CC BY
89
Павлова Ю.А.12, Неустроева А.Н.12
1Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН 2Пермский государственный университет E-mail: [email protected]
ЗДМБИОТИЧЕСКИЕ ПОЧВЕННЫЕ БАКТЕРИИ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ НИТРИЛЫ И АМИДЫ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
Исследовано содержание бактерий, трансформирующих нитрилы и амиды, в образцах подзолистых почв естественной среды Пермского края. Установлено, что изолируемые культуры образуют симбиотические ассоциации, способные более активно метаболизировать нитрилы как субстрат. Основная часть микроорганизмов, обладающих нитрилгидратазной или амидаз-ной активностью, представлена актинобактериями рода ЙЬобососсив (35% изолятов). Показано, что некоторые изоляты ЙЬобососсив обладают избыточно высокой активностью нитрилгид-ратазы и амидазы, что, вероятно, связано с их ролью в ассоциации.
Ключевые слова: биоразнообразие, амидаза, нитрилгидратаза, симбиоз.
Существуют различные пути метаболизма нитрилов, распространенные как у бактерий, так и у эукариот: 1) гидролиз в котором участвуют два фермента - нитрилгидратаза и амидаза, или один - нитрилаза; 2) окисление, катализируемое оксигеназой, с последующим гидролизом оксинитрилазой; 3) восстановление с участием нитрогеназы. У бактерий известны два альтернативных пути гидролиза нитрилов: двустадийный, в котором участвуют два фермента - нитрилгидратаза (КФ 4.2.1.84) и амидаза (КФ 3.5.1.4) и одностадийный гидролиз, осуществляемый нитрилазой (КФ 3.5.5.1), дающие возможность получать важные химические продукты [4].
Происхождение системы метаболизма нитрилов и амидов у бактерий, вероятно, связано с поступлением в почву с экссудатом корней растений некоторых метаболитов нит-рильной природы, в частности, индол-3-аце-тонитрила - предшественника индолилуксус-ной кислоты (ауксина) в одном из альтернативных путей биосинтеза.
Микроорганизмы, активно использующие амиды и нитрилы в качестве ростового субстрата, обнаружены среди бактерий различных таксономических групп: Agrobacterium, Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Pseudomonas, Rhodococcus, и др. [1,2,4,5]
Амидазы - ферменты, катализирующие гидролиз амидов с образованием соответствующих карбоновых кислот и аммония. Они открыты у многих бактерий и эукариотических организмов различных таксономических групп. У прокариот амидазная активность часто сопряжена с метаболизмом нитрилов в нитрилгида-ратзно-амидазном пути, однако алифатические
амидазы встречаются и у бактерий, метаболизи-рующих нитрилы с участием нитрилаз, а также и у не способных трансформировать эти соединения. Известно также, что распространение ферментных систем разных типов, способных трансформировать различные виды субстратов, не является видоспецифическим признаком [1,3].
Данная работа посвящена исследованию симбиотических почвенных микроорганизмов, обладающих амидазной активностью.
Скрининг почвенных бактерий,
трансформирующих нитрилы и амиды
Исследовано биологическое разнообразие бактерий, способных активно метаболизировать амиды и нитрилы карбоновых кислот, в образцах подзолистой супесчаной лесной почвы (ПЛ), собранных на территории Пермского края. Методом прямого высева определяли количество культивируемых гетеротрофных микроорганизмов, способных утилизировать ацетонитрил или аце-тамид в качестве единственного источника углерода. Содержание в почве жизнеспособных бактерий оценивали по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) в грамме почвы в пересчете на сухой вес. Для первичного отбора микроорганизмов использовали минеральную агаризован-ную среду N [2], содержащую 10 мМ ацетамид или ацетонитрил. У всех клонов, выросших на данной среде, периодически измеряли амидазную и нитрилгидратазную активность, как описано ранее [1]. Для подсчета общего количества гетерот-рофов, а также очистки и проверки гомогенности культур использовали посев на полноценную среду Луриа-Бертани ^В). Идентификацию бактерии проводили по совокупности культурально-
морфологических, хемотаксономических и биохимических признаков, а также путем ПЦР-ана-лиза с видоспецифичными праймерами к генам 16S РНК и секвенирования генов 16S ДНК.
Бактерии, трансформирующие нитрилы, были обнаружены во всех исследованных образцах почв в количестве 104-107 КОЕ/г сухой почвы.
Определены соотношения количества бактерий, трансформирующих производные карбоновых кислот, и общего числа культивируемых аэробных гетеротрофов Наибольшее их процентное содержание отмечено в гумусовом горизонте. Очевидно, это связано с высоким содержанием органического вещества в верхних слоях и наличием корневой системы растений, с которыми ассоциирована симбиотическая и сопутствующая микрофлора.
Установлено, что изолируемые культуры образуют симбиотические сообщества, трудно разделяемые на селективной среде, способные более активно метаболизировать нитрилы, как основной источник углерода и азота. При прямом высеве на селективную среду из почвенного экстракта такие сообщества, состоящие из 25 культур бактерий разных видов, росли совместно в виде гомогенных, либо различающейся в периферической части колоний.
Такие ассоциации, составлявшие до 9% колоний, как правило сохранялись при пересеве на минимальную среду, но легко разделялись на среде LB.
Таксономический анализ показал, что большую часть активных изолятов составляют ак-тинобактерии рода Rhodococcus.
Установлено, что большая часть изолятов способна к быстрому росту на среде с нитрилом или амидом, но не проявляет значительной ферментативной активности ни на одной из стадий роста.
Для дальнейших исследований были взяты культуры рода Rhodococcus, выделенные из ассоциаций, но растущие отдельно на селективной среде и обладающие при этом высокой ами-
дазной и нитрилгидратазной активностью (более 5 мкмоль/мг/мин). Способность данных культур к самостоятельному росту на минимальной среде свидетельствует о том, что их роль в ассоциации заключается в первичном гидролизе субстрата с образованием ацетата, в то время, как они могут получать от других бактерий полезные метаболиты.
Зависимость амидазной и нитрилгидра-тазной активности изолятов от фазы роста на среде с ацетонитрилом
Были исследованы ростовые характеристики и зависимость амидазной и нитрилгидра-тазной активности от фазы роста выделенных штаммов Я. втуШтороНз 4-1 6 4-1 7, 6-1 2, Я. тНойосНтоыз 11-8 и Я. вуНтороШ 11-2. Культуры выращивали на минеральной среде N содержащей 0,1 % глюкозу и 10 мМ ацетонитрил.
Максимальная активность амидазы и нит-рилгидратазы штамма Я. втуЬНтороИз 6-2 1 наблюдалась в первой половине экспоненциальной фазы и составляла 18,18 и 21,14 мкмоль/ мг/мин соответственно. При дальнейшем культивировании плотность суспензии увеличивалась, но наблюдалось падение активности обоих ферментов. Аналогичным образом изменялась активность ферментов у штамма Я. втуЬНтороИз 4-1 6, однако его амидазная активность, достигавшая 7,7 мкмоль/мг/мин, была значительно ниже нитрилгидратазной, составлявшей в максимуме 18,22 мкмоль/мг/мин.
У штамма Я. тНойосНтоыз 6-2-1, в данных условиях амидазная активность, была в 1,8 раза выше, чем нитрилгидратазная.
Таким образом, очевидно, что исследуемые изоляты ЯНойососсыз обладают избыточно высокой активностью нитрилгидратазы и амида-зы, что, вероятно, связано с их ролью в ассоциации как культуры, осуществляющей первичное расщепление нитрила или амида с образованием доступного субстрата - карбоновой кислоты (в случае нитрила - ацетата).
21.02.2011
Список литературы:
1. Кузнецова М.В., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В., Демаков В.А. Распространение нитрилконвертирующих бактерий в почвах Пермского края // Вестник Перм. ун-та. - 2007. - Т.5(10). - С.96-99.
2. Максимов, А.Ю., Кузнецова М.В. , Овечкина Г.В., Демаков В.А. Влияние нитрилов и амидов на рост и нитрилгид-ратазную активность штамма ЯНойососсыз 8р. gt1 // Прикладная биохимия и микробиология. - 2003. - Т. 39. - № 1. - С. 63-68.
3. Перцович С.И. Гуранда Д.Т., Подчерняев Д.А., Яненко А.С., Швядас В.К. Алифатическая амидаза из ЯНойососсыз
тНойосНтоыз- представитель семейства нитрилаз/цианидгидратаз // Биохимия. - 2005. - Т.70. - С.1556-1565.
4. Banerjee A., Sharma R., Banerjee U.C. The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2002. - V. 60. -P. 33-44.
5. Cowan D., Cramp R., Pereira R. et al. Biochemistry and biotechnology of mesophilic and thermophilic nitrile metabolizing enzymes // Extremophiles. - 1998. - V. 2. - № 3. - P. 207-216.
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, проект 2009-1.1-201-018 и АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 гг.)», проект №2.1.1/12133
Сведения об авторах:
Павлова Юлия Андреевна, аспирант, лаборатория химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов 614000, г. Пермь, ул. Ленина, 11, тел. (342) 2124476, e-mail: [email protected] Неустроева Анна Николаевна, студент, кафедра микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета, e-mail: [email protected]
UDC 579.26:579.222 Pavlova Yu.A., Neustroeva A.N.
E-mail: [email protected], [email protected]
SYMBIOTIC SOIL BACTERIA TRANSFORMING NITRILES AND AMIDES OF CARBOXYLIC ACIDS
The content of bacteria transforming nitriles and amides in samples of podzolic soils in the natural environment of the Perm Territory has been investigated. It has been established that cultures isolated form symbiotic associations metabolizing nitriles as the substrate more actively. The most of microorganisms having nitrile hydratase or amidase activity are represented by actinobacteria of Rhodococcus genus (35% of isolates). It has been shown that some isolates of Rhodococcus have excessively high activity of nitrile hydratase and amidase, which is probably related to their role in the association.
Key words: biodiversity, amidase, nitrile, symbiosis.
Bibliography:
1. Kuznetsova M.V., Maksimov A.Yu., Ovechkina G.V., Demakov V.A. Distribution of nitrile converting bacteria in Perm soils II Bulletin of Perm. Univ. - 2007. - V.5 (10). - P.96-99.
2. Maximov A.Yu., Kuznetsov M.V., Ovechkina G.V., Demakov V.A. Effect of nitriles and amides on the growth and nitrile hydratase activity of the strain Rhodococcus sp. gt1 II Applied Biochemistry and Microbiology. - 2003. - T. 39. - № 1. - S. 63-68.
3. Pertsovich S.I., Guranda D.T., Podchernyaev D.A., Yanenko A.S., Svedas V.K. The aliphatic amidase from Rhodococcus rhodochrous-member of the family nitrilase I cyanide hydratase II Biochemistry. - 2005. - T.70. - S.1556-1565.
4. Banerjee A., Sharma R., Banerjee U.C. The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects II Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2002. - V. 60. - P. 33-44.
5. Cowan D., Cramp R., Pereira R. et al. Biochemistry and biotechnology of mesophilic and thermophilic nitrile metabolizing enzymes II Extremophiles. - 1998. - V. 2. - № 3. - P. 207-216.
