CC BY
105
УДК 577.322.72, 577.322.23
Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2011. Вып. 4
Ольга В. Степаненко, Олеся В. Степаненко, А. В. Фонин, Д. М. Щербакова, В. В. Верхуша, И. М. Кузнецова, К. К. Туроверов
D-ГАЛАКТОЗА/D-ГЛЮКОЗА-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК КАК ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ ЭЛЕМЕНТ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМОЙ БИОСЕНСОРНОЙ СИСТЕМЫ. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКА С ГЛЮКОЗОЙ*
Введение. Диабет — широко распространённое в мире заболевание — имеет ряд очень тяжёлых последствий [1], таких как развитие слепоты, почечной недостаточности, заболеваний сердечно-сосудистой системы. Очевидно, что непрерывный мониторинг уровня глюкозы в крови человека имел бы явное преимущество перед периодическим забором крови из пальца пациента, использующимся в мировой практике в настоящее время [2]. Поэтому создание биосенсорной системы, позволяющей непрерывно отслеживать уровень сахара в крови, является чрезвычайно актуальной задачей [3, 4].
Перспективным на роль чувствительного элемента такой биосенсорной системы является D-галактоза/D-глюкоза-связывающий белок (GGBP) из Escherichia coli, поскольку при его взаимодействии с D-глюкозой наблюдаются значительные перестройки третичной структуры белка [5]. Однако константа диссоциации комплекса GGBP с сахаром очень низка (1 мкМ). Это означает, что использование GGBP дикого типа в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы непрерывного действия для определения концентрации глюкозы в крови человека невозможно. Чтобы биосенсорная система работала непрерывно, т. е. чувствовала изменение концентрации сахара, константа диссоциации комплекса белок — глюкоза должна быть численно близка концентрации глюкозы в крови здоровых людей, которая составляет 3-8 мМ [6]. Для этих целей необходимо создавать мутантные формы GGBP с повышенной константой диссоциации комплекса белок — глюкоза, что может быть достигнуто введением мутаций в сайт связывания лиганда [7]. Свойства GGBP дикого типа позволяют использовать его в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу в сочетании с трансдермальными методами экстракции сахара из крови или межклеточных и иных жидкостей, сопряжёнными с существенным разбавлением глюкозы. В частности, обратный ионтофорез обеспечивает забор пробы, в которой концентрация глюкозы в тысячу раз меньше её физиологической концентрации [8].
Необходимое качество биосенсорной системы непрерывного действия заключается в устойчивости её чувствительного элемента к различным денатурирующим воздействиям. В представляемой работе мы провели исследования устойчивости GGBP дикого типа к действию химического денатуранта гуанидингидрохлорида (GdnHCl) и нагревания в отсутствие и в присутствии глюкозы, в ходе которых было выявлено существенное влияние вязкости раствора на процессы взаимодействия белка с глюкозой.
Материалы и методы. Плазмиду pET-11d, кодирующую белок GGBP с концевой полигистидиновой меткой, использовали для трансфекции клеток Escherichia coli BL21(DE3). Экспрессию белка в Escherichia coli индуцировали 0,5 мМ IPTG (Nacalai Tesque, Япония). Клеточную массу наращивали в течение 24 ч при 37 °С. Белок
* Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (02.740,11.5141 и 16.512.11.2114), гранта Президента РФ (MK-1181.2010.4).
Ольга В. Степаненко, Олеся В. Степаненко, А. В. Фонин, Д. М. Щербакова, В. В. Верхуша, И.М.Кузнецова, К. К. Туроверов, 2011
очищали с помощью Ni-агарозы (колонки His GraviTrap, GE Healthcare, Швеция). Подробный контроль чистоты полученных белковых препаратов осуществляли с помощью SDS-электрофореза в денатурирующих условиях в 15 %-ном полиакриламидном геле согласно стандартной методике [9]. Измерения проводили в растворах 20 мМ Na-фос-фатного буфера, pH = 8,0. Эксперименты выполнены при концентрации растворов белка 0,2-0,7 мг/мл.
Препараты D-глюкозы (Sigma, США) и гуанидингидрохлорида (GdnHCl) (Nacalai Tesque, Япония) использовали без дополнительной очистки. Концентрацию GdnHCl определяли с помощью рефрактометра «Аббе» (ЛОМО, Россия). Для образования комплекса белок—лиганд в раствор белка добавляли D-глюкозу в концентрации 10 мМ. Ион кальция отщепляли в растворе 1 мМ ЭДТА (Fluka, Швейцария).
Флуоресцентные измерения выполнены с использованием спектрофлуориметра "Cary Eclipse" (Varian, Австралия) и микрокювет (10х 10 мм2; Varian, Австралия). Спектры флуоресценции измеряли при возбуждении светом с длиной волн 280 и 297 нм. Значения параметра A = I320/I365, характеризующего положение спектров флуоресценции (I320 и I365 — интенсивности флуоресценции при длине волн регистрации 320 и 365 нм соответственно; см. [10]), и спектры флуоресценции корректировали на спектральную чувствительность установки. Квазиравновесные зависимости различных флуоресцентных характеристик белков от концентрации GdnHCl измеряли в течение нескольких дней после инкубации белка в растворах GdnHCl соответствующей концентрации при 4 °С. Измерения выполнены при 23 °С. Зарегистрированные зависимости интенсивности флуоресценции анализировали с помощью метода, основанного на параметрическом представлении двух независимых экстенсивных характеристик системы [11]. Термодинамические характеристики рассчитаны согласно Нолтингу [12].
Спектры кругового дихроизма (КД) в дальней и ближней УФ-областях регистрировали на спектрополяриметре J-810 (Jasco, Япония). При работе в дальней УФ-области измерения выполнены в диапазоне 260-190 нм с шагом 0,1 нм с использованием кварцевых кювет (1 мм). При регистрации спектров в ближней УФ-области измерения проводили в диапазоне 320-250 нм с шагом 0,1 нм с использованием кварцевых кювет (10 мм). Для улучшения соотношения сигнал/шум каждый спектр регистрировали 3-5 раз и полученные данные усредняли. Спектры КД белков построены с учётом КД соответствующего буферного раствора.
Калориметрические исследования проводили на дифференциальном сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М («Биоприбор», Пущино, Россия), как описано ранее [13]. Белок нагревали с постоянной скоростью 1 К/мин при постоянном давлении в 2,4 атм. Для проверки обратимости тепловой денатурации белка после первого сканирования и последующего охлаждения ячеек до исходной температуры образец подвергали повторному нагреванию. Базовую линию записывали, помещая в обе ячейки прибора используемый в эксперименте буферный раствор. Стабильность белков характеризовали температурой максимума теплопоглощения. При исследовании тепловой денатурации белков с помощью метода собственной УФ-флуоресценции регистрировали зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции белка от температуры. Скорость нагрева была постоянной и составляла 1 °С/мин.
Результаты. GGBP состоит из двух глобулярных доменов, связанных шарнирной областью, образованной тремя пептидными сегментами [14]. Каждый домен имеет ядро из шести в-тяжей, окружённых с одной стороны двумя a-спиралями, а с другой — тремя. Сайт связывания лиганда расположен в глубокой щели между N- и C-концевым доменами белка. Молекула GGBP имеет в своем составе дополнительный ли-
ганд — 1 ион кальция, локализованный в петле C-концевого домена (остатки 134-142) и образующий координационную связь с атомами кислорода каждого второго остатка этой петли и остатка Glu 205. Структура кальций-связывающего сайта этого белка напоминает структуру мотива «EF-руки», распространённого во внутриклеточных кальций-связывающих белках [14, 15].
Для исследования стабильности GGBP был использован стандартный подход, заключающийся в изучении процессов сворачивания-разворачивания белка под действием GdnHCl в присутствии и в отсутствие лигандов — молекулы глюкозы и иона кальция. Равновесные зависимости различных флуоресцентных характеристик (интенсивности флуоресценции, параметра A и анизотропии флуоресценции; рис. 1, а-в) и эллиптичности при 222 нм (рис. 1, г) GGBP и комплекса GGBP с глюкозой (GGBP/Glc), а также их бескальциевых форм (GGBP-Ca и GGBP-Ca/Glc соответственно) от концентрации денатурирующего агента были измерены в процессе денатурации и ренатурации белка. Стационарные кривые денатурации и ренатурации GGBP, измеренные через 24 ч после инкубации белка в растворах с различной концентрацией GdnHCl, совпадают и имеют сигмоидальную форму. На самом деле равновесие достигается даже быстрее. Кривая денатурации GGBP/Glc, измеренная после 24-часовой инкубации комплекса в присутствии денатурирующего агента, сдвинута в сторону больших концентраций GdnHCl по отношению к равновесной кривой денатурации-ренатурации GGBP. Стационарная кривая ренатурации комплекса GGBP/Glc, зарегистрированная после 24-часовой инкубации белка в присутствии избытка глюкозы в растворах с различной концентрацией GdnHCl, не совпадает с соответствующей кривой денатурации GGBP/Glc, а расположена ближе к равновесной кривой денатурации-ренатурации GGBP (рис. 2). Совпадающие, т. е. равновесные, кривые разворачивания и сворачивания GGBP/Glc были измерены после инкубации белка в растворах денатуранта соответствующей концентрации в течение 10 дней. Равновесные зависимости денатурации-ренатурации комплекса GGBP/Glc имеют сигмоидальный вид и сдвинуты в область больших концентраций GdnHCl по отношению к соответствующей кривой, измеренной при денатурации и ренатурации GGBP. Середина перехода между белком в нативном и развёрнутом состояниях при разворачивании под действием GdnHCl для GGBP/Glc составляет 0,93 ± 0,03М GdnHCl, тогда как для GGBP значение этой величины существенно меньше: 0,36 ± 0,10М GdnHCl.
При отщеплении иона кальция значения флуоресцентных характеристик и эллиптичности при 222 нм GGBP-Ca сильно изменяются даже при небольших денатурирующих воздействиях. Таким образом, уже в области малых концентраций GdnHCl значения всех регистрируемых характеристик GGBP-Ca и GGBP значительно различаются (см. рис. 1). В присутствии молекулы связанной глюкозы отщепление иона кальция практически не влияет на положение равновесной зависимости денатурации-ренату-рации GGBP-Ca/Glc. Следует отметить, что денатурация GGBP-Ca/Glc, как и в случае GGBP/Glc, достигает равновесия через 10 дней, в то время как равновесие при ренатурации GGBP-Ca в присутствии избытка глюкозы устанавливается даже через более длительное время инкубации белка в растворах соответствующей концентрации GdnHCl.
Исследования тепловой денатурации GGBP и его комплекса GGBP/Glc, а также их бескальциевых форм GGBP-Ca и GGBP-Ca/Glc выполнено методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии и собственной УФ-флуоресценции. Кривые теплопоглощения GGBP и GGBP/Glc имеют максимум при температуре 51,3 и 64,7 °С соответственно (рис. 3, а). Зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции
1,0 1,5 GdnHa, М
2,0 0,0
1,0 1,5 GdnHa, М
Рис. 1. Процессы разворачивания-сворачивания GGBP (кружки) и комплекса GGBP/Glc (квадраты), а также их бескальциевых форм GGBP-Cа (треугольники) и GGBP-Ca/Glc (ромбы) под действием GdnHCl:
а — изменение интенсивности триптофановой флуоресценции при длине волны регистрации 320 нм;
б — изменение анизотропии флуоресценции при длине волны возбуждения 297 нм, длина волны регистрации равна 365 нм; в — изменение параметра А; г — изменение эллиптичности при 222 нм; открытые символы отвечают разворачиванию белка, закрытые — сворачиванию из развёрнутого состояния
GGBP и GGBP/Glc от температуры имеют сигмоидальную форму со значениями температуры плавления, соответствующими максимумам кривых теплопоглощения этих форм белка (рис. 3, б). Отщепление иона кальция от GGBP приводит к заметному сдвигу кривой теплопоглощения в область меньших температур (данные не представлены), и температура плавления для GGBP-Ca составляет 42,7 °С. В то же время отсутствие иона кальция в структуре комплекса GGBP/Glc в меньшей степени сказывается на его устойчивости к действию нагревания, температура плавления бескальциевой формы комплекса GGBP-Ca/Glc равна 61,5 °С. Флуоресцентные характеристики GGBP и его комплекса GGBP/Glc, а также их бескальциевых форм GGBP-Ca и GGBP-Ca/Glc, такие как анизотропия флуоресценции и параметр А, после охлаждения до комнатной
1,0
0,9 0,8 е- 0,7
и
I
!°,6 0,5
0,4
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 GdnHa, М
Рис. 2. Конформационные переходы GGBP и GGBP/Glc через разное время инкубации белка в присутствии денатурирующего раствора, зарегистрированные по изменению параметра А = 132о/1365: кривые, характеризующие разворачивание белка, измерены через 24 ч после инкубации образца в присутствии GdnHCl для GGBP (штрихпунктирная линия и открытые кружки) и через 24 ч (пунктирная линия и открытые квадраты) и 10 дней (сплошная линия и открытые кружки) после инкубации образца в присутствии GdnHCl для GGBP/Glc; данные, характеризующие ренатурацию белка из развёрнутого состояния, были измерены после инкубации образца в растворах денатуранта соответствующей концентрации через 24 ч для GGBP (штрихпунктирная линия и закрытые кружки) и через 24 ч (закрытые квадраты) и 10 дней (закрытые кружки) для GGBP/Glc; длина волны возбуждения равна 297 нм
20
^ 16 «
л -
8 12
■о <1
1,2
£ 1,0 я о
6 3
0,8
0,6
я а с
ц 0,4
I 0,2
30 40 50 60 Температура, °С
70
0,0
б
\\ \4 \
'''V \
2'-д \ \
10 20 30 40 50 60 70 Температура, °С
Рис. 3. Зависимость избыточной теплоёмкости (а) и интенсивности триптофановой флуоресценции при длине волны регистрации 365 нм (б) белка и его комплекса
с глюкозой от температуры:
линии 1 и 2 — тепловая денатурация GGBP; линии 3 и 4 — тепловая денатурация GGBP/Glc; длина волны возбуждающего света равна 297 нм; два последовательных сканирования (сплошные и пунктирные линии) показаны, чтобы охарактеризовать обратимость тепловой денатурации белка
8
4
0
температуры белков, подвергнутых тепловой денатурации, восстанавливаются до уровня, соответствующего этим белковым формам в исходном состоянии. При нагревании белка до температуры выше окончания денатурационного перехода и продолжительной инкубации белка при высокой температуре наблюдается неполное совпадение кривых плавления белка (см. рис. 3, б), а также уменьшение интенсивности триптофановой флуоресценции и сигнала КД в ближней и дальней УФ-областях белка (данные не представлены).
Обсуждение. Характер равновесных зависимостей денатурации-ренатурации GGBP и GGBP/Glc от концентрации GdnHCl свидетельствует о том, что разворачивание белка в присутствии и в отсутствие глюкозы является обратимым одностадийным процессом. Для проверки этого предположения мы использовали подход, заключающийся в параметрическом представлении равновесных зависимостей двух экстенсивных характеристик белка, используемый для обнаружения скрытых промежуточных состояний белка в процессе его разворачивания [11]. Линейный вид таких зависимостей, построенных на основании равновесных зависимостей интенсивности флуоресценции при длине волны 320 и 365 нм GGBP и GGBP/Glc от концентрации GdnHCl свидетельствует об отсутствии промежуточных состояний на пути разворачивания белка и его комплекса с глюкозой.
Совпадение стационарных зависимостей различных характеристик GGBP при денатурации и ренатурации белка после инкубации белка в присутствии денатурирующего агента менее 24 ч свидетельствует о том, что эти зависимости являются равновесными. Процесс разворачивания-сворачивания GGBP отвечает схеме
ДОВР^^ < ДОВР^^ < ДОВР^
+Са +Са к-2 (1)
ДОВР^^ 1 (GGBP-Ca)N < ^ВР)К 1 (GGBP/Glc)N
+С1с,Са к-1 +С1с,Са к-2 +О1о к-з
Высокая скорость достижения равновесия говорит о том, что связывание кальция с (GGBP-Ca)u является быстрым процессом. Очевидно, что лимитирующей стадией процесса сворачивания в данном случае является образование нативного состояния белка (рис. 4).
Процесс разворачивания-сворачивания GGBP/Glc протекает согласно схеме (1). Поскольку GGBP имеет высокую константу связывания глюкозы — порядка 1 мкМ-1 [14], мы предполагали, что образование комплекса между GGBP и глюкозой не может быть лимитирующей стадией этого процесса. Однако кривые ренатурации и денатурации комплекса GGBP/Glc после 24-часовой инкубации растворов белка в присутствии денатурирующего агента не являются равновесными, более того, кривая ренатурации GGBP/Glc практически совпадает с равновесной кривой разворачивания-сворачивания GGBP. Такая ситуация свидетельствует о том, что формирование комплекса GGBP в нативном состоянии с глюкозой является лимитирующей стадией процесса образования нативного комплекса GGBP/Glc из (GGBP)u в присутствии избытка иона кальция и глюкозы. Равновесие достигается через 10 дней инкубации растворов белка в растворах GdnHCl соответствующей концентрации, когда кривая ренатурации GGBP/Glc совпадает с кривой его денатурации (см. рис. 1, 2). Мы предполагаем, что низкая скорость достижения равновесия между комплексом GGBP/Glc в нативном состоянии и белком в развёрнутом состоянии связана с тем, что присутствие в растворе GdnHCl приводит к увеличению его вязкости. Подобный эффект не наблюдался при тепловой денатурации комплекса GGBP/Glc. Перед установлением равновесия в течение
(GGBP-Ca)U
" ^AG2
(GGBP-Ca)N
(GGBP)N(
А&
Аа
(GGBP/Glc)N
Рис. 4- Наглядное изображение формирования нативного состояния белка в отсутствие и в присутствии глюкозы из развёрнутого состояния белка при разворачивании-сворачивании GGBP и GGBP/Glc под действием химического денатуранта GdnHCl: значение свободной энергии Гиббса АСх и ДС2 характеризует стабильность GGBP/Glc и GGBP соответственно; АСз = АСх — Д02 может быть использовано для определения константы связывания белка с глюкозой в условиях, когда рабочие концентрации глюкозы влияют на равновесные концентрации (GGBP/Glc)^ и (GGBP)^
продолжительного времени существует избыточное количество (по отношению к равновесной величине) молекул комплекса в нативном состоянии (GGBP/Glc)N на пути разворачивания белка и молекул белка в развёрнутом состоянии (GGBP)u на пути ренатурации белка, поскольку в обоих случаях требуется преодоление высокого акти-вационного барьера. На пути разворачивания элементарное событие диссоциации комплекса GGBP с глюкозой не приводит к нарушению конфигурационного соответствия между белком в нативном состоянии и молекулой глюкозы, и вероятность обратной реакции велика. Тогда как на пути сворачивания для образования нативного комплекса GGBP/Glc необходимо не только формирование белка в нативном состоянии, но и возникновение конфигурационного соответствия между (GGBP)N и молекулой глюкозы. Скорость этих процессов изменяется с увеличением/уменьшением концентрации денатурирующего агента. Существенное влияние вязкости раствора на процессы взаимодействия белка с глюкозой, выявленное при изучении процессов его денатурации-ренатурации под действием GdnHCl, было подтверждено в экспериментах по изучению взаимодействия белка с глюкозой с присутствием глицерина (данные не представлены).
Сдвиг равновесной кривой денатурации-ренатурации GGBP/Glc в область больших концентраций денатурирующего агента по сравнению с аналогичной кривой GGBP свидетельствует о стабилизирующем действии молекулы глюкозы на структуру белка. Мы проанализировали равновесные зависимости интенсивности флуоресценции при длине волны 320 и 365 нм GGBP и GGBP/Glc, а также их бескальциевых форм от концентрации GdnHCl согласно стандартной методике [12] для определения разности свободной энергии Гиббса. Значение свободной энергии для GGBP/Glc (3,37 ± 1,07 ккал/моль) практически в два раза превышает её значение для GGBP (1,92 ± 0,90 ккал/моль). Эти данные подтверждают стабилизирующую роль молекулы глюкозы на структуру белка. Значение свободной энергии Гиббса для бескальциевой формы белка GGBP-Ca надёжно определить не удалось, поскольку невозможно оценить интенсивность флуоресценции для нативного состояния белка (см. рис. 1). Однако очевидно, что эта форма
белка очень нестабильна. В то же время при отщеплении иона кальция от GGBP/Glc значение свободной энергии Гиббса практически не меняется (3,18 ± 1,05 ккал/моль). Эти данные свидетельствуют о том, что ион кальция стабилизирует структуру GGBP в открытой форме, т. е. в отсутствие глюкозы.
Эксперименты по тепловой денатурации GGBP также подтверждают стабилизирующее действие глюкозы на структуру белка и необходимость присутствия иона кальция в связанном виде для поддержания устойчивости GGBP в открытой форме к различным внешним воздействиям. Как и разворачивание под действием химического агента, тепловая денатурация GGBP и его комплекса GGBP/Glc, и их бескальциевых форм является обратимой. Частичная необратимость тепловой денатурации, выражающаяся в неполном совпадении кривых плавления (см. рис. 4) и в уменьшении интенсивности триптофановой флуоресценции и сигнала КД в ближней и дальней УФ-областях белка, возникает при продолжительной инкубации белка при температуре выше окончания денатурационного перехода. Это связано с тем, что тепловая денатурация GGBP в присутствии и в отсутствие лигандов осложнена агрегацией, вызванной продолжительной инкубацией белка в развёрнутом состоянии при высокой температуре. Степень агрегации молекул белка зависит от концентрации белка, температуры и длительности инкубации.
Полученные результаты необходимо учитывать при конструировании биосенсорной системы на глюкозу с GGBP в качестве чувствительного элемента.
Литература
1. Ramachandran A., Moses A., Shetty S. et al. A new non-invasive technology to screen for dysglycaemia including diabetes // Diab. Res. Clin. Pract. 2010. Vol. 88. N 3. P. 302-306.
2. ErvinK. R., KiserE. J. Issues and implications in the selection of blood glucose monitoring technologies // Diabetes Technol. Ther. 1999. Vol. 1. N 1. P. 3-11.
3. Moschou E. A., SharmaB. V., Deo S. K., DaunertS. Fluorescence glucose detection: advances toward the ideal in vivo biosensor //J. Fluoresc. 2004. Vol. 14. N 5. P. 535-547.
4. TolosaL. On the design of low-cost fluorescent protein biosensors // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2009. Vol. 116. P. 143-157.
5. Shilton B. H., Flocco M. M., Nilsson M., Mowbray S. L. Conformational changes of three periplasmic receptors for bacterial chemotaxis and transport: the maltose-, glucose/galactose- and ribose-binding proteins // J. Mol. Biol. 1996. Vol. 264. N 2. P. 350-363.
6. Tura A., Maran A., Pacini G. Non-invasive glucose monitoring: Assessment of technologies and devices according to quantitative criteria // Diabetes Research and Clinical Practice. 2007. Vol. 77. P. 16-40.
7. Amiss T. J., ShermanD. B., Nycz C. M. et al. Engineering and rapid selection of a low-affinity glucose/galactose binding protein for a glucose biosensor // Protein Sci. 2007. Vol. 16. P. 2350-2359.
8. Oliver N. S., Toumazou C., Cass A. E., Johnston D. G. Glucose sensors: a review of current and emerging technology // Diabet. Med. 2009. Vol. 26. N 3. P. 197-210.
9. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterio-phage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. N 5259. P. 680-685.
10. Turoverov K. K., Kuznetsova I. M. Intrinsic fluorescence of actin //J. Fluorescence. 2003. Vol. 13. P. 41-57.
11. Kuznetsova I. M., Turoverov K. K., Uversky V. N. Use of the phase diagram method to analyze the protein unfolding-refolding reactions: fishing out the "invisible" intermediates //J. Pro-teome Res. 2004. Vol. 3. P. 485-494.
12. NoltingB. Protein Folding Kinetics. Biophysical Methods. Berlin; Haidelberg, 1999. 191 p.
13. Levitsky D. I., Rostkova E. V., Orlov V.N. et al. Complexes of smooth muscle tropomyosin with F-actin studied by differential scanning calorimetry // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. N 6. P. 1869-1877.
14. Vyas N. K., Vyas M. N., Quiocho F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein // Science. 1988. Vol. 242. P. 1290-1295.
15. BorrokM. J., KiesslingL. L., Forest K. T. Conformational changes of d-glucose/D-galactose binding protein illuminated by apo and ultrahigh resolution ligand-bound structures // Prot. Sci. 2007. Vol. 16. P. 1032-1041.
Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.
