CC BY
16
сч со
Детекция тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента у больных апластической анемией и гемобластозами
А.Ф. Рахмани1, Е.А. Михайлова1, И.В. Гальцева1, Ю.О. Давыдова1, Н.М. Капранов1, И.В. Дубинкин1, 2 3, С.М. Куликов1, Т.В. Гапонова1, З.Т. Фидарова1, В.В. Троицкая1, Е.Н. Паровичникова1, В.Г. Савченко1
ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России; Россия, 125167Москва, Новый Зыковский проезд, 4; 2ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России;
Россия, 117997Москва, ул. Островитянова, 1; 3ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России;
Россия, 125993 Москва, ул. Баррикадная, 2/1, стр. 1
Контакты: Анжелика Фаридовна Рахмани [email protected]
® Введение. При развитии иммунологической рефрактерности к трансфузиям донорских тромбоцитов наряду с антитромбоци-тарными (анти-HLA и анти-HPA) аллоантителами, а также специфическими цитотоксическими Т-лимфоцитами могут i— вырабатываться дополнительные маркеры, такие как тромбоцитассоциированные иммуноглобулины (PAIgG/M/A) и компонен-™ ты системы комплемента (PAC3/C4), что может способствовать повышенному разрушению тромбоцитов при трансфузиях rö и усугублять рефрактерность. Эти маркеры можно выявить с помощью двойного окрашивания тромбоцитов в реакции прямой
поверхностной иммунофлуоресценции и последующим детектированием методом проточной цитометрии. ж Цель исследования — изучить дополнительные факторы, усугубляющие течение рефрактерности к трансфузиям донорских
тромбоцитов у больных апластической анемией (AA) и гемобластозами. ^ Материалы и методы. С 9 ноября 2016 г. по 28 апреля 2018 г. в клиниках центра наблюдались 77 больных в возрасте 19—71 года ® (медиана — 36лет), среди них мужчин — 33, женщин — 44. Распределение больных: АА — 47 (61 %); миелодиспластический синдром ^ (МДС) — 10 (13 %); острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) — 20 (26 %). Во всех группах больных проводили определение PAIgG/M/A, PAC3/C4 и сравнительный анализ плотности фиксации по средней интенсивности флуоресценции (СИФ) с помощью двойного окрашивания (CD41a-PE; IgA, M, G-FITC; C3/C4-FITC). Характеристика PAIgG/M/A и PAC3/C4 подробно изучалась в группе ^ больных АА на разных этапах терапии и при развитии рефрактерности к трансфузиям донорских тромбоцитов. В качестве = отрицательного контроля плотности фиксации иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента на тромбоцитах проанализированы данные 28 здоровых доноров.
Результаты. Обнаружено, что СИФ PAIgG/M/А и PAC3/C4 была выше во всех группах больных (АА, МДС, ОМЛ) по сравнению с донорами. В группах больных АА, ОМЛ, МДС выявляется высокая плотность фиксации на поверхности тромбоцитов PAIgM и PAIgА, а также сочетание PAIgM/A, PAIgM/С3/С4 и PAIgА/С3/С4. Постоянная трансфузионная нагрузка сопровождается появлением PAIgА и PAС3, а при развитии аллоиммунизации и рефрактерности к трансфузиям появляются также PAIgM и PAС4. Среди больных АА на фоне постоянной трансфузионной нагрузки с развитием рефрактерности к трансфузиям донорских тромбоцитов, а также при множественных инфекционных осложнениях обнаруживается высокая плотность фиксации PAIgM, PAIgА, а при рецидиве АА наблюдалось повышение СИФ PAС3.
Заключение. В дополнение к применению определенного алгоритма трансфузионной терапии также необходимо осуществлять определение PAIgG/M/A и PAC3/C4 для прогнозирования усиления рефрактерности к трансфузиям донорских тромбоцитов.
Ключевые слова: рефрактерность к трансфузиям донорских тромбоцитов, определение тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента, средняя интенсивность флуоресценции, трансфузия концентратов тромбоцитов
Для цитирования: Рахмани А.Ф., Михайлова Е.А., Гальцева И.В. и др. Детекция тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента у больных апластической анемией и гемобластозами. Онкогематология 2019;14(3):38—51.
DOI: 10.17 650/1818-8346-2019-14-3-38-51
Detection of platelet-associated immunoglobulins and complement system components in patients
with aplastic anemia and hemoblastosis
A.F. Rakhmani1, E.A. Mikhaylova1, I. V. Galtseva1, Yu.O. Davidova1, N.M. Kapranov1, I. V. Dubinkin1,23, S.M. Kulikov1, T. V. Gaponova1, Z.T. Fidarova1, V.V. Troitskaya1, E.N. Parovichnikova1, V.G. Savchenko1
'National Research Center for Hematology, Ministry of Health of Russia; 4 Novyy Zykovskiy Proezd, Moscow 125167, Russia;
2N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of Russia; 1 Ostrovityanova St., Moscow 117997, Russia;
3Russian Medical Academy of Continuing Professional Education, Ministry of Health of Russia; Build 1, 2/1 Barrikadnaya St., Moscow 125993Russia
Background. In addition to anti-HLA-I and anti-HPA-antibodies and specific cytotoxic T-lymphocytes, another cause of immune refractoriness to donor's platelet transfusions could be a platelet-associated different classes immunoglobulins PAIg (G, M, A) and C3/C4-compo-nents of complement system (PAC3, PAC4). These markers can be detected by flow cytofluorometry of double-stained platelets. The fixation density of immunoglobulins and components of complement systems were measured by the mean fluorescence intensity (MFI). Objective: to study additional factors that aggravate the course of refractoriness to donor's platelet transfusions in patients with aplastic anemia (AA) and hemoblastosis.
Materials and methods. 77patients (AA — 47, myelodysplastic syndrome (MDS) — 10, acute myeloid leukemia (AML) — 20) admitted to National Research Centre for Hematology during 11.09.2016—04.28.2018 were enrolled in the study. M/f ratio was 33/44, median age was 36 yrs. (19—71 yrs.). Plasmapheresis and cross-matching for PRP selection were used for patients with refractoriness to donor's platelet transfusion. PAIg (G, M, A) and PAC3/C4 detection and density (MFI) were evaluated in all patients by flow cytofluorometry of double-stained platelets (CD41a-PE; IgA, M, G-FITC; C3/C4-FITC) and MFI measurement. Patients with AA were investigated on different stages of therapy and if refractoriness to donor's platelet transfusion is developed. Blood donors (n = 28) MFI measurement results were established as negative control.
Results. It was found that MFI PAIgG/M/A and PAC3/C4 was higher in all groups of the patients (AA, MDS, AML), as compared with donors. MFI of PAIgM and PAIgA in patients were significant higher than MFI of PAIgG and PAC3/C4. Combination of PAIgM/A, PAIgM/C3/C4 and PAIgA/C3/C4 were more frequent. Multiple transfusions of PRP were associated with PAIgA and PAC3 detection. Development of refractoriness to donor's platelet transfusions was accompanied by alloantibodies (HLA-I, HPA) and PAIgM, PAC4 detection. In patients of AA group during development of refractoriness to donor's platelet transfusions and multiple infection complications the high density of PAIgM and PAIgA were identified. Relapse of AA was accompanied MFI of PAC3 density increment.
Conclusion. In addition to application of a certain transfusion therapy algorithm it is also necessary to detect PAIg (G, M, A) and PAC3/C4 for prediction of severe refractoriness to donor's platelet transfusions.
Key words: refractoriness to donor's platelet transfusions, detection of platelet-associated immunoglobulins and complement system components, mean fluorescence intensity, platelet concentrate transfusion
cv со
ев
сч со
For citation: Rakhmani A.F., Mikhaylova E.A., Galtseva I. V. et al. Detection of platelet-associated immunoglobulins and complement system components in patients with aplastic anemia and hemoblastosis. Onkogematologiya = Oncohematology 2019;14(3):38—51.
Введение
Трансфузии концентратов тромбоцитов (КТ) в настоящее время являются основным эффективным методом профилактики и лечения геморрагических осложнений при глубокой тромбоцитопении у больных с заболеваниями системы крови. Тромбоцитопе-ния, обусловленная необходимостью проведения заместительных трансфузий, развивается в результате различных патогенетических механизмов, а также является следствием цитостатического воздействия лекарственных препаратов [1—3]. Наиболее высокая трансфузионная нагрузка, связанная с применением КТ, наблюдается у пациентов с острыми лейкозами и депрессиями кроветворения, что, в свою очередь, часто приводит к аллоиммунизации антигенами Human Leukocyte Antigen (HLA) класса I (преимущественно HLA-A и HLA-В) и специфическими Human Platelet Antigens (HPA), что влечет к развитию иммунной рефрактерности [4—6]. Трансфузии донорских тромбоцитов у таких пациентов неэффективны и сопряжены с риском развития посттрансфузионных негемолитических реакций различной степени тяжести. Проведение современного программного лечения этой категории больных становится затруднительным, у них чаще развиваются выраженный геморрагический синдром и инфекционные осложнения, что в конечном итоге значительно снижает эффективность лечения и выживаемость больных этой категории. Рефрактерность к трансфузиям донорских тромбоцитов может быть обусловлена как иммунными
факторами (выработка антитромбоцитарных антител (анти-HPA, анти-HLA I класса), фиксация антител и компонентов комплемента на поверхности тромбоцитов, активация цитотоксических Т-лимфоцитов), так и неиммунными факторами (лихорадка, сепсис, пульмонологические заболевания, инфекции, спле-номегалия, синдром диссеминированного внутрисо-судистого свертывания (ДВС-синдром)) [4, 7, 8].
В настоящее время актуальным также является поиск новых дополнительных факторов, способствующих быстрому развитию рефрактерности к трансфузиям донорских тромбоцитов, в том числе тромбоцитас-социированных иммуноглобулинов (platelet-associated immunoglobulins, PAIg) и тромбоцитассоциированных компонентов системы комплемента C3/C4 (platelet-associated complement components, PAC3/C4).
Как описано в литературе, на поверхности тромбоцитов имеются Fc-рецепторы, за счет которых PAIg и PAC3/C4 фиксируются на тромбоцитах больного, что усугубляет течение рефрактерности к проводимой трансфузионной терапии КТ [5, 9, 10]. В основе образования тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента лежит активация тромбоцитов и, вероятно, развитие аутоиммунных процессов, при которых в результате частых трансфузий и длительных воспалительных процессов увеличивается выработка иммуноглобулинов, реагирующих не только с тромбоцитами донора, но и с тромбоцитами реципиента [5, 11, 10]. Одним из современных методов детекции
см со
es
см со
тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента у трансфузи-оннозависимых больных считается проточная ци-тофлуориметрия [12—14]. Метод стал применяться у пациентов с тромбоцитопенией в последние десятилетия и является одним из ведущих методов для идентификации тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов разных классов (IgM, IgG и IgA) и компонентов системы комплемента (C3/C4) [14— 18]. С помощью механизма шеддинга (shed — сход с поверхности клетки) тромбоцитассоциированные иммуноглобулины могут переходить в плазму больного в виде циркулирующих иммунных комплексов или агрегатов иммуноглобулинов и активированных компонентов системы комплемента [19]. Отщепление тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов с мембраны может происходить также при активации и апоптозе тромбоцитов. При трансфузиях тромбоцитов возможен шеддинг гликопротеиновых рецепторов мембраны тромбоцитов [19—21]. В результате формируется порочный круг за счет образования специфических циркулирующих антитромбо-цитарных аллоантител, тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и белков системы комплемента, усиливающих фагоцитоз и апоптоз тромбоцитов. Все это значительно усугубляет рефрактерность и приводит к тяжелым геморрагическим осложнениям [15, 16, 21, 22].
Компонент C3 системы комплемента является ключевым белком острой фазы воспалительного процесса, участвует во всех 3 путях активации системы комплемента, необходим для опсонизации чужеродных
клеток и облегчает фагоцитоз. Компонент C4 системы комплемента участвует только в классическом пути активации комплемента. Классический путь активации системы комплемента подразумевает присутствие комплексов антиген — антитело. Исследование С3-и С4-компонентов системы комплемента используют для диагностики, мониторинга и контроля за эффективностью терапии аутоиммунных заболеваний, для диагностики первичных иммунодефицитов, для оценки иммунного статуса при частых инфекционных осложнениях [15, 17].
Цель исследования — изучить дополнительные факторы, усугубляющие течение рефрактерности к трансфузиям донорских тромбоцитов у больных апластической анемией (АА) и гемобластозами (мие-лодиспластический синдром (МДС) и острый миело-идный лейкоз (ОМЛ)).
Материалы и методы
Исследование носило проспективный характер у пациентов с АА и МДС/ОМЛ в целях выявления плотности фиксации (по средней интенсивности флуоресценции (СИФ) тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента С3/С4 на поверхности тромбоцитов и определения их клинического значения в различных группах больных: до лечения, на фоне лечения, в ремиссии и при рефрактерном течении заболевания, а также при развитии рефрактерности к трансфузиям и при множественных трансфузиях тромбоцитов в анамнезе за период наблюдения с ноября 2016 г. по апрель 2018 г. (рис. 1).
Ноябрь 2016 г./November 207б//0сновные точки исаедования/Main study points/Лпрель 2018 г./April 2018
Группа ОМЛ/МДС
(n = 30)/AML/MDS group (n = 30)
Больные АА до лечения (n = 15)/ AA patients before treatment (n = 15)
Больные АА на фоне ИСТ (n = 12)/AA patients during IST (n = 12)
БольныеАА в ремиссии (n = 12)/ AA patients in remission (n = 12)
w я
Дополнительные точки исследовани
w \
Больные рефрактерной АА
(n = 4)/Patients with refractory AA (n = 4)
Additional study points
T
Больные с рецидивом
АА (n = 15)/Patients with AA relapse (n = 15)
W -4
При развитии рефрактерности к КТ
(n = 14)/In case of PC refractoriness (n = 14)
При множественных трансфузиях КТ
(n = 23)/In case of multiple PC transfusions (n = 23)
L A
Контрольная группа здоровых доноров (n = 28)/Control group of healthy donors (n = 28)
Плотность фиксации (степень MFI - mean fluorescence intensity) PAIg и PAC3/C
I Fixation Density (MFI - mean fluorescence intensity) of PAIg and PAC3/Q4
Рис. 1. Дизайн исследования. АА — апластическая анемия; ОМЛ — острый миелоидный лейкоз; МДС — миелодиспластический синдром; ИСТ — иммуносупрессивная терапия; КТ — концентрат тромбоцитов
Fig. 1. Study design. AA — aplastic anemia; AML — acute myeloid leukemia; MDS — myelodysplastic syndrome; 1ST — immunosuppressive therapy; PC — platelet concentrate
Были выполнены следующие этапы: сформулированы критерии включения больных, подписавших информированное согласие на обследование и лечение, а также об участии в исследовании (табл. 1).
Всем больным при поступлении в НМИЦ гематологии проводили подробное обследование. Диагноз АА устанавливали согласно критериям протокола программного лечения больных АА [1, 23, 24]: трехростко-вая цитопения: анемия (уровень гемоглобина <110 г/л), гранулоцитопения (количество гранулоцитов <2,0 х 109/л), тромбоцитопения (количество тромбоцитов <100 х 109/л); снижение клеточности костного мозга, процент бластных клеток менее 2 % и отсутствие мега-кариоцитов по данным пунктата костного мозга; аплазия костного мозга в биоптатах подвздошной кости при билатеральной трепанобиопсии.
Больным АА проводили программную иммуносу-прессивную терапию, включающую курсы лошадиного антитимоцитарного глобулина в дозе 20 мг/кг/сут в течение 5 дней, длительную терапию циклоспорином А с индивидуальным подбором дозы. Повторный курс иммуносупрессивной терапии антитимоцитарным глобулином выполняли больным при отсутствии
гематологического ответа по всем росткам кроветворения через 3 мес и более от предыдущего. В зависимости от клинико-гематологических критериев различали следующие ответы на иммуносупрессивную терапию [23, 25]:
♦ полная или частичная ремиссия — полная или частичная нормализация показателей гемограммы (уровень гемоглобина >100 г/л, количество гранулоцитов >1,5 х 109/л, количество тромбоцитов >100 х 109/л) и отсутствие потребности в заместительной терапии компонентами донорской крови;
♦ клинико-гематологическое улучшение показателей гемограммы (уровень гемоглобина >80 г/л, количество гранулоцитов >1 х 109/л, количество тромбоцитов >20 х 109/л), исчезновение или значительное уменьшение зависимости от трансфузий компонентами донорской крови.
Рефрактерное течение АА диагностировали в случае отсутствия эффекта от проводимой комбинированной иммуносупрессивной терапии через 6—9 мес от начала лечения.
CV со
es
см со
Таблица 1. Этапы проспективного исследования Table 1. Stages of a prospective study
Точки исследования АА: первичные с единичными трансфузиями компонентов донорской крови или без них с признаками рефрактерности к трансфузиям иммунного генеза с множественными трансфузиями КТ (более 20) ОМЛ и МДС Здоровые доноры (отрицательный контроль)
Study points AML and MDS
primary, with or without single transfusions of donor blood components with immune transfusion refractoriness with multiple PC transfusions (more than 20) iivaimj uuiiui ^uvgainv control)
До лечения (ИСТ) Before treatment (1ST)
После первоначального терапевтического воздействия After initial therapy Однократное
Основные Main В период ремиссии заболевания In disease remission исследование Однократное в дебюте _ исследование заболевания Single investigation A single investigation in disease onset
При рефрактерном течении основного заболевания In case of disease refractoriness
При рецидиве In relapse
Дополнительные Additional При развитии рефрактерности к трансфузиям With transfusions refractoriness development Нет Нет No No
При множественных трансфузиях КТ (более 20) With multiple PC transfusions (more than 20)
Примечание. Здесь и в табл. 2 и 4: АА — апластическая анемия; КТ — концентрат тромбоцитов; ОМЛ — острый миелоидный лейкоз; МДС — миелодиспластический синдром; ИСТ — иммуносупрессивная терапия.
Note. Here and in tables 2 и 4: AA — aplastic anemia; PC — platelet concentrate; AML — acute myeloid leukemia; MDS — myelodysplastic syndrome; 1ST — immunosuppressive therapy.
Таблица 2. Характеристика больных, включенных в проспективный анализ определения тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента С3/С4
Table 2. Characterization of patients included in a prospective analysis of platelet-associated immunoglobulins and C3/C4 complement components detection
Характеристика АА (n = 47) AA (n = 47) МДС (n = 10) MDS (n = 10) ОМЛ (n = 20) AML (n = 20) Доноры (n = 28) Donors (n = 28)
Медиана возраста (диапазон), лет Median of age (range), years 30 (19-64) 48 (22-63) 47 (19-71) 32 (22-46)
Пол, n: Gender, n:
мужской male 21 5 7 21
женский female 26 5 13 7
cv со
cs
см со
■
Диагноз МДС и ОМЛ также устанавливали согласно критериям протоколов лечения пациентов с МДС и ОМЛ [1, 26]. Все больные, включенные в исследование, получали сопроводительную трансфузионную терапию компонентами донорской крови.
В соответствии с заданными критериями в проспективное исследование были включены 77 больных, которые находились на лечении и обследовании в НМИЦ гематологии с 9 ноября 2016 г. по 28 апреля 2018 г. в возрасте 19—71 года (медиана — 36 лет), среди них мужчин — 33, женщин — 44. Распределение больных по нозологическим вариантам было следующим: 47 (61 %) пациентов с АА, 10 (13 %) - с МДС, 20 (26 %) - с ОМЛ (табл. 2).
В качестве отрицательного контроля плотности фиксации тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов комплемента проанализированы данные 28 здоровых доноров в возрасте 22-46 лет (медиана — 32 года), среди них мужчин — 21, женщин - 7. Всего выполнено 178 исследований.
Детекция тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента на поверхности тромбоцитов. Был разработан протокол «Детекция тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента с помощью двойного окрашивания в реакции прямой поверхностной иммунофлуоресценции методом проточной ци-тофлуориметрии». За основу был взят иммунный метод Trombocytest immune (Glycotope Biotechnology) для количественного определения иммуноглобулинов на поверхности тромбоцитов с помощью проточной иммунофлуоресценции [27].
Метод прямой поверхностной иммунофлуорес-ценции позволяет количественно определить плотность фиксированных иммуноглобулинов на мембране тромбоцитов по СИФ, а также идентифицировать класс иммуноглобулинов (IgA, IgM или IgG).
Методика исследования. Материал для исследования — периферическая кровь с антикоагулянтом эти-лендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) 7,5 мл для пациентов с тромбоцитопенией, 2 мл — для доноров. В цитометрические пробирки вносили до 4 мл
крови и центрифугировали при 150g в течение 15 мин для получения плазмы, обогащенной тромбоцитами. В цитометрические пробирки переносили всю полученную обогащенную тромбоцитами плазму, в донорские добавляли 1000 мкл Cell Wash. Далее центрифугировали при 700g в течение 7 мин и выливали надосадочную жидкость, потом вносили 2 мл раствора Cell Wash, тщательно перемешивали на вортексе. Процесс отмывания повторяли еще 2 раза. В последующем переносили осадок в пробирку типа эппендорф и доводили до 500 мкл раствором Cell Wash (до деления 0,5). На гематологическом анализаторе проводили подсчет количества выделенных тромбоцитов, получали Х х 109 клеток/л. Рассчитывали объем суспензии, в котором содержится 500 тыс. тромбоцитов. Для этого 500 делили на Х = количество мкл, которое нужно взять (Y). Далее подготавливали 7 цитометрических пробирок (на 1 пациента), в каждую вносили рассчитанное количество суспензии и доводили суспензию до 50 мкл раствором Cell Wash (50 мкл — Y). В каждую пробирку вносили 5 мкл сыворотки новорожденного теленка (New born Calf Serum, NBCS), перемешивали на вортексе и оставляли минимум на 1 мин при комнатной температуре. После этого проводили окрашивание античеловеческими кроличьими антителами, меченными FITC, к иммуноглобулинам G, A, M и конъюгатами к С3-с и С4 (компоненты системы комплемента), в качестве отрицательного контроля добавляли поликлональные антитела антикроличьи (изотипический контроль) FITC меченные (табл. 3).
Содержимое пробирок перемешивали на вортексе и инкубировали 15 мин в холодильнике при температуре +4 °С. Далее проводили отмывание: добавляли 2 мл Cell Wash и центрифугировали при оборотах 700 g в течение 7 мин, после чего выливали надосадочную жидкость и перемешивали на вортексе. Двойное окрашивание для идентификации и выделения тромбоцитов проводили с помощью добавления 5 мкл анти-CD4^ (PE-меченный) в каждую пробирку, перемешивали на вортексе и инкубировали 15 мин в холодильнике при температуре +4 °С. Далее проводили отмывание: добавляли 2 мл Cell Wash
Таблица 3. Конъюгация антителами с суспензией тромбоцитов Table 3. Antibody conjugation with platelet suspension
№ пробирки Антитело
Tube number
Antibody
IgG
IgM IgA GAM C3 C4
Iso-контроль Iso-control
Объем сыворотки, мкл
Serum volume, д!
2 в разбавлении 1:10 2 in dilution 1:10
I
и центрифугировали при оборотах 700 g в течение
7 мин, после чего выливали надосадочную жидкость. Добавляли по 100 мкл Cell Wash в каждую пробирку и перемешивали на вортексе. Далее проводили цито-метрический анализ на проточном цитометре BD FACSCanto II (BD-Becton Dickinson).
Цитометрический анализ. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием сине-зеленого лазера FACS Calibur (программное обеспечение CellQuest).
Идентификацию тромбоцитов проводили по окрашиванию моноклональными антителами к CD41a-PE с учетом прямого и бокового светорассеивания. Регистрировали не менее 10 000 положительных CD41a-тромбоцитов в каждом тесте (рис. 2).
Вокруг позитивной популяции CD41a-тромбоци-тов проводили корректировку по параметрам бокового и прямого светорассеяния для исключения
102
10'
10°
10' 1°2 103 CD41a-PE
Рис. 2. Регион положительных тромбоцитов CD41a Fig. 2. CD41a positive platelet region
104
событий, не относящихся к тромбоцитам (рис. 3). Далее выполняли анализ плотности фиксированных иммуноглобулинов с помощью цитометрических гистограмм у доноров и больных по пороговой СИФ.
Статистический анализ данных проводили с использованием статистического пакета SPSS, версия 10.0.5 (SPSS Inc.). Применяли методы описательной статистики, сравнения выборок, корреляционный анализ (коэффициент корреляции Спирмена). Уровень статистической значимости принят <0,05. Для оценки достоверности различий в 2 независимых выборках использовали непараметрический анализ и метод х2-Пирсона. В целях определения значимости факторов использовали подсчет отношения шансов.
Также у больных с заболеваниями системы крови и рефрактерностью к трансфузиям донорских тромбоцитов применяли зарегистрированный автоматизированный тест на совмещение тромбоцитов (индивидуальный подбор) с помощью метода адгезии на твердой фазе, который позволял одновременно осуществлять скрининг антитромбоцитарных аллоантител (HLA I класса и HPA) и проводить индивидуальный подбор пары донор — реципиент. Этот метод позволял предупредить развитие высокой степени аллоиммунизации и нежелательных посттрансфузионных реакций, а также способствовал преодолению рефрактерности к трансфузиям донорских тромбоцитов, что позволяло проводить в полном объеме необходимую терапию гематологическим больным [1, 5, 28].
Результаты
Определение тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов G, M, A и тромбоцитассоциированных компонентов системы комплемента C3, C4 у больных апластической анемией и гемобластозами С помощью цитофлуориметрического анализа детекции тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов комплемента было проведено 178 исследований у 77 больных и 28 доноров (контрольная группа). Больные были распределены в зависимости от нозологической группы: у больных АА (n = 47) проведено 92 исследования, у больных МДС (n = 10) - 18, у больных ОМЛ (n = 20) - 40. У доноров (n = 28) выполнено 28 исследований.
Для разграничения плотности фиксации PAIg и PAC, превышающей или не превышающей порог СИФ, проводили исследования на здоровых донорах в качестве отрицательного контроля. Из всех исследований установили достоверный пороговый уровень плотности фиксации (медиана), которую оценивали как СИФ: PAIgG = 450 относительных единиц, PAIgM = 250 относительных единиц, PAIgA = 300 относительных единиц, PAC3 = 200 относительных единиц, PAC4 = 200 относительных единиц. Оценка СИФ по каналу FITC отражает плотность фиксации и количество фиксированных иммуноглобулинов
CV со
ев
см со
1
7
'0
'0
Все события/A//events
CV со
ев
-139
10:
103
104
т г
105
Моноклональное антитело специфичное к CD-41, меченное фикоэритрином/Monoc/ona/ antibody specific for CD-41 labeled with phycoerythrin
1о'
rtt
102
11 ■ ■■ 11
103
*+f4f
104
■Ч1Ч'
105
Прямое светорассеяние/Forward scatter
Рис. 3. Идентификация тромбоцитов: а — выделение тромбоцитов по CD41a; б — корректировка по параметрам бокового и прямого светорас-Fig. 3. Platelet identification: а — platelet selection according to CD41a; б — adjustment by the side and forward light scattering parameters
СЧ со
и компонентов системы комплемента на мембране тромбоцитов (95 % доверительный интервал).
Определение плотности фиксации тромбоцитассо-циированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента у больных лиц и здоровых доноров. При исследовании обнаружено, что плотность фиксации (СИФ) РА^ М, А) и СИФ РАС3/С4 была выше во всех группах больных (АА, МДС, ОМЛ) по сравнению с донорами.
Средние колебания плотности фиксации иммуноглобулинов и компонентов комплемента представлены в табл. 4. Во всех группах больных СИФ превышала достоверный пороговый уровень плотности фиксации, т. е. была выше отрицательного контроля доноров, что было статистически достоверным (р <0,001).
Зависимость плотности фиксации тромбоцитассоци-ированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента от пола, возраста и диагноза между группами больных и донорами. При сравнении этих показателей обнаружено значимое отличие СИФ РА^М (р <0,0005), РА^ (р <0,0002), РАС3 (р <0,001) и РАС4
(р <0,0002) между группами больных АА, МДС, ОМЛ и донорами. Эти параметры являются статистически достоверными.
В то же время между этими группами больных и донорами по СИФ PAIgG различия были недостоверны (р = 0,07).
Зависимости плотности фиксации тромбоцитассо-циированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента от возраста и пола не обнаружено.
Взаимосвязь плотности фиксации тромбоцитассоци-ированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента. При сравнительном анализе этих исследований обнаружена сильная корреляция значений СИФ между РА^М и РА^ (г = 0,7), между РА^М и РАС3/С4 (г = 0,5), между РА^ и РАС3/С4 (г = 0,6), между РАС3 и РАС4 (г = 0,5). Эти параметры являются статистически достоверными. Чаще встречаются сочетание иммуноглобулинов ^М + IgА, сочетание иммуноглобулинов с компонентами системы комплемента ^М + С3/С4, ^А + С3/С4 и сочетание компонентов системы комплемента С3 + С4.
Таблица 4. Средняя интенсивность флуоресценции тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента в группах больных и доноров, отн. ед.
Table 4. The mean fluorescence intensity ofplatelet-associated immunoglobulins and complement components in groups ofpatients and donors, rel. units
б
а
0
Тромбоцитассоциированные иммуноглобулины/компоненты системы комплемента АА МДС ОМЛ Доноры
Platelet-associated immunoglobulins/complement components AA MDS AML ШЯ
PAIgG 552(21- 4008) 747 (108-5804) 627 (94-5166) 217 (84-709)
PAIgM 676 (80- 8915) 530 (186-3442) 391 (124-3942) 182 (79-514)
PAIgA 527(25- 5016) 412 (143-2199) 616 (100-5506) 165 (74-677)
PAC3 119 (18- -614) 223 (76-5434) 210 (54-2606) 47 (23-188)
PAC4 111 (88- -665) 111 (88-665) 149 (96-832) 78 (43-179)
Такие сочетания могут свидетельствовать о том, что у больных, получающих множественные трансфузии тромбоцитов, дополнительным фактором, связанным с механизмом разрушения тромбоцитов, может являться антителоопосредованный и комплементзав-исимый цитолиз, а также фагоцитоз. В то же время известно, что IgA не фиксирует комплемент и наличие РАС3/С4 в этом случае может быть обусловлено РА^М или IgG, которые затем диссоциировали с поверхности тромбоцитов.
Зависимость плотности фиксации PAIgА и РАС3 от количества трансфузий у больных с рефрактерностью к трансфузиям донорских тромбоцитов. При сравнении параметров высокой плотности фиксации PAIgА с числом предшествующих трансфузий тромбоцитов обнаружено достоверное увеличение плотности фиксации PAIgА с увеличением количества трансфузий КТ у рефрактерных к трансфузиям больных, статистически этот параметр достоверен (р <0,02). Также отмечается тенденция увеличения плотности фиксации РАС3 с ростом числа предшествующих трансфузий тромбоцитов (р = 0,07).
У больных с рефрактерностью и с множественными трансфузиями (Ме = 22) тромбоцитов плотность фиксации PAIgА была выше по сравнению с другими РА^. Видимо, это связанно с высокой трансфузион-ной нагрузкой.
Зависимость плотности фиксации РА^М от рефрак-терности к трансфузиям донорских тромбоцитов.
При сравнении параметров наличия или отсутствия рефрактерности установлено, что у больных с рефрак-терностью к трансфузиям тромбоцитов обнаружено достоверно более высокое значение СИФ РА^М по сравнению с больными, у которых не было рефрак-терности к трансфузиям, что является статистически достоверным (р <0,02). В общей группе с рефрактер-ностью к трансфузиям выявлено 36 случаев, превышающих порог плотности фиксации РА^М, 28 случаев — ниже порога фиксации РА^М. В общей группе без рефрактерности к трансфузиям выявлен 31 случай, превышающий порог плотности фиксации РА^М, 46 случаев — ниже порога фиксации РА^М.
Эти данные говорят о том, что на фоне рефрактер-ности с постоянной трансфузионной нагрузкой появляются иммуноглобулины класса М, которые могут приводить к снижению эффективности проводимой трансфузионной терапии КТ.
Зависимость плотности фиксации РА^М, PAIgA и РАС3 от частоты реагирования аллоантител у больных с рефрактерностью к трансфузиям донорских тромбоцитов. При сравнении плотности фиксации РА^ и РАС3/С4 и частоты реагирования была выявлена зависимость СИФ РА^А и РАС4 от высокой частоты реагирования аллоантител, что является статистически достоверным для РА^ (р <0,04), РАС4 (р <0,02). Также имеется тенденция взаимосвязи наличия высокой плотности фиксации РА^М (р = 0,08) и высокой
частоты реагирования. Связи с PAIgG и PAC3 не обнаружено.
Эти данные свидетельствуют о том, что у рефрактерных к трансфузиям больных дополнительно с ан-титромбоцитарными аллоантителами цитотоксиче-ское действие могут проявлять PAIgM, PAIgA и PAC4, что может существенно затруднять подбор пары донор — реципиент в иммунологических тестах.
Таким образом, во всех исследованиях плотность фиксации иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента на поверхности тромбоцитов была выше порогового уровня СИФ. Высокая плотность фиксации IgM и IgA в сочетании с компонентами системы комплемента IgM + С3/С4, IgA + С3/С4, а также высокая плотность фиксации сочетания компонентов системы комплемента С3 + С4 могут свидетельствовать об иммунной аутоагрессии, что в результате приводит к антителоопосредован-ному и комплементзависимому цитолизу тромбоцитов у больных, получавших множественные трансфузии тромбоцитов.
Определение тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов классов G, M, A и тромбоцитассоциированных компонентов системы комплемента C3, C4 у больных апластической анемией
Группа больных АА была наиболее подробно изучена по параметрическим факторам. Всего проанализированы данные 47 больных и проведено 92 исследования на разных этапах терапии с постановкой проб PAIg по классам (G, M, A) и PAC3/C4.
Снижение значения плотности фиксации (СИФ) PAIg и PAC было выявлено в 333 случаях, повышение — в 133. Из них значения СИФ по классам иммуноглобулинов: снижение СИФ PAIgG — 66, повышение - 26; снижение СИФ PAIgM - 54, повышение — 38; снижение СИФ PAIgA — 65, повышение - 33.
Значения СИФ среди компонентов комплемента PAC3: снижение — 77, повышение — 15; PAC4: снижение — 71, повышение — 21. Таким образом, больше всего положительных значений СИФ выявляли среди PAIgM (41 %) и PAIgA (29 %).
Значения СИФ PAIgM и PAIgA у больных АА на фоне трансфузий тромбоцитов и без трансфузий тромбоцитов. При сравнении параметров было установлено, что больные, которые были зависимы от трансфузий донорских КТ, имели повышенную плотность фиксации тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента, в отличие от больных, которым не проводились трансфузии донорских КТ в течение 1 мес и более (рис. 4). Причем плотность фиксации PAIgM у трансфузионнозависи-мых больных была выше (648 относительных единиц) по сравнению с другими иммуноглобулинами и компонентами системы комплемента. Достоверные
CV со
ев
сч со
сч со
es
сч со
700
600
500
400
300
200
100
529
317
648
572
223
262
Трансфузии КТ есть/With PC transfusions Трансфузий КТ нет/without PC transfusions
329
119
IgG
IgM
IgA
Рис. 4. Среднее значение средней интенсивности флуоресценции в группе больных апластической анемией с трансфузиями концентратов тромбоцитов (КТ) и без трансфузий
Fig. 4. The average mean fluorescence intensity value in aplastic anemia patients with and without platelet concentrate (PC) transfusions
различия наблюдались между PAIgM (р <0,009) и PAIgA (р <0,02).
Зависимость активности циркулирующих антитром-боцитарных аллоантител от значений СИФ PAIgM, PAIgA и PAC4 у больных АА. При сравнении параметров было установлено, что у больных с высокой активностью антитромбоцитарных аллоантител, которая обозначалась в условных единицах (Relative Units-RU), обнаружены корреляция и достоверное увеличение плотности фиксации PAIgM (r = 0,5; p = 0,0001); PAIgA (r = 0,7; p = 0,0001) и PAC4 (r = 0,6; p = 0,0001). Зависимости между активностью антитромбоцитарных аллоантител и PAIgG и PAC3 не обнаружено (рис. 5).
Таким образом, у больных с высокой активностью антитромбоцитарных аллоантител дополнительно обнаруживается высокая плотность фиксации тром-боцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента, в отличие от больных с низкой активностью антитромбоцитарных аллоантител, что в последующем может затруднять подбор совместимой пары донор — реципиент.
Зависимость рефрактерности к трансфузиям от количества трансфузий тромбоцитов в анамнезе. При сравнении параметров было установлено, что больные с рефрактерностью к трансфузиям донорских тромбоцитов в анамнезе имели большее количество трансфузии тромбоцитов (М = 35 (3—141)), чем больные без рефрактерности (М = 15 (0—82)), что является статистически достоверным (р = 0,0018).
Зависимость плотности фиксации PAIgM и РАС3/С4 от клинического статуса. При исследовании зависимости между PAIg, PAC и клиническим статусом у больных
АА обнаружено, что СИФ РАС3 была выше у больных при рецидиве заболевания (рис. 6), что является статистически достоверным (р = 0,0485). Имеется также тенденция повышения при рецидиве СИФ РА^М (р = 0,0567) и СИФ РАС4 (р = 0,0562).
Зависимость плотности фиксации РА^М и PAIgА от наличия инфекционных осложнений. При исследовании обнаружено, что у больных с множественными инфекционными осложнениями отмечается высокая плотность фиксации РА^М и PAIgA, что является статистически достоверным (р = 0,0062, р = 0,0022 соответственно). В то же время связь РАС3 с инфекционными осложнениями у больных АА была недостоверна (р = 0,0975).
Инфекционные осложнения всегда сопровождаются большим выбросом провоспалительных цитоки-нов, которые, в свою очередь, стимулируют образование иммуноглобулинов (^М, IgA).
Зависимость плотности фиксации РА^М и PAIgА от наличия предшествующих трансфузий за последние 3 мес. При исследовании обнаружено, что у больных, которым проводили трансфузии тромбоцитов в последние 3 мес, отмечается высокая плотность фиксации РА^М/А, в отличие от больных, которым не проводили трансфузии тромбоцитов в последние 3 мес. Статистически параметры являются достоверными для СИФ РА^М (р = 0,0033) и СИФ РА^А (р = 0,0461).
У больных с множественными трансфузиями первыми выявляются РА^М, которые могут приводить в дальнейшем к неэффективным трансфузиям тромбоцитов.
0
C3
C4
9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
CV со
es
43 44
96 99
99
PAIgG
PAIgM
PAIgA
PAC3
PAC4
Относительные единицы/Relative Units
Рис. 5. Зависимость среднего значения активности антитромбоцитарных аллоантител от значений средней интенсивности флуоресценции PAIg/PACу больных апластической анемией
Fig. 5. The dependence of the mean activity of antiplatelet alloantibodies from mean fluorescence intensity of PAIg / PAC in aplastic anemia patients
СЧ со
C3
C4
_g 1000
100
ä .£5
CÛ t
I § £
I g £ £
0,0485
en10 000
1000
^Cc ë 1
100
10
m
—•—
рф ЩЛ
0,0582
S S i5 t
IgM
10 000
1000
100
Ei .S
Cû С Ä cl.
* i s
^ -S
I H I
0,0576
10
10
Рис. 6. Значения средней интенсивности флуоресценции тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента в зависимости от степени тяжести заболевания и клинического статуса
Fig. 6. Mean fluorescence intensity values of platelet-associated immunoglobulins and complement components, depending on the disease severity and clinical status
еч со
ев
еч со
Зависимость плотности фиксации РА^М от рефрак-терности к трансфузиям донорских тромбоцитов.
При исследовании обнаружено, что у больных с высокой частотой реагирования аллоантител и рефрактер-ностью к трансфузиям тромбоцитов отмечалась высокая плотность фиксации и РА^М, в отличие от больных без рефрактерности, что является статистически достоверным (р = 0,0428). Появление РА^М может способствовать в дальнейшем неэффективным трансфузиям донорских тромбоцитов.
Обсуждение
У гематологических больных с зависимостью от трансфузий донорских тромбоцитов в течение длительного времени, а также при развитии аллоим-мунизации с последующей рефрактерностью к трансфузиям появляются как аллоиммунные ан-титромбоцитарные антитела, так и тромбоцитассо-циированные иммуноглобулины и тромбоцитассо-циированные компоненты системы комплемента. Детекцию тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента проводили с помощью двойного окрашивания в реакции прямой поверхностной иммунофлуоресценции методом проточной цитофлуориметрии. Появление РА^/РАС3/С4 может быть связано как с общей воспалительной реакцией, выбросом провоспалитель-ных цитокинов и активацией тромбоцитов, так и с развитием аутоиммунных процессов в отношении собственных тромбоцитов. Эти процессы разрушают тромбоциты, что усугубляет развитие тром-боцитопении. У больных с высокой активностью антитромбоцитарных аллоантител дополнительно обнаруживается высокая плотность фиксации тром-боцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента, в отличие от больных с низкой активностью антитромбоцитарных аллоантител. Это может свидетельствовать о возможной циркуляции иммуноглобулинов в виде циркулирующих иммунных комплексов в плазме больного, что в последующем может влиять на иммунологическую реакцию индивидуального подбора пары донор — реципиент.
По данным опубликованных работ [8, 12—14, 17, 18], исследование плотности фиксации тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента у больных с иммунной формой тромбоцитопении (иммунная тромбоцито-пения, вторичные тромбоцитопении) и с неиммунной формой (цирроз печени, сепсис, спленомегалия, острые лейкозы) чаще всего проводят методом проточной цитофлуориметрии. Как свидетельствуют данные зарубежных авторов, IgG встречаются чаще при иммунных формах тромбоцитопений — в 66 % случаев (причем при иммунной тромбоцитопении — в 50 % случаев), при неиммунных — в 10 %. Другие классы ^М, ^А и РАС3 детектируются практически
одинаково как при иммунных, так и при неиммунных формах тромбоцитопении. При инфекциях и сепсисе чаще выявляются на тромбоцитах IgG в сочетании с РАС3. Высокая плотность PAIgG, РАС3 и РАIgG в изолированной форме наблюдается при гепатитах и циррозах печени. Наличие высокой плотности тромбоцитассоциированных РАIgG/M может активировать компонент системы комплемента С3. Фиксация компонента системы комплемента С3 происходит в присутствии иммуноглобулинов. Сочетание РАIgG/M встречается в 90 % случаев как при иммунных, так и при неиммунных формах тромбоцитопений. Изолированная высокая плотность РА^М встречается при синдроме Эванса. PAIgG/M, особенно РА^М, обладают комплемент-связывающей способностью. Опубликованных работ, связанных с определением тромбоцитассоци-ированных иммуноглобулинов классов G, М, А и компонентов системы комплемента С3, С4, а также с определением их значения и взаимосвязи с клиническими особенностями течения заболевания у больных АА не найдено.
В нашем исследовании у больных АА и гемобласто-зами выявляется высокая частота фиксации на поверхности тромбоцитов РА^М и PAIgА, а также сочетания РА^М/А, РА^М/С3/С4 и РА^С3/С4. Высокая плотность фиксации иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента, как правило, приводит к антитело-опосредованному и комплементзависимому цитолизу с последующим фагоцитозом тромбоцитов клетками ретикулоэндотелиальной системы в селезенке и печени. Постоянная трансфузионная нагрузка сопровождается появлением PAIgА и РАС3, а при развитии аллоиммуни-зации и рефрактерности к трансфузиям появляются также РА^М и РАС4, которые приводят в дальнейшем к неэффективным трансфузиям тромбоцитов. Фиксируясь на тромбоцитах больного, эти иммуноглобулины в сочетании с компонентами системы комплемента С3/С4 могут затем отщепляться от поверхности, циркулировать в периферической крови в составе иммунных комплексов, что усугубляет течение рефрактерности к трансфузиям донорских тромбоцитов. У аллоиммуни-зированных больных тромбоцитассоциированные иммуноглобулины могут реагировать со специфическими антитромбоцитарными аллоантителами в иммунологических тестах и снижать вероятность подбора совместимых пар донор — реципиент, поэтому выявление РА^ желательно осуществлять заблаговременно. Также нами отмечено, что у рефрактерных к трансфузиям больных АА с высокой степенью аллоиммунизации обнаруживается высокая плотность РА^М (р = 0,0428), способствующая повышенному разрушению тромбоцитов, в том числе и донорских. Множественные инфекционные осложнения и высокая трансфузионная нагрузка донорскими тромбоцитами у больных АА приводят к появлению тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов. Инфекционные осложнения всегда сопровождаются
большим выбросом провоспалительных цитокинов, которые, в свою очередь, стимулируют образование иммуноглобулинов (^М, IgA). При рецидиве АА выявляется высокая плотность фиксации РАС3 (р = 0,0485), РАС4 (р = 0,0562) и РА^М (р = 0,0567). Рецидив АА -прогрессирование заболевания, обусловленное появлением активированных субклонов Т-лимфоцитов, что приводит к выбросу большого количества провоспа-лительных цитокинов (TNFa, IFNy, IL-2, ^-6, IL-8), подавляющих пролиферацию клеток ранних предшественников кроветворения и усиливающих апоптоз гемо-поэтических стволовых клеток, что приводит к развитию цитопении, появлению зависимости от трансфузий компонентами донорской крови.
Многократные трансфузии КТ часто приводят к развитию аллоиммунизации донорскими аллоанти-генами тромбоцитов с образованием полиспецифических аллоантител, что в дальнейшем сводит к нулю вероятность подбора пар донор - реципиент и усугубляет течение рефрактерности к трансфузиям, приводя к некупируемым геморрагическим осложнениям. Относительно высокая частота обнаружения РА^М, PAIgА и РАС3/С4 у больных АА с множественными трансфузиями КТ в нашем исследовании может свидетельствовать об иммунологической атаке тромбоцитов и донора, а также реципиента в результате аутоиммунных процессов и сверхактивации и апоптоза тромбоцитов под действием провоспалительных цитокинов как следствие множественных трансфузий у гематологических больных с данными заболеваниями.
Заключение
Таким образом, на основании проведенных исследований обнаружено, что у больных АА и
гемобластозами при развитии рефрактерности к трансфузиям донорских тромбоцитов чаще выявляется повышенная плотность фиксации ^М, ^А и компонентов системы комплемента С3, С4 на мембране тромбоцитов.
Установлено, что на фоне постоянной трансфу-зионной нагрузки с развитием аллоиммунизации и рефрактерности к трансфузиям КТ, а также при множественных инфекционных осложнениях и особенностях течения АА появляются тромбоцитассоции-рованные ^М, ^А и тромбоцитассоциированные компоненты системы комплемента С3, С4.
Эти факты свидетельствуют о том, что у больных АА и гемобластозами с длительным трансфузионным анамнезом и высоким риском развития рефрактерно-сти к трансфузиям донорских тромбоцитов необходимо заблаговременно осуществлять детекцию тромбо-цитассоциированных иммуноглобулинов (классов G, М, А) и тромбоцитассоциированных компонентов системы комплемента (С3, С4). При развитии рефрак-терности к трансфузиям донорских тромбоцитов помимо применения определенного алгоритма трансфу-зионной терапии с использованием индивидуального подбора и лечебного плазмафереза также необходимо проводить детекцию тромбоцитассоциированных иммуноглобулинов (классов G, М, А) и компонентов системы комплемента (С3, С4) в динамике.
Следует подчеркнуть, что наличие тромбоцитас-социированных иммуноглобулинов (классов G, М, А) и тромбоцитассоциированных компонентов системы комплемента (С3, С4) снижает эффективность индивидуального подбора пар донор - реципиент, тем самым усугубляет развитие рефрактерности к трансфузиям донорских тромбоцитов.
CV со
es
см со
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Савченко В.Г. Алгоритмы диагностики и протоколы лечения заболеваний системы крови в 2 томах. М.: Практика, 2018. С. 1006-1255. [Savchenko V.G. Diagnostic algorithms and treatment protocols for blood diseases. Moscow: Praktika, 2018. Рр. 1006-1255. (In Russ.)].
2. Corazza M. Hranchook M. Massive blood transfusion therapy. AANA J 2000;68(4):311-4.
3. Fletcher C.H., DomBourian M.G., Millward P.A. Platelet transfusion for patients with cancer. Cancer Control 2015;22(1):47-51. DOI: 10.1177/107327481502200107.
4. Зотиков Е.А., Бабаева А.Г., Головкина Л.Л. Тромбоциты и антитромбоци-тарные антитела. М.: Монолит, 2003. 125 с. [Zotikov E.A., Babaeva A.G.,
Golovkina L.L. Platelets and antiplatelet antibodies. Moscow: Monolit, 2003. 125 p. (In Russ.)].
5. Рахмани А.Ф., Михайлова Е.А., Дубин-кин И.В. и др. Рефрактерность к трансфузиям донорских тромбоцитов у больных апластической анемией и гемобластозами. Онкогематология 2018;13(2):62-72. DOI: 10.17650/18188346-2018-13-2-62-72. [Rakhmani A.F., Mikhailova E.A., Dubinkin I.V. et al. Refractoriness to donor platelets transfusion in patients with aplastic anemia and hemoblastosis. Onkogematologiya = Oncohematology 2018;13(2):62-72.
(In Russ)].
6. Hod E., Schwartz J. Platelet transfusion refractoriness. Br J Haematol 2008;142(3):348-60.
DOI: 10.mi/j.1365-2141.2008.07189.x.
7. Forest S.K., Hod E.A. Management of the platelet refractory patient. Hematol Oncol Clin North Am 2016;30(3):665-77. DOI: 10.1016/j.hoc.2016.01.008.
8. Kiefel V., Konig C., Kroll H., Santoso S. Platelet alloantibodies in transfused patients. Transfusion 2001;41(6):766-70. D0I:10.1046/j.1537-2995.2001.41060766.x.
9. Мазуров А.В. Физиология и патология тромбоцитов. М.: Литтерра, 2011. 456 с. [Mazurov A.V. Platelet physiology and pathology. Moscow: Litterra, 2011. 456 p. (In Russ.)].
10. Wallington T. Essential immunology for transfusion medicine. In: Practical Transfusion Medicine, 3rd edn. Eds.: M.F. Murphy, D.H. Pamphilon. Blackwell
сч со
es
сч со
Publishing Ltd, 2009.
DOI: 10.1002/9781444311761.ch2.
11. Sayyadi M., Shaiega M., Zarif M. et al. Platelet transfusion outcome and flow cytometric monocyte phagocytic assay (FMPA). Arch Iran Med 2016;19(6):426-9. DOI: 0161906/AIM.0010.
12. He Y., Zhao Y.X., Zhu M.Q. et al. Detection of autoantibodies against platelet glycoproteins in patients with immune thrombocytopenic purpura by flow cytometric immunobead array. Clin Chim Acta 2013;415:176-80. DOI: 10.1016/j.cca.2012.10.035.
13. Huh H.J., Park C.J., Kim S.W. et al. Flow cytometric detection of platelet-associated immunoglobulin in patients with immune thrombocytopenic purpura and nonimmune thrombocytopenia. Ann Clin Lab Sci 2009;39(3):283-8.
14. Romero-Guzman L.T., Lopez-Karpovitch X., Paredes R. et al. Detection of platelet-associated immunoglobulins by flow cytometry for the diagnosis of immune thrombocytopenia: a prospective study and critical review. Haematologica 2000;85(6):627-31.
15. Peerschke E.I., Yin W., Ghebrehiwet B. Platelet mediated complement activation. Adv Exp Med Biol 2008;632:81-91. DOI: 10.1007/978-0-387-78952-1_7.
16. Kiefel V., Freitag E., Kroll H., Santoso S. et al. Platelet autoantibodies (IgG, IgM, IgA) against glycoproteins IIb/IIIa and Ib/ IX in patients with thrombocytopenia. Ann Hematol 1996;72(4):280-5.
17. Myers T., Kim B., Steiner M., Baldini M. Platelet-associated complement C3 in immune thrombocytopenic purpura. Blood 1982;59(5):1023-8.
18. Panzer S., Szamait S., Bödeker R.H. et al. Platelet-associated immunoglobulins IgG, IgM, IgA and complement C3 in immune and nonimmune thrombocytopenic disorders. Am J Hematol 1986;23(2):89-99. DOI: 10.1002/ajh.2830230203.
19. Andrews R.K., Gardiner E.E. Basic mechanisms of platelet receptor shedding. Platelets 2017;28(4):319-24. DOI: 10.1080/09537104.2016.1235690.
20. Bender M., Stegner D., Nieswandt B. Model systems for platelet receptor shedding. Platelets 2017;28(4):325-32. DOI: 10.1080/09537104.2016.1195491.
21. Gardiner E.E., Al-Tamimi M., Andrews R.K., Berndt M.C. Platelet receptor shedding. Methods Mol Biol 2012;788:321-39. DOI: 10.1007/978-1-61779-307-3_22.
22. Manis J.P., Silberstein L.E. Platelet refractoriness: It's not the B-all and endall. Blood 2016;127(14):1740-1. DOI: 10.1182/blood-2016-02-695437.
23. Михайлова Е.А. Программное лечение больных апластической анемией. В кн.: В.Г. Савченко, Е.А. Михайлова,
Е.Н. Устинова, Г.А. Клясова. Программное лечение лейкозов. М.: Практика, 2018. С. 328-342. [Mikhailova E.A. Program treatment of aplastic anemia patients. In: V.G. Savchenko, E.A. Mikhailova, E.N. Ustinova, G.A.
Klyasova. Program treatment of leukemia. Moscow: Praktika, 2018. Pp. 328-342. (In Russ.)].
24. Killick S., Bown N., Cavenagh J. et al. Guidelines for the diagnosis and management of adult aplastic anaemia. Br J Haematol 2016;172(2):187-207. DOI: 10.1111/bjh.13853.
25. Bevans M.F., Shalabi R.A. Management of patients receiving antithymocyte globulin for aplastic anemia and myelodysplastic syndrome. Clin J Oncol Nurs 2004;8(4):377-82. DOI: 10.1188/04. CJON.377-382.
26. Cheson B.D., Bennett J.M., Kopecky K.J. et al. Revised recommendations of the International Working Group for diagnosis, standardization of response criteria, treatment outcomes, and reporting standards for therapeutic trials in acute myeloid leukemia. J Clin Oncol 2003;21(24):4642-9. DOI: 10.1200/ JCO.2004.99.116.
27. Carubbi C., Masselli E., Gesi M. et al. Cytofluorimetric platelet analysis. Semin Thromb Hemost 2014;40(1):88-98. DOI: 10.1055/s-0033-1363472.
28. Sarkar R.S., Philip J., Jain N. Detection and identification of platelet-associated alloantibodies by a solid-phase modified antigen capture elisa (MACE) technique and its correlation to platelet refractoriness in multi platelet concentrate transfused patients. Indian J Hematol Blood Transfus 2015;31(1):77-84. DOI: 10.1007/s12288-014-0374-4.
Вклад авторов
А.Ф. Рахмани: разработка дизайна исследования, обзор публикаций по теме статьи, написание текста рукописи; Е.А. Михайлова: выборка больных для исследования, редактирование текста рукописи;
И.В. Гальцева, Ю.О. Давыдова, Н.М. Капранов: проведение цитометрического анализа, получение лабораторных данных для исследования;
И.В. Дубинкин: разработка дизайна исследования, редактирование текста рукописи;
С.М. Куликов: анализ полученных данных (включая статистический);
Т.В. Гапонова: редактирование текста рукописи;
З.Т. Фидарова, В.В. Троицкая: выборка больных для исследования;
Е.Н. Паровичникова, В.Г. Савченко: обзор публикаций по теме статьи.
Authors' contributions
A.F. Rakhmani: study design development, reviewing of publications on the article's topic, article writing; E.A. Mikhaylova: a sample of patients for the study, article editing;
I.V. Galtseva, Yu.O. Davidova, N.M. Kapranov: cytometric analysis, obtaining laboratory data for study; I.V. Dubinkin: study design development, article editing; S.M. Kulikov: analysis of the data (including statistical); T.V. Gaponova: article editing;
Z.T. Fidarova, V.V. Troitskaya: a sample of patients for the study;
E.N. Parovichnikova, V.G. Savchenko: reviewing of publications on the article's topic.
ORCID авторов/ORCID of authors
А.Ф. Рахмани/A.F. Rakhmani: http//orcid.org/0000-0002-1568-0999 Е.А. Михайлова/E.A. Mikhaylova: http://orcid.org/0000-0002-2449-2682 И.В. Гальцева/I.V. Galtseva: https://orcid.org/0000-0002-8490-6066 И.В. Дубинкин/I.V. Dubinkin: http//orcid.org/0000-0001-5347-0127 Т.В. Гапонова/T.V. Gaponova: https://orcid.org/0000-0002-9684-5045 З.Т. Фидарова/Z.T. Fidarova: https://orcid.org/0000-0003-0934-6094
В.В. Троицкая/VV. Troitskaya: https://orcid.org/0000-0002-4827-8947 Е.Н. Паровичникова/E.N. Parovichnikova: https://orcid.org/0000-0001-6177-3566 В.Г. Савченко/V.G. Savchenko: https://orcid.org/0000-0001-8188-5557
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки. Financing. The study was performed without external funding. Jg
Информированное согласие. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании.
Informed consent. All patients gave written informed consent to participate in the study. |_
cv со
см
CO
Статья поступила: 23.05.2019. Принята к публикации: 12.09.2019. Article received: 23.05.2019. Accepted for publication: 12.09.2019.
