of CD80/CD86 regulate T cell costimulatory interactions. J. Biol. Chem. 1996; 271(43): 26762-71.
20. Van der Merwe P.A., Bodian D.L., Daenke S. et al. CD80 (B7-1) binds both CD28 and CTLA-4 with a low affinity and very fast kinetics. J. Exper. Med. 1997; 185: 393-403.
Поступила 3009.2013
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013
