CC BY
24
Научни трудове на Съюза на учените в България-Пловдив, серия Б. Естествени и хуманитарни науки, т.ХУЬ Научна сесия „Техника и технологии, естествени и хуманитарни науки", 30-31 Х 2013 Scientific researches of the Union of Scientists in Bulgaria-Plovdiv, series B. Natural Sciences and the Humanities, Vol. XVI.,ISSN 1311-9192, Technics, Technologies, Natural Sciences and Humanities Session, 30-31 October 2013
провеждане на молекулно маркерна селекция при
ПИПЕР ЗА ПОВИшАВАНЕ НА КАЧЕСТВОТО И ИЗБОРА НА ДОНОРИ ЗА Fj хИБРИДИ
Величка Спасова-Апостолова, Нася Томлекова, Величка Тодорова Институт по зеленчукови култури „Марица", Пловдив
Conducting molecular marker-assisted selection in pepper for increasing quality and selection of donors for Ft hybrids Velichka Spasova-Apostolova, Nasya Tomlekova, Velichka Todorova Maritsa Vegetable Crops Research Institute, Plovdiv
Abstract
Carotenoids are by-substances determining the quality of sweet pepper thanks to their antioxidant properties. The availability of male sterility facilitates the developing of Fj hybrids without the labour-intensive process of castration. The application of previously established molecular markers is studied in advanced mutant breeding lines. The investigation is aimed at conducting marker-assisted selection (MAS) during seedling stage, corresponding to the pepper hybridisation programmes. As a result of the study, the effectiveness of the molecular markers for early selection of the developed lines with high concentrations of p-carotene in pepper fruits is confirmed. Molecular markers for identification of sterile and fertile plants are also selected. The investigation is with applied value and is currently used for diminishing the production costs in the pepper breeding process.
Keywords: Capsicum annuum L., p-carotene, mutation, male sterility
Въведение
Богатите на каротен зеленчуци, като моркови, пипер и домати са полезни за поддържане на здравословен хранителен режим, тъй като те съдържат изобилие от каротеноиди, които действат като мощни антиоксиданти [9].
В селското стопанство на България пиперът е предимно от вида (Capsicum annuum L.) и заема значителен дял както по площ, така и по произведена продукция. Пиперът е традиционно важш растителга ^m^a в България, която се консумира в големи количества и е един от основните източници на биологично активното вещество Р-каротен с превантивна роля за здравето на човека [19]. През 1960 г. е установено, че р-каротенът помага на хора с еритропатична протопорфирия [7]. Доказана е ролята на каротеноидите в предпазването от рак, която се дължи на техния антиоксидантен ефект [5], [6], [23]. Чрез мутационните селекционни програми могат да се създадат сортове и Fj хибриди с по-високо съдържание на каротеноиди [17].
През 1998 г. за първи път са публикувани секвенциите на кДНК на Р-каротен хидроксилазните CrtZ1 и CrtZ2 гени при образци от пипер [4].
Чрез информацията за кДНК е изследван мутантният, Оранжева капия и съответният изходен сорт, Пазарджишка капия 794 [20], [14]. Допуска се, че мутацията в гена, кодиращ ß-каротен хидроксилаза-2 (CrtZ2), води до блокиране функцията на ензима и натрупване на високи нива на метаболита ß-каротен в плодовете [22]. Генът CrtZ2 е изолиран в седем оранжеви сортове пипер, а напълно идентичните им последователности са публикувани [8]. Установената пълна последователност на гена е с дължина 2150 bp и съдържа шест интрона и седем екзона.
Чрез третиране на сорт пипер Maor с етил метан сулфонат в M2 популация е установена мутация, която води до фенотипна промяна в цвета на плодовете от червен в оранжев [13]. При този мутант е установен единичен нуклеотиден полиморфизъм, транзиция на аденин с гуанин в мутантния алел на 709 позиция в кДНК на CrtZ2 [3].
В България първият регистриран сорт от вида Capsicum annuum L. с оранжев цвят на плодовете е Оранжева капия [1], характеризиращ се с повишена концентрация на ß-каротен [16]. Генът CrtZ2 е отговорен за синтеза на ензим, участващ в превръщането на ß-каротен в ß-криптоксантин в плодовете на пипера. Мутацията в CrtZ2 гена (bc рецесивна мутация) води до блокиране на функцията на кодирания от него ензим и натрупване на високи нива на метаболита ß-каротен в плодовете и в технологична, и в ботаническа зрялост. При него е разработен CrtZ-C/C молекулен маркер, който се базира на ДНК полиморфизъм в ß-каротен хидроксилазния ген между мутантни и изходни генотипове пипер [18]. Чрез PCR реакция с праймери CrtZ-C/C се установяват растения, от които се развиват оранжеви плодове със завишена концентрация на ß-каротен.
Досега диференцирането на фертилни и стерилни (ms8ms8) растения е осъществявано чрез цитологични методи и на базата на различия в морфологията на бутоните [15], [10]. При тази мутация в генотипове пипер е изучена фертилността на полена, за да бъде използвана в селекционните програми при създаване на нови мъжко стерилни линии. Установено е пълното доминиране на алел Ms при хибриди в хетерозиготно състояние (Msms) [11]. Използването и поддържането на мъжко стерилни линии е от голямо значение за създаването на Fj хибриди и постигане на хетерозисен ефект. Златен Медал ms8 (линия 28) е създадена от Даскалов през 1987 [1]. В ИЗК „Марица"-Пловдив в рамките на проектите CRP1227 и CRP15406 (ФАО-МААЕ) са проведени селекционни програми за създаване на нови мъжко стерилни линии с прехвърляне на ms8 мутацията в други генотипове, включително такива, с оранжеви плодове с bc мутацията (линия 30 и др.) [12]. Разработени са молекулни маркери, свързани с ms8 локуса [2]. Учените са използвали RAPD-BSA-базирани анонимни маркери и са създали четири специфични SCAR маркери, свързани с ms8-локуса на долното рамо на хромозома Р4. Целта на изследването е да се проучи приложимостта на създадените молекулни маркери, основаващи се на PCR-реакции за ранна селекция на растения от пипер, с потенциал за високи нива на ß-каротен в плодовете (bc мутация), както и за идентифициране на стерилни (ms8 мутация) и фертилни растения.
Материали и методи Растителен материал
Изследването е проведено в Института по зеленчукови култури „Марица" през 2013 г. с мутантни линии 75/10 (ВС2Р^2) с оранжеви плодове и стерилни цветове. За сравнение са използвани и съответните контроли, изходни линии с червени плодове и фертилни растения. При кръстоската Златен Медал тьв (28) с червен цвят на плода х Ока1 (30) с оранжев цвят на плода и високи концентрации на Р-каротен е установено разпадане на признаците на червени и оранжеви, както и разпадане на стерилни и фертилни в F2 разпадащите поколения. Отбрани са стерилни растения с оранжеви плодове.
Проведени са два беккроса с Ока1 (30), след което в поколението е наблюдавана
стабилност на признака цвят, като всички растения са с оранжев цвят на плода и съответно високи концентрации на ß-каротен. Растителните материали са отглеждани по приетата технология в института за средно ранно полско производство. Като контрола в изследването с молекулния маркер за оранжев цвят на плода и висока концентрация на ß-каротен е използвана ДНК от линия 28 с червен цвят на плодовете. За контрола в изследването с молекулните маркери за стерилни растения са използвани фертилните растения, с които се поддържа стерилната линия.
Молекулярни методи
ДНК е изолирана, чрез стандартния протокол на Nucleon PhytoPure Kit (General Electric Healthcare каталожен J№ RPN-8511 ) Проверката на количеството и качеството на изолираната ДНК е извършена на 1 % LE агарозен гел (Lonza, кат. № 50004L) при сравняване с DNA Ladder Gene Ruler 100 bp Plus DNA (VWR, кат. № 437263T, Белгия). Проведени са PCR реакции с геномната ДНК от 10 линии пипер 75/10 и контролните линии. Използвана е праймерна двойка CrtZ-C/C (табл. 1) от Tomlekova et al. [18] за установяване на полиморфизъм между изходни (червен плод) и мутантни растения, с оранжев плод и високи концентрации на ß-каротен (табл. 1). Проведени са също така и PCR реакции с праймерни двойки: P2F/P2R, V17/V17, N2/N2 и V01/V01 (табл. 2) с PCR програми, публикувани от Bartoszewski et al. [2]. За реакциите в общ обем 25 ^L са използвани VWR Taq x RED Master Mix (VWR, кат. № 733-2547, Белгия), 100 ng ДНК матрица и съответните праймери. Резултатите от PCR анализите са визуализирани чрез електрофореза на 1.5 % агарозен гел с етидиев бромид в стандартен 1x TAE buffer и са престояли 2 h при 3 V/cm в две електрофоретични системи (Bio-Rad, USA и GE Healthcare Lifescience - Швейцария).
За сравнение на дължината на фрагментите е използван Gene Ruler 100 bp Plus DNA Ladder (VWR, кат. № 437263T, Белгия) и 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific, кат. №SM1103, САЩ). Документирани са чрез гел-документиращата система (GenoMini, VWR, Белгия).
Резултати и обсъждане
Използването на молекулен маркер за високи ß-каротенови концентрации с CrtZ-C/C праймерната комбинация показва ясно разграничим полиморфизъм (фиг. 1).
Ladder
76/10 75/10
Фигура 1. PCR фрагменти, амплифицирани с праймерна двойка CrtZ-C/C. Старт 1 - 1 kb DNA Ladder; старт 2 - 30 (оранжев плод); старт 3 - контрола (28) (червен плод); 75/10 (оранжев плод); 75/10 (оранжев цвят на плодовете).
При ДНК от растения с червени плодове (контрола) се амплифицират два фрагмента от двете известни при пипера Р-каротен хидроксилази. Единият е с дължина 622 bp, съоветстваща на очакваната публикувана пълна секвенция на CrtZ2 гена в генбанката на NCBI (образци: GU122940; GU122941; GU122942; GU122943; GU122944; GU122945; GU122946). Вторият фрагмент е с видима дължина приблизително 770 bp, сравнен с 1 kb DNA Ladder (фиг. 1) и 100 bp DNA Ladder и е амплифициран от CrtZ1 гена, съответстващ в генбанката на NCBI (образец: Y09722). На този етап от изследването не е възможно да бъде определена с точност очакваната дължина, тъй като пълната секвенция на CrtZ1 не е публикувана в генбанката на NCBI. Праймерите са конструирани така, че да амплифицират фрагменти и от двата гена при пипера. Хомоложността на двата праймера и CrtZ1 гена
е 95%, установено чрез биоинформатичен анализ и секвенциите на предварително изолирани фрагменти от С^1 [21]. При ДНК проби от мутантни растения с оранжев цвят на плодовете и високи концентрации на Р-каротен в тях се наблюдава само един фрагмент от приблизително 770 Ьр (табл. 1).
Таблица 1. Резултат от PCR за установяване на растения със завишена концентрация на ß-каротен.
Праймери Праймерни секвенции Дължина на фрагментите
очаквана 75/10 мутант оранжев плод 28 контрола червен плод
CrtZC-F CrtZC-R F:GAGCTGAACGATATTTTTGCC R:TAGGAACAAGCCATATGGGA 770 622 770 770 622
Резултатите от проведените молекулярни анализи са потвърдени фенотипно във фаза масово плододаване. Получените резултати доказват приложимостта на маркера CrtZ-C/C в селекционната програма за разграничаване на изходни растения с червени плодове и мутантни растения с bc мутация. С CrtZ-C/C молекулния маркер могат да бъдат установени и отбрани растенията 75/10 (28 x 30) BC2P2F2 с bc мутацията, детерминираща оранжев цвят на плодовете и високи концентрации на ß-каротен в тях.
Чрез проведените PCR реакции се установи приложимостта в нашата колекция на разработените от Bartoszewski et al. [2] праймерни двойки P2F/P2R, V17F/V17R, N2F/ N2R и V01F/V01R за идентифициране на стерилни мутантни (ms8ms8) и фертилни (MsMs) растения. При експеримента с праймерни двойки V17F/V17R и N2F/ N2R с ДНК, изолирана от фертилни и стерилни растения, се наблюдава амплификация на фрагменти, съответстваща на публикуваните Bartoszewski et al. [2] дължини (табл. 2).
Таблица 2. Резултат от PCR с P2F/P2R, V17F/V17R, N2F/ N2R и V01F/V01R праймерни двойки.
Праймерни секвении Очаквана дължина на фрагмента Резултат от PCR амплификация
75/10 75/10 фертилни стерилни
P2F:AAGCCAACAGGGGGTATCGCATAAGCA P2R:GGAAGCCAACAACACCCATATTTTCCA 537 Слабо различим поли-морфизъм межу стерилни и фертилни растения
V17F:ACCGGCTTGTCCCCGTGGA V17R:ACCGGCTTGTATGACTCTCTA 317 Не се установява ясен поли-морфизъм, който да послужи за целите на селекцията
N2F:ATACCCAAATCCCACCGTTCA N2R:AATAGGACTCAAACTTCGACGAAA 265 Не се установява ясен поли-морфизъм, който да послужи за целите на селекцията
V01F:ACATGGCCTGAGTATCGTGAA V01R:TGTAACCATCTCCCAAATAGAGC 358 Липсва амплификация
Установени са разлики в подвижността на амплифицираните фрагменти, но резултатът не позволява ясно разграничаване на фертилни и стерилни растения. С праймерна двойка V01F/V01R липсва амплификация. Единствената двойка, която дава възможност да се установи полиморфизъм между стерилни и фертилни растения при изследваните генотипи е P2F/P2R. Допълнително за PCR реакцията с праймерна двойка P2F/P2R е оптимизиран протоколът за визуализиране на резултата. Електрофорезата е извършена по-продължително време (180 мин.), което позволява установяване на различната подвижност на анализираните фрагменти на агарозния гел (фиг. 2)
1 2 3 4 5
Фигура 2. PCR фрагменти, амплифицирани с праймерна двойка P2F/P2R.
Старт 1-2 - фертилни, старт 3-4 - стерилни растения, старт 5 - 100 bp DNA Ladder.
С тази процедура се установява полиморфизъм само с първата праймерна двойка и се потвърждава неговата приложимост в селекционните програми за установяване на фертилни и стерилни растения в колекцията от пипер. Резултатите от проведените молекулярни анализи за установяване на стерилни и фертилни растения са потвърдени във фаза бутонизация.
Извод
От проведените експерименти е установено, че за целите на селекционните програми
при
пипер са приложими следните два молекулни маркера - CrtZC/C, свързан с bc рецесивен
алел за завишени концентрации на ß-каротен, съответно оранжев плод при пипера и SCAR_P2 - маркер, свързан с ms8 рецесивен алел за мъжка стерилност.
По този начин, с прилагането на молекулни маркери в селекционната практика и провеждането на молекулярна селекция може да се ускори съчетаването на ценни признаци в един генотип, като високи концентрации на ß-каротен, който е с биологична активност в човешката храна и стопански значимият признак - мъжка стерилност, които отговарят на съвременните тенденции в хибридизационните програми при пипера, насочени към повишаване на качеството на плодовете.
Благодарности
Изследването беше извършено с финансовата подкрепа на Международната агенция за атомна енергия, Виена, Австрия, в рамките на проект CRP15406, както и BUL2012003.
Литература
[1] Даскалов, С. Проучвания по мутагенезис и хетерозис при пипера (Capsicum annuum L.). Дисертация: Институт по генетика „Д. Костов" - БАН, София, 1987, 315 стр.
[2] Bartoszewski, G., Waszczak, C., Gawron'ski, P., Stepien, I., Goszewska, B. H., Palloix, A., Lefebvre, V., Korzeniewska, A., Niemirowicz-Szczytt, K. Mapping of the ms8 male sterility gene in sweet pepper (Capsicum annuum L.) on the chromosome P4 using PCR-based markers useful for breeding programmes. // Euphytica, 2012, 186: 453-461.
[3] Borovsky, Y., Tadmor, Y., Bar, E., Meir, A., Lewinsohn, E., Paran, I. Induced mutation in P-carotene hydroxylase results in accumulation of P-carotene and conversion of red to orange color in pepper fruit. // Theoretical and Applied Genetics, 2013, 126(3): 557-565.
[4] Bouvier, F., Keller, Y., d'Harlingue, A., Camara, B. Xanthophyll biosynthesis: molecular and functional characterization of carotenoid hydroxylases from pepper fruits (Capsicum annuum L.). // Biochimica & Biophysica Acta, 1998, 1391: 320-328.
[5] Carsten, R., Burke, D. Nutritional Significance and Measurement of Carotenoids. // Current Topics
27
in Nutraceutical Research, 2004, 2(2): 79-91.
[6] Compbell, R., Cross, D., Martini, C., Grandits, A., Slavin, L., Potter D. Plasma Carotenoids as Biomarkers of Vegetable and Fruit Intake Cancer Epidemiology. //Biomarkers & Prevention, 1994, 3: 493500.
[7] Deming, D., Boileau, T., Heintz, K., Atkinson, C., Erdman, J. Carotenoids Linking Chemistry, Absorption, and Metabolism to Potential Roles in Human Health and Disease. In: Cadenas, E. and Packer, L. (Eds), Handbook of Antioxidants, New York, 2001, pp. 189-628.
[8] Guzman, I., Hamby, S., Romero, J., Bosland P., O'Connell, M. Variability of Carotenoid Biosynthesis in Orange Colored Capsicum spp. // Plant Science, 2010, 179(1-2): 49-59.
[9] Inakuma, T. Effects of Carotenoids and Carotene-Rich Vegetables on Human Health. // Foods & Food Ingredients Journal of Japan, 2007, 212(7): 329-2762.
[10] Nikolova, V., Todorova, V., Daskalov, S., Todorov, Y. Study of Pollen Fertility in some Hybrids of Pepper (C. annuum L.) on the Basis of Nuclear Male Sterility. // First Symposium on Horticulturae. Republic of Macedonia Skopje, 2002, pp. 324-328.
[11] Nikolova, V., Todorova, V., Daskalov, S., Todorov, Y., Stoeva, V. Pollen fertility of pepper cultivars and their hybrids on male sterility basis. // Capsicum and Eggplant, 2001, 20: 50-52.
[12] Nikolova, V., Todorova, V., Stefanova, Y., Tomlekova, N. Cytological particularities in nuclear and nuclear-cytoplasmic male sterile pepper lines. // Caryologia, 2010, 63(3): 262-268.
[13] Paran, I., Borovsky, Y., Nahon S., Cohen, O. The use of induced mutations to study shoot architecture in Capsicum. //Israel Journal of Plant Sciences, 2007, 55(2): 125-131.
[14] Petrov, V., Denev, I., Draganov, M., Timin, O., Panchev, I., Tomlekova, N. Molecular characterization of advanced mutants for early detection of high P-carotene concentrations in pepper breeding programmes. // Comptes rendus de l'Academie bulgare des sciences. Bulgaria, 2013, 66(2): 303-310.
[15] Stefanova, Y., Nikolova, V., Todorova, V. Cytological investigation of F2 hybrid progeny on the basis of nuclear male-sterility in pepper (Capsicum annuum L.). // Proceeding of the 45th Croatian and 5th International Symposium on Agriculture. - Opatija, 2010, pp. 509-513.
[16] Timina, O., Timin, O., Fiodoroff, S., Tomlekova, N. Inheritance of pericarp color pattern and P-carotene content in vegetable pepper. // Vavilov Journal ofGenetics and Breeding, 2011, 15(3): 585-594.
[17] Timina, O., Timin, O., Tomlekova, N., Valchev, N. Directions and results of the sweet pepper breeding for Transnistria and Russian Federation Environment. // VIII International Scientific Conference "Factors experimental evolution of organisms", 23-27 September 2013, Alushta, Crimea, Ukraine, pp. 262266.
[18] Tomlekova, N., Panchev, I., Yancheva, S., Todorova, V., Baudoin, J.P., Daskalov, S. Established molecular marker in pepper mutants with orange fruit colour and application in crop breeding for high beta-carotene. // Proceedings of the International Scientific Conference "Plant germplasm basis of the modern agriculture", 13-14 June 2007, Plovdiv (Bulgaria), p. 379-383.
[19] Tomlekova, N., Todorova, V., Daskalov, S., Denev, I. Biochemical evaluation of increased beta-carotene levels in pepper mutants. // The 3rd Central European Congress on Food, Sofia, Bulgaria, 2006 pp. S7-7/1-9.
[20] Tomlekova, N., Todorova, V., Petkova, V., Yancheva, S., Nikolova, V., Panchev, I., Penchev, E. Creation and evaluation of induced mutants for pepper breeding programmes. // Proceedings of FAO/IAEA International Symposium on Induced Mutations in Plants, Vienna, Austria, 2009, 209.
[21] Tomlekova, N., Yancheva, S., Todorova, V., Panchev, I., Marinova, D., Baudoin, J.-P., Daskalov, S. Biochemical and molecular characterization of high carotene sweet pepper mutants assessed their biological value. The 15th International Symposium on Carotenoids, 22-28 June 2008, Carotenoid Science, V. 12: 141.
[22] Tomlekova, N., Panchev, I., Daskalov, S., Todorova, V. Analysis of P-carotene hydroxylase activity in pepper (Capsicum annuum L.) mutants. Proceedings of the International Conference on Horticulture "PostGraduate Study System and Conditions in Europe", 16th - 19th November 2004, Lednice, Czech Republic, pp. 223-226
[23] Yoshida, T., Maoka, T., Das, K., Kanazawa, K., Horinaka, M., Wakada, M., Satomi, Y., Nishino, H., Sakai, T. Halocynthiaxanthin and Peridinin Sensitize Colon Cancer Cell Lines to Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand. // Mol Cancer Res, 2007, 5(6): 25-615.
