Частота встречаемости cry-подобных генов в штаммах Bacillus thuringiensis Крымской коллекции микроорганизмов Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ

Научная статья УДК 579.26:579.6 EDN: AQLWEO DOI: 10.21285/achb.941

Частота встречаемости cry-подобных генов в штаммах Bacillus thuringiensis Крымской коллекции микроорганизмов

А.В. Крыжко

Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма, Симферополь, Российская Федерация

Аннотация. Энтомопатогенные штаммы Bacillus thuringiensis используются для разработки биопрепаратов нового поколения против листогрызущих вредителей. Целью проведенного исследования было изучение частоты встречаемости cry-подобных генов в штаммах и выбор перспективного для создания на его основе энтомо-патогенного биопрепарата. Материалом для исследования послужили энтомопатогенные штаммы Bacillus thuringiensis, полученные из Крымской коллекции микроорганизмов Научно-исследовательского института сельского хозяйства Крыма. Энтомопатогенное действие перспективных штаммов изучали в ходе лабораторных опытов на личинках представителей отрядов Coleoptera, Lepidoptera. В качестве наиболее перспективных, содержащих не менее четырех генов токсинообразования, отобраны штаммы Bacillus thuringiensis 708 (cryl, thuE, cry7-8, cryll), 942 (cryl, thuE, cryll, vip), 949 (cryl, thuE, cry4, cry7-8), 989 (cryl, thuE, cryll, vip), 0162 (cryl, thuE, cryll, vip), 0307 (cryl, thuE, cry4, cry7-8), 0308 (cryl, thuE, cry4, cry7-8), 0363 (cryl, thuE, cry5, cryll) и 037l (cryl, thuE, cry9, cryll). Установлено, что выделенные штаммы Bacillus thuringiensis 0l62, 0307, 0363 и 037l оказывают высокое энтомопатогенное действие против личинок колорадского жука, ильмового листоеда (88,3-l00%), гусениц плодовой моли, капустной совки, златогузки и американской бабочки (92,3-l00%). Показано, что штамм Bacillus thuringiensis 037l проходит все классические фазы развития и в течение 45-48 ч демонстрирует полный выход кристаллов и спор из спорангия. Таким образом, штамм 037l перспективен для разработки регламента производства биопрепарата для защиты сельскохозяйственных растений.

Ключевые слова: Bacillus thuringiensis, cry-подобные гены, листогрызущие вредители, Coleoptera, Lepidoptera

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания № FNZW-2022-0006.

Для цитирования: Крыжко А.В. Частота встречаемости cry-подобных генов в штаммах Bacillus thuringiensis Крымской коллекции микроорганизмов // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2024. Т. 14. N 4. С. 567-577. DOI: 10.21285/achb.941. EDN: AQLWEO.

PHYSICOCHEMICAL BIOLOGY

Original article

Frequency of cry-like genes in Bacillus thuringiensis strains of the Crimean microorganism collection

Anastasiia V. Kryzhko

Research Institute of Agriculture of Crimea, Simferopol, Russian Federation

Abstract. The entomopathogenic strains of Bacillus thuringiensis are used in the development of new-generation biopreparations against leaf-eating insects. The present study was aimed at analyzing the frequency of cry-like genes in the strains and at identifying a promising strain for the development of an entomopathogenic biopreparation on its basis. The study materials included the entomopathogenic strains of Bacillus thuringiensis obtained from the Crimean microorganism collection of the Crimean Agricultural Research Institute. The entomopathogenic effect

© Крыжко А.В., 2024

of promising strains was studied in laboratory experiments on Coleoptera and Lepidoptera larvae. The following strains of Bacillus thuringiensis were identified as the most promising, i.e., containing at least four toxin genes: 708 (cryl, thuE, cry7-8, cryll), 942 (cryl, thuE, cryll, vip), 949 (cryl, thuE, cry4, cry7-8), 989 (cryl, thuE, cryll, vip), 0l62 (cryl, thuE, cryll, vip), 0307 (cryl, thuE, cry4, cry7-8), 0308 (cryl, thuE, cry4, cry7-8), 0363 (cryl, thuE, cry5, cryll) u 037l (cryl, thuE, cry9, cryll). The isolated strains of Bacillus thuringiensis 0l62, 0307, 0363, and 037l were found to have a high entomopathogenic effect on the larvae of the Colorado potato beetle and elm-leaf beetle (88.3-l00%), as well as the caterpillars of ermine moth, cabbage moth, brown-tail moth, and fall webworm (92.3-l00%). It is shown that Bacillus thuringiensis strain 037l goes through all traditional stages of development and exhibits complete release of crystals and spores from the sporangium within 45-48 h. Thus, strain 037l can be used to develop specifications for manufacturing a plant protection biopreparation.

Keywords: Bacillus thuringiensis, cry-like genes, leaf-eating insects, Coleoptera, Lepidoptera

Funding. The work was financially supported by the state assignment no. FNZW-2022-0006.

For citation: Kryzhko A.V. Frequency of cry-like genes in Bacillus thuringiensis strains of the Crimean microorganism collection. Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology. 2024;14(4):567-577. (In Russian). DOI: 10.21285/achb.941. EDN: AQLWEO.

ВВЕДЕНИЕ

Вопрос получения новых перспективных биопрепаратов, эффективных против листогрызущих вредителей, не теряет своей актуальности. На рынке современных биопрепаратов доминируют препараты на основе энто-мопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis. Промышленные препараты данного типа эффективны против более 400 видов насекомых из семейств Lepidoptera, Diptera, Hymenoptera, Coleoptera, Orthoptera [1, 2]. Основная часть биопрепаратов разрабатывается на основе B. thuringiensis var. thuringiensis (Битоксиба-циллин, Битоксин и др.) и применяется против комплекса листогрызущих насекомых на овощных, плодово-ягодных культурах, в садово-парковых насаждениях и в лесах [3].

Существуют несколько причин развития интереса к B. thuringiensis. Данная группа бактерий обладает специфическим действием на насекомых-вредителей, использование B. thuringiensis не вызывает стойкого загрязнения почвы, листьев и воздуха энтомопато-генными бактериями. Ко всему прочему, B. thuringiensis является естественным компонентом биоценозов, она безопасна для энтомофагов и не является патогенной для млекопитающих и человека [4]. Именно широким использованием B. thuringiensis в практике контроля вредителей, их селективным действием, безопасностью относительно компонентов агроценоза и здоровья человека обусловлена необходимость поиска и изучения новых штаммов [5]. Кроме того, штаммы с высокими энтомопатогенными и технологическими свойствами используются для разработки биопрепаратов нового поколения, а также в качестве аналогов уже существующих штаммов-продуцентов [6].

Действие B. thuringiensis на насекомых связано как с инфекционным процессом, так и с образованием токсических веществ. Некоторые из этих факторов вирулентности являются общими для представителей группы B. cereus, например цвиттермицин А, гемолизины, гемолитический комплекс и часть энтеротоксинов [7, 8]. Другие характерны исключительно для B. thuringiensis -это Cyt- и Cry-эндотоксины. B. thuringiensis представляет собой грамположительные спорообразующие бактерии, способные формировать при споруляции параспо-ральные кристаллические включения белковой природы, Cry- и Cyt-токсины, которые обусловливают главным образом их инсектицидную активность [9]. В период

вегетативного роста некоторые штаммы B. thuringiensis продуцируют инсектицидные белки (Vip- и Sip-токсины), которые секретируются в среду. Впервые Vip-токсины были обнаружены в середине 1990-х годов, на данный момент описано 176 Vip-токсинов, распределенных на 4 класса: Vip 1, Vip 2, Vip 3 и Vip 4 [10]. Обширные исследования in vitro и in vivo показали почти полное отсутствие перекрестной резистентности между Vip3A-и Сгу1-белками [11]. Наличие Vip3-токсинов открывает возможность использования биопестицидов на основе B. thuringiensis в отношении большего числа вредителей, а также препятствует развитию устойчивости насекомых к Cry-белкам [12, 13].

Основное значение в энтомоцидном действии бактерий традиционно уделяется кристаллическим белковым параспоральным Cyt- и Cry-включениям, формируемым клетками бактерий во время фазы стационарного роста.

На сегодняшний день Комитет по номенклатуре токсинов B. thuringiensis [14] классифицировал 73 различных типа инсектицидных белков (от Cry1 до Cry74) и доказал токсичность данных белков против Lepidoptera, Coleoptera, Hemiptera, Diptera, нематод (как паразитов человека и животных, так и свободноживущих Rhabditids) некоторых улиток (Gastropoda) [15-18] и/или раковых клеток человека различного происхождения [19]. Таким образом, вопросы идентификации генов В. thuringiensis, ответственных за энтомоцидную активность и дифференциацию бактерий B. thuringiensis на основе физиоло-го-биохимических свойств, представляют определенный научно-практический интерес. Идентификация cry-генов, кодирующих Cry-белки штаммов Крымской коллекции микроорганизмов Научно-исследовательского института сельского хозяйства Крыма могла бы способствовать не только определению одного из ключевых факторов вирулентности, но и попытке систематизировать перспективные для создания биопрепарата против листогрызущих насекомых штаммы коллекции по спектру действия эндотоксинов [20].

Целью проведенных исследований являлось изучение частоты встречаемости cry-подобных генов в штаммах энтомоцидной бактерии B. thuringiensis Крымской коллекции микроорганизмов, а также выбор перспективного биоагента для создания на его основе энтомопатогенного биопрепарата.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалом для исследования генов В. thuringiensis, ответственных за синтез инсектицидных кристаллических белков, послужили штаммы В. thuringiensis, зарегистрированные в Крымской коллекции микроорганизмов Научно-исследовательского института сельского хозяйства Крыма, зарегистрированной на сайте «Научно-технологическая инфраструктура Российской Федерации» под номером 5074841. В качестве позитивного контроля использовали полученные из лаборатории протеомики надорганизменных систем Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии штаммы В. thuringiensis var. thuringiensis 41 (Н1) и В. thuringiensis var. darmstadiensis 109 (Н10), содержащие гены thuE, cry1 и cry11, а в качестве позитивного контроля для генов cry2, cry5 и vip использовали штамм 358 коллекции Института систематики и экологии животных СО РАН, за что автор статьи выражает благодарность авторам штаммов. Наличие соответствующих генов в геноме контрольных штаммов устанавливали путем поиска соответствующих нуклеотидных последовательностей при помощи алгоритма BLAST [21].

Выделение тотальной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из вегетативной массы клеток бактерий B. thuringiensis провели согласно общепринятым методам [22]. Качество выделенной ДНК проверяли с помощью анализа методом полимеразной цепной реакции с использованием стандартных бактериальных праймеров ITS-16S - 1392-S-15 (5' - GNACA-

CACCGCCCGT - 3') и ITS-23S-206-A-21 (5' -NCTTAGAT-GTTTCAGTTCVCY - 3' [23]. Детекцию гена энтомоцидной активности cry1 в штаммах B. thuringiensis проводили при помощи пары праймеров cryl-543, упоминавшихся в работах А. Браво [24], нацеленных на одноименные гены, расположенные на плазмидной ДНК бактерии (табл. 1). Для детекции генов энтомоцидных белков классов Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry7-8, Cry9, Cryll, Vip, thuE пользовались праймерами Un2, Un3, Un4, Un5, Un7-8, Un9, Unll, Vip и BE [5, 25]. Объем реакционной смеси составил 25 мкл и включал: 5 мкл Screen Mix-HS («Евроген»), содержащей 3 mM MgCl2 и 0,12 mM dNTPs; а также 50 нг бактериальной ДНК, 0,2 мкл каждого праймера (5 pM/мкл). ПЦР проводили с использованием следующей программы: 1 мин начальная денатурация при 95 °C, затем 35 циклов - 30 с, денатурация при 94 °C, 30 с отжиг при целевой температуре отжига и 1 мин элонгация при 72 °C, и заключительная элонгация 1 мин при 72 °C. ПЦР продукты визуализировали с помощью электрофореза в 1,5%-м агарозном геле [26].

Энтомопатогенное действие перспективных штаммов изучали в лабораторных опытах на личинках колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata, Coleoptera) и ильмового листоеда (Xanthogaleruca luteola (Statius Müller), Coleoptera), гусеницах капустной совки (Mamesta brassicae, Lepidoptera), плодовой моли, златогузки и американской белой бабочки (Hyphantria cunea Dryri, Lepidoptera). Лабораторные опыты по изучению энтомоцидной активности штаммов B. thuringiensis проводили в литровых стаканах, куда помещали

Таблица 1. Характеристика праймеров, используемых в исследованиях по идентификации генов энтомоцидной активности в геноме штаммов Bacillus thuringiensis

Table 1. Characteristics of primers used in studies of insecticidal activity genes identification in the genome of Bacillus thuringiensis strains

Название праймера Нуклеотидная последовательность праймера (5'^3') Длина ампликона, bp Температура отжига, °C

Un1F CATGATTCATGCGGCAGATAA AC 200 57

Un1R TTGTGACACTTCTGCTTCCCATT

Un2F GTTATTCTTAATGCAGATGAATGGG 689-701 57

Un2R CGGATAAAATAATCTGGGAAATAGT

Un3F CGTTATCGCAGAGAGATGACATTAAC 589-604 54

Un3R G CGTGACATACCCATTTCCAG GTCC

Un4F GCATATGATGTAGCGAAACAAGCC 439 60

Un4R G CGTGACATACCCATTTCCAG GTCC

Un5F TTACGTAAATTGGTCAATCAAGCAAA 474-489 54

Un5R AAGACCAAATTCAATACCAGGGTT

Un7-8F AAGCAGTGAATGCCTTGTTTAC 420 48

Un7-8R CTTCTAAACCTTGACTACTT

Un9F CGGTGTTACTATTAGCGAGGGCGG 351-359 60

Un9R GTTTGAGCCGCTTCACAGCAATCC

Un11F TTCCAACCCAACTTTCAAGC 305 54

Un11R AGCTATGGCCTAAGGGGAAA

VipF CCTCTATGTTGAGTGATGTA 1000 50

VipR CTATACTCCGCTTCACTTGA

BEF AAAGGGTCTGGTAAAACA 406 54

BER ACCATCGACTTCCTTCTT

1 Крымская коллекция микроорганизмов // Научно-технологическая инфраструктура Российской Федерации. Режим доступа: http://ckp-rf.ru/usu/507484/ (дата обращения: 16.04.2024).

личинок или гусениц 1-2 возраста и листья кормового растения, обработанные жидкой культурой штаммов при титре спор 200 млн/мл. Обработанным кормом личинки питались 3 суток, после чего его меняли на необработанный. Жидкие споровые культуры получали при культивировании бактерий на технологических качалках в дрожже-полисахаридной среде, в состав которой входили следующие компоненты, %: дрожжи кормовые - 3,0, мука кукурузная - 1,5. Культивирование осуществляли в колбах объемом 750 мл с 35 мл питательной среды. Опыты проводили в 3 повторностях по 25 личинок в каждой. В качестве эталона использовали жидкую споровую культуру штамма B. thuringiensis var. thuringiensis 98 (продуцент Битоксибациллина) и штамма Б. thuringiensis var. kurstaki 0293 (продуцент Лепидоцида).

Статистическую обработку полученных результатов провели с применением современных методов статистических исследований с применением Microsoft Excel и ППП Statistica 7 [27], Jyputer Notebook и языка программирования Python, прикладных библиотек numpy, matplotlib [28, 29].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Гены токсинообразования определяли в 61 штамме В. thuringiensis коллекции энтомопатогенов отдела сельскохозяйственной микробиологии ФГБУН «НИИСХ Крыма».

Детекцию генов энтомоцидной активности группы cry, thuE и vip в штаммах B. thuringiensis проводили с помощью классической ПЦР (табл. 2, рис. 1-5). В результате исследований с применением праймеров Uni было установлено наличие генов класса cryl в геноме штаммов

М50+ 708 942 949 989 0162 0307 0308 0363 0371 0411 98 202 810 К- 41 109 М50+

Рис. 1. Гель-электрофорез продуктов полимеразной цепной реакции, полученных в результате амплификации дезоксирибонуклеиновой кислоты штаммов Bacillus thuringiensis с праймерами Un1 (М - маркер длин дезоксирибонуклеиновых кислот (50+ bp DNA Ladder, «Евроген»); в верхней строчке указаны номера исследуемых штаммов и названия праймеров)

Fig. 1. Gel electrophoresis of polymerase chain reaction products obtained as a result of deoxyribonucleic acid amplification of Bacillus thuringiensis strains with Un1 primers (M - 50+ bp DNA Ladder, "Eurogen"; the top line shows the numbers of the studied strains and the names of the primers)

70S 358 942 949 917 989 0391 0655 05960162 03OB К- I M 917 358 41 03910363 037]

0293 0491 0595 „„„ I 50+ HI

Рис. 2. Гель-электрофорез продуктов полимеразной цепной реакции, полученных в результате амплификации дезоксирибонуклеиновой кислоты штаммов Bacillus thuringiensis с праймерами BE (М - маркер длин дезоксирибонуклеиновых кислот (50+ bp DNA Ladder, «Евроген»); в верхней строчке указаны номера исследуемых штаммов и названия праймеров)

Fig. 2. Gel electrophoresis of polymerase chain reaction products obtained as a result of deoxyribonucleic acid amplification of Bacillus thuringiensis strains with BE primers (M - 50+ bp DNA Ladder, "Eurogen"; the top line shows the numbers of the studied strains and the names of the primers)

Таблица 2. Наличие энтомоцидных и cry-подобных генов в штаммах Bacillus thuringiensis Table 2. Presence of entomocidal and cry-like genes in strains of Bacillus thuringiensis

Штамм Гены энтомоц идных белков Bacillus thuringiensis ß-экзотоксин Серотип

cryl thuE cry2 cry4 cry5 cry7-8 cry9 cry11 vip

98 0 1 0 0 0 0 0 0 0 + thuringiensis

202 0 1 0 0 0 0 0 1 0 + thuringiensis

685 0 1 0 0 0 0 0 1 0 + thuringiensis

708 1 1 0 0 0 1 0 1 0 + thuringiensis

787 1 1 0 0 0 0 0 1 0 - н/о

792 1 1 0 0 0 1 0 0 0 + thuringiensis

800 1 1 0 0 0 1 0 0 0 + thuringiensis

810 0 1 0 0 0 0 0 0 0 + thuringiensis

815 0 1 0 0 0 1 0 0 0 + thuringiensis

820 1 1 0 0 0 1 0 0 0 + darmstadiensis

836 0 1 0 0 0 0 0 0 0 - dendrolimus

854 1 1 0 0 0 1 0 0 0 + thuringiensis

888 1 1 0 0 0 1 0 0 0 + thuringiensis

902 0 1 0 0 0 0 0 1 0 + thuringiensis

917 0 0 0 1 0 0 0 0 0 - kurstaki

926 1 1 0 1 0 1 0 0 0 - kurstaki

942 1 1 0 0 0 0 0 1 1 - dendrolimus

949 1 1 0 1 0 1 0 0 0 - н/о

989 1 1 0 0 0 0 0 1 1 + thuringiensis

994 1 1 0 0 0 0 0 0 0 + thuringiensis

10/Н 0 1 0 1 0 0 0 1 0 - dendrolimus

39/Н 0 1 0 1 0 0 0 0 0 + thuringiensis

42/Н 0 1 0 1 0 0 0 0 0 + thuringiensis

O14 0 1 0 0 0 0 0 0 0 - н/о

O48 0 1 0 1 0 0 0 0 0 - н/о

O72 1 1 0 1 0 0 0 0 0 + thuringiensis

0105 1 1 0 1 0 0 0 0 0 + thuringiensis

0120 0 1 0 1 0 0 0 0 0 + thuringiensis

0161 0 1 0 0 0 0 0 0 0 + thuringiensis

0162 1 1 0 0 0 0 0 1 1 + thuringiensis

0164 1 1 0 1 0 0 0 0 0 + thuringiensis

0177 0 1 0 1 0 0 0 0 0 + thuringiensis

0198 0 1 0 0 0 0 0 0 0 + thuringiensis

0271 1 1 0 0 0 0 0 0 0 + darmstadiensis

0279 1 1 0 0 0 0 0 1 0 + darmstadiensis

0293 1 0 0 1 0 0 0 0 0 + kurstaki

0304 0 1 0 1 0 1 0 0 0 + thuringiensis

0307 1 1 0 1 0 1 0 0 0 + thuringiensis

0308 1 1 0 1 0 1 0 0 0 + kurstaki

0326 1 1 0 1 0 0 0 0 0 + thuringiensis

0332 1 1 0 0 0 0 0 1 0 + thuringiensis

0337 1 1 0 0 0 0 0 1 0 + thuringiensis

0352 0 1 0 0 0 0 0 1 0 + thuringiensis

0361 1 1 0 0 0 0 0 1 0 + thuringiensis

0363 1 1 0 0 1 0 0 1 0 + thuringiensis

0371 1 1 0 0 0 0 1 1 0 + thuringiensis

0374 1 1 0 0 0 1 0 0 0 + thuringiensis

0376 1 1 0 0 0 0 0 1 0 + thuringiensis

0379 1 1 0 0 0 0 0 1 0 + kurstaki

0399 1 1 0 0 0 0 0 1 0 + н/о

0391 0 0 0 0 0 0 0 1 0 + kurstaki

0409 1 1 0 0 0 0 0 1 0 + н/о

0411 1 1 0 0 0 0 0 0 0 + thuringiensis

ЛП 1 1 0 0 1 0 0 0 0 + thuringiensis

109-С 1 1 0 0 0 0 0 1 0 + morrizoni

Z-52 1 1 0 1 0 0 0 1 0 + kurstaki

358 1 0 1 0 1 0 0 1 1 - kurstaki

4301 1 1 0 0 0 0 0 1 0 + thuringiensis

202-16 0 1 0 0 0 0 0 0 0 + thuringiensis

41H1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 + thuringiensis

109H10 1 1 0 0 0 0 0 1 0 + darmstadiensis

Примечание. Н/о - не обнаружен.

M 0371 0308 0363 0162 989 942 Я M50+ 385 917 926 942 949 989 994 0307 0308 +50 I

Рис. 3. Гель-электрофорез продуктов полимеразной цепной реакции, полученных в результате амплификации дезоксирибонуклеиновой кислоты штаммов Bacillus thuringiensis: а - с праймерами Un11; b - с праймерами Un4 (М - маркер длин дезоксирибонуклеиновых кислот (50+ bp DNA Ladder, «Евроген»); в верхней строчке указаны номера исследуемых штаммов и названия праймеров)

Fig. 3. Gel electrophoresis of polymerase chain reaction products obtained as a result of deoxyribonucleic acid amplification of Bacillus thuringiensis strains with: а - Un11 primers; b - Un4 primers (M - 50+ bp DNA Ladder, "Eurogen"; the top line shows the numbers of the studied strains and the names of the primers)

В. типп^епэ^ 708, 787, 792, 800, 820, 854, 888, 926, 942, 949, 989, 994, 072, 0105, 0162, 0164, 0271, 0279, 0293, 0307, 0308, 0326, 0332, 0337, 0361, 0363, 0371, 0374, 0376, 0379, 0399, 0409, 0411, ЛП, 109-С, Z-52, 358, 4301, 41Н1,109Н10. При помощи пары праймеров ПиЕ было установлено наличие гена №и субъеденицы Е в геноме штаммов В. thuringiensis 98, 202, 685,708, 787, 792, 800, 810, 815, 820, 836, 854, 888, 902, 926, 942, 949, 989, 994, 10/Н, 39/Н, 42/Н, 014, 048, 072, 0105, 0120, 0161, 0162, 0164, 0177, 0198, 0271, 0279, 0293, 0304, 0307, 0308, 0326, 0332, 0337, 0352, 0361, 0363, 0371, 0374, 0376, 0379, 0399, 0409, 0411, ЛП, 109-С, Z-52, 4301, 202-16, 41Н1, 109Н10.

Анализ коллекционных штаммов позволил установить, что ген класса сгу2 был детектирован только

в геноме штамма В. thunngiensis 358. Генов класса сгуЗ в исследованных штаммах не обнаружено. Установлено наличие генов класса сгу4 в геномах штаммов В. ^^т^п^ 917, 926, 949, 10/Н, 39/Н, 42/Н, 048, 072, 0105, 0120, 0164, 0177, 0293, 0304, 0307, 0308, 0326, Z-52. Гены, кодирующие энтомоцидный кристаллический белок, принадлежащий к классу сгу5, обнаружили в геномах штаммов В. thuringiensis 0363, ЛП, 358. Гены класса сгу7-8 детектированы в геномах штаммов В. ^^т^п^ 708, 792, 800, 815, 820, 854, 888, 926, 949, 0304, 0307, 0308, 0326, 0374. Установлено наличие гена класса сгу9 в геноме штамма В. thuringiensis 0371. Наиболее распространенными в штаммах В. thuringiensis Крымской коллекции оказались гены класса сгу11. Они были отмечены в геномах

385 98 202 685 708 787 949 0307 810 815 820 836 0308 926 902 М

Рис. 4. Гель-электрофорез продуктов полимеразной цепной реакции, полученных в результате амплификации дезоксирибонуклеиновой кислоты штаммов Bacillus thuringiensis с праймерами Un7-8 (М - маркер длин дезоксирибонуклеиновых кислот (50+ bp DNA Ladder, «Евроген»); в верхней строчке указаны номера исследуемых штаммов и названия праймеров, стрелочками показаны целевые фрагменты)

Fig. 4. Gel electrophoresis of polymerase chain reaction products obtained as a result of deoxyribonucleic acid amplification of Bacillus thuringiensis strains with Un7-8 primers (M - 50+ bp DNA Ladder, "Eurogen"; the top line shows the numbers of the studied strains and the names of the primers, target fragments are shown with arrows)

Рис. 5. Гель-электрофорез продуктов полимеразной цепной реакции, полученных в результате амплификации дезоксирибонуклеиновой кислоты штаммов Bacillus thuringiensis: а - с праймерами Un9; b - с праймерами Vip (М - маркер длин дезоксирибонуклеиновых кислот (50+ bp DNA Ladder, «Евроген»); в верхней строчке указаны номера исследуемых штаммов и названия праймеров)

Fig. 5. Gel electrophoresis of polymerase chain reaction products obtained as a result of deoxyribonucleic acid amplification of Bacillus thuringiensis strains with: а - Un9 primers; b - Vip primers (M - 50+ bp DNA Ladder, "Eurogen"; the top line shows the numbers of the studied strains and the names of the primers)

штаммов В. thuringiensis 202, 685, 708, 787, 902, 942, 989, 10/Н, O162, O332, O337, O352, O361, O363, O371, O376, O379, O399, O391, 0409, 109-С, Z-52, 358, 4301, 41H1, 109H10. Показано наличие генов класса Vip в геномах штаммов В. thuringiensis 942, 989, 0162, 358.

Анализ частоты встречаемости генов токсиноо-бразования позволил установить, что большая часть коллекции (95,1%) имеет в геноме ген экзотоксина, что свидетельствует о высокой активности коллекции энтомопатогенных штаммов против вредителей из отрядов Hemiptera и Lepidoptera (табл. 3). Следует заметить, что ген thuE детектирован у штаммов 836, 942, 10/Н, 0308, 0379, 0391, Z-52, относящихся к серотипам kurstaki и dendrolimus, для которых биохимическими методами установлено отсутствие экзотоксина. Вероятно, это связано с тем, что, несмотря на наличие аппарата синтеза, искомый токсин не синтезируется в значительных количествах. Основная часть коллекции содержит в геноме ген cryl (63,9%), активный против вредителей из отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Gastropoda. 44,2% штаммов, имеющих ген cryll, потенциально активны против вредителей из отрядов Diptera и Hemiptera. 29,5% штаммов В. thuringiensis, имеющих в геноме ген cry4, потенциально активны против Diptera. Также 21,3% штаммов имеют в геноме cry7-8 и могут быть активны против Lepidoptera и Coleoptera.

Установлено, что в коллекции В. thuringiensis присутствуют штаммы, потенциально активные против Hymenoptera, Rhabditida и имеющие ген cry5 (4,91%). 6,55% штаммов имеют в геноме гены группы vip. Гены cry2 и cry9 представлены в коллекции не более чем в 1,6% штаммов. Гены cytl и cyt2 при помощи изученных праймеров не обнаружены.

Основным результатом данных поисковых исследований стал отбор перспективных штаммов B.thuring-

iensis коллекции, содержащих не менее четырех генов токсинообразования. Ими оказались штаммы 708 (cryl, thuE, cry7-8, cryll), 942 (cryl, thuE, cryll, vip), 949 (cryl, thuE, cry4, cry7-8), 989 (cryl, thuE, cryll, vip), 0162 (cryl, thuE, cryll, vip), 0307 (cryl, thuE, cry4, cry7-8), 0308 (cryl, thuE, cry4, cry7-8), 0363 (cryl, thuE, cry5, cryll) и 0371 (cryl, thuE, cry9, cryll).

Таблица 3. Частота встречаемости cry-подобных генов в штаммах Bacillus thuringiensis

Table 3. Frequency of cry-like genes occurrence in Bacillus thuringiensis strains

Ген Частота, % Отряды целевых вредителей

cryl 63,9 Lepidoptera, Coleoptera, Diptera,

Gastropoda

thuE 95,1 Hemiptera, Lepidoptera

cry2 1,63 Coleoptera, Hymenoptera,

Hemiptera

cry4 29,5 Diptera

cry5 4,91 Hymenoptera, Rhabditida

cry7-8 21,3 Lepidoptera, Coleoptera

cry9 1,6 Lepidoptera, Coleoptera

cryll 44,2 Diptera, Hemiptera

cytl 0 Coleoptera, Diptera

cyt2 0 Coleoptera, Diptera

vip 6,55 Lepidoptera

В результате исследований энтомоцидной активности перспективных штаммов относительно спектра вредителей было установлено, что наиболее эффективными против колорадского жука и ильмового листоеда являются штаммы В. ^т^п^ 708, 989, 0162, 0363 и 0371 (табл. 4). Энтомоцидная активность данных штаммов относительно колорадского жука на 10-е сутки после

Таблица 4. Энтомоцидная активность штаммов Bacillus thuringiensis против распространенных листогрызущих вредителей овощных и декоративних насаджений Крыма

Table 4. Entomocidal activity of Bacillus thuringiensis strains against common leaf-eating pests of vegetable and ornamental plantings in the Crimea

Гибель на 10-е сутки опыта, %

Штамм личинки колорадского жука (L1-2) личинки ильмового листоеда (L1) гусеницы плодовой моли (L12) гусеницы капустной совки L-2) гусеницы златогузки L-2) гусеницы американской белой бабочки (L12)

Контроль (вода) 6,7±0,1 11,6±1,6 0 2,7±0,1 0 5,3±0,3

98 (эталон) 92,3±0,1 81,6±1,6 100 93,3±0,1 100 100

0293 (эталон) 50,1±0,1 40,0±6,1 100 89,8±0,3 87,3±0,3 100

708 100 91,7±6,2 100 100 73,2±6,9 100

942 27,0±1,0 21,0±0,4 100 84,6±0,6 80,0±2,8 95,6±0,7

949 37,0±1,0 38,3±0,7 100 98,4±2,5 90,3±0,3 100

989 100 88,4±3,5 100 98,7±0,7 75,3±3,7 100

0162 100 98,2±6,6 100 100 100 100

0307 89,3±0,7 95,6±4,2 100 100 100 100

0308 22,0±0,3 18,3±0,2 100 81,7±1,4 97,1±3,4 100

0363 100 88,3±1,3 100 100 100 100

0371 100 94,2±0,4 100 92,3±0,7 98,7±0,3 100

обработки листьев составила в среднем 100%, а относительно ильмового листоеда - 92,5%. Самой высокой активностью против ильмового листоеда обладал штамм B. thuringiensis 0162 (98,2%). Все перспективные штаммы оказались высокоактивными против плодовой моли и американской белой бабочки. Штаммы B. thuringiensis 708, 0162 и 0307 оказались высокоактивными против гусениц капустной совки, вызывая их 100%-ю гибель на 7-е сутки эксперимента. Обработка корма штаммами B. thuringiensis 949, 989 и 0371 способствовала гибели в среднем 96,3% гусениц, а штаммами 942 и 0308 -в среднем 82,5% на 10-е сутки опыта. Максимальным энтомоцидным эффектом на гусениц златогузки обладали штаммы B. thuringiensis 0162 и 0307 (100%-я гибель на 10-е сутки опыта), высокую активность проявляют штаммы B. thuringiensis 0308 и 0371, вызывающие в среднем 97,5%-ю гибель вредителя в тот же срок. На основе анализа полученных результатов из всех исследуемых патогенов в качестве наиболее эффективных против вредителей отрядов Coleoptera и Lepidoptera были отобраны четыре штамма B. thuringiensis: 0162, 0307, 0363 и 0371.

Савокупность продетектированных генов энтомоцидной активности в жидкой культуре (су1, ^иЕ, ^у9, ^у11) и высокая энтомцидная активность показали перспективность дальнейшего изучения технологических параметров культивирования штамма В. thuringiensis 0371.

Энтомопатоген культивировали в дрожже-полиса-харидной среде при температуре 28-30 °С на технологической качалке (220 об/мин) в течение 48 ч. Установлено, что для бактерий в стадии вегетативных клеток характерна кинетика роста и развития, которая состоит из 4 классических фаз: 1^-фазы, фазы ускорения роста, экспоненциальной и стационарной фаз. 1^-фаза развития бактерий проходит в течение 0,5-1,5 ч, а последующие фазы развития вегетативных клеток - до 10-12 ч (табл. 5). Титр колониеобразующих единиц за этот период достигает 0,5-0,8 млрд клеток в 1 мл жидкости.

Через 14-16 ч культивирования в вегетативных клетках отмечали начало активного формирования белковых кристаллов и спорогенных зон. Период массовой спо-руляции проходил через 20-24 ч. Весь период культивирования составлял 45-48 ч и заканчивался полным высвобождением спор из спорангиев. Конечный титр свободных спор достигает 2,0-2,7 млрд в 1 мл.

Таблица 5. Технологические показатели развития штамма Bacillus thuringiensis 0371 при культивировании в дрожже-полисахаридной среде

Table 5. Technological indicators of the strain Bacillus thuringiensis 0371 development when cultivated in a yeast-polysaccharide medium

Этап развития бактерий Период наблюдений, ч

Этап 1. Начало образования спорогенных зон 14-16

Этап 2. Массовая споруляция 20-24

Этап 3. 10% свободных спор 28-30

Этап 4. Полный выход спор и кристаллов 45-48

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проведенного исследования установлено, что 95,1% штаммов коллекции имеют в геноме ген ^-экзотоксина и 63,9% - ген су1, что свидетельствует об их высокой активности против вредителей из отрядов Нет^ега и Lepidoptera. Описано наличие генов, потенциально активных против вредителей из отрядов Diptera и Нет^ега: ^у11 у 44,2% и ^у4 у 29,5% штаммов коллекции. Показано, что в коллекции В. thuringiensis присутствуют штаммы, потенциально активные против представителей отрядов Hymenoptera, Rhabditida и имеющие ген ^у5 (4,91%).

В качестве наиболее перспективных для создания на их основе биопрепаратов, содержащих не менее четырех генов токсинообразования, отобраны штаммы В. thuringiensis 708 (cryl, thuE, cry7-8, cryll), 942 (cryl, thuE, cryll, vip), 949 (cryl, thuE, cry4, cry7-8), 989 (cryl, thuE, cryll, vip), 0162 (cryl, thuE, cryll, vip), 0307 (cryl, thuE, cry4, cry7-8), 0308 (cryl, thuE, cry4, cry7-8), 0363 (cryl, thuE, cry5, cryll) и 0371 (cryl, thuE, cry9, cryll).

Установлено, что выделенные штаммы B. thuringiensis 0162, 0307, 0363 и 0371 оказывают высокое энтомопатогенное действие против личинок колорадского жука, ильмового листоеда (88,3-100%), гусениц

плодовой моли, капустной совки, златогузки и американской бабочки (92,3-100%).

Показано, что штамм В. thuringiensis 0371 является технологичным, так как проходит все классические фазы развития и в течение 45-48 ч демонстрирует полный выход кристаллов и спор из спорангия.

Таким образом, наличие генов энтомоцидной активности в жидкой культуре (сгу1, ^иЕ, сгу9, сгу11) и высокое энтомопатогенное действие характеризуют штамм В. thuringiensis 0371 как перспективный для разработки регламента производства биопрепарата для защиты сельскохозяйственных растений.

СПИСОК И

1. Arthurs S., Dara S.K. Microbial biopesticides for invertebrate pests and their markets in the United States // Journal of Invertebrate Pathology. 2019. Vol. 165. P. 13-21. DOI: 10.1016/j.jip.2018.01.008.

2. Jouzani G.S., Valijanian E., Sharafi R. Bacillus thuringiensis: a successful insecticide with new environmental features and tidings // Applied Microbiology and Biotechnology. 2017. Vol. 101. P. 2691-2711. DOI: 10.1007/ s00253-017-8175-y.

3. Duarte Neto J.M.W., Wanderley M.C.A., da Silva T.A.F., Marques D.A.V., da Silva G.R., Gurgel J.F., et al. Bacillus thuringiensis endotoxin production: a systematic review of the past 10 years // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2020. Vol. 36. P. 128. DOI: 10.1007/ s11274-020-02904-4.

4. Jo H., Tagele S.B., Pham H.Q., Kim M.-C., Choi S.-D., Kim M.-J., et al. Response of soil bacterial community and pepper plant growth to application of Bacillus thuringiensis KNU-07 // Agronomy. 2020. Vol. 10, no. 4. P. 551. DOI: 10.3390/agronomy10040551.

5. Perez M.P., Sauka D.H., Onco M.I., Berretta M.F., Benintende G.B. Selection of Bacillus thuringiensis strains toxic to cotton boll weevil (Anthonomus grandis, Coleoptera: Curculionidae) larvae // Revista Argentina de Microbiología. 2017. Vol. 49, no. 3. P. 264-272. DOI: 10.1016/j. ram.2016.12.010.

6. Soleymani S., Sarrafzadeh M.-H., Mostoufi N. Modeling of fermentation process of Bacillus thuringiensis as a sporulating bacterium // Chemical Product and Process Modeling. 2019. Vol. 14, no. 2. P. 2018000. DOI: 10.1515/ cppm-2018-0007.

7. Guttmann D.M., Ellar D.J. Phenotypic and genotypic comparisons of 23 strains from the Bacillus cereus complex for a selection of known and putative B. thuringiensis virulence factors // FEMS Microbiology Letters. 2000. Vol. 188, no. 1. P. 7-13. DOI: 10.1111/j.1574-6968.2000.tb09160.x.

8. Hansen B.M., Hendriksen N.B. Detection of entero-toxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains by PCR analysis // Applied and Environmental Microbiology. 2001. Vol. 67, no. 1. P.185-189. DOI: 10.1128/ AEM.67.1.185-189.2001.

9. Palma L., Muñoz D., Berry C., Murillo J., Caballero P. Bacillus thuringiensis toxins: an overview of their biocidal activity // Toxins (Basel). 2014. Vol. 6, no. 12. P. 3296-3325. DOI: 10.3390/toxins6123296.

10. Fang Y., Li Z., Liu J., Shu C., Wang X., Zhang X., et al. A pangenomic study of Bacillus thuringiensis // Journal of Genetics and Genomics. 2011. Vol. 38, no. 12. P. 567-576. DOI: 10.1016/j.jgg.2011.11.001.

11. Lee M.K., Walters F.S., Hart H., Palekar N., Chen J.-S. The mode of action of the Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A differs from that of CrylAb delta-endotoxin // Applied and Environmental Microbiology. 2003. Vol. 69, no. 8. P. 4648-4657. DOI: 10.1128/ AEM .69.8.4648-4657.2003.

12. Sena J.A., Hernández-Rodríguez C.S., Ferré J. Interaction of Bacillus thuringiensis Cryl and Vip3A proteins with Spodoptera frugiperda midgut binding sites // Applied and Environmental Microbiology. 2009. Vol. 75, no. 7. P. 2236-2237. DOI: 10.1128/AEM.02342-08.

13. Bravo A., Likitvivatanavong S., Gill S.S., Soberón M. Bacillus thuringiensis: a story of a successful bioinsecticide // Insect Biochemistry and Molecular Biology. 2011. Vol. 41, no. 7. P. 423-431. DOI: 10.1016/j.ibmb.2011.02.006.

14. Crickmore N., Zeigler D.R., Schnepf E., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., et al. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. Vol. 62, no. 3. P. 807-813. DOI: 10.1128/MMBR.62.3.807-813.1998.

15. Van Frankenhuyzen K. Cross-order and cross-phylum activity of Bacillus thuringiensis pesticidal proteins // Journal of Invertebrate Pathology. 2013. Vol. 114, no. 1. P. 76-85. DOI: 10.1016/j.jip.2013.05.010.

16. Ben-Dov E. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis and its dipteran-specific toxins // Toxins (Basel). 2014. Vol. 6, no. 4. P. 1222-1243. DOI: 10.3390/toxins6041222.

17. De Maagd R.A., Bravo A., Berry C., Crickmore N., Schnepf H.E. Structure, diversity, and evolution of protein toxins from spore-forming entomopathogenic bacteria // Annual Review of Genetics. 2003. Vol. 37. P. 409-433. DOI: 10.1146/annurev.genet.37.110801.143042.

18. Chougule N.P., Bonning B.C. Toxins for transgenic resistance to hemipteran pests // Toxins (Basel). 2012. Vol. 4, no. 6. P. 405-429. DOI: 10.3390/toxins4060405.

19. Ohba M., Mizuki E., Uemori A. Parasporin, a new anticancer protein group from Bacillus thuringiensis // Anticancer Research. 2009. Vol. 29, no. 1. P. 427- 433.

20. Zheng J., Gao Q., Liu L, Liu H., Wang Y., Peng D., et al. Comparative genomics of Bacillus thuringiensis reveals a path to specialized exploitation of multiple invertebrate hosts // mBio. 2017. Vol. 8, no. 4. P. e00822-17. DOI: 10.1128/mBio.00822-17.

21. Ye J., Coulouris G., Zaretskaya I., Cutcutache I., Rozen S., Madden T.L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction // BMC Bioinfomatics. 2012. Vol. 13. P. 134. DOI: 10.1186/1471-2105-13-134.

22. Franco-Rivera A., Benintende G., Cozzi J., Baiz-abal-Aguirre V.M., Valdez-Alarcón J.J., López-Meza J.E.

Molecular characterization of Bacillus thuringiensis strains from Argentina // Antonie Van Leeuwenhoek. 2004. Vol. 86, no. 1. P. 87-92. DOI: 10.1023/B:ANT0.0000024913. 94410.05.

23. Willumsen P.A., Johansen J.E., Karlson U. Isolation and taxonomic affiliation of N-heterocyclicaromatic hydrocarbon-transforming bacteria // Applied Microbiology and Biotechnology. 2005. Vol. 67, no. 3. P. 420-428. DOI: 10.1007/s00253-004-1799-8.

24. Bravo A., Sarabia S., Lopez L., Ontiveros H., Abarca C., Ortiz A., et al. Characterization of cry genes in a Mexican Bacillus thuringiensis strain collection // Applied and Environmental Microbiology. 1998. Vol. 64, no. 12. P. 4965-4972. DOI: 10.1128/AEM.64.12.4965-4972.1998.

25. Jain D., Sunda S.D., Sanadhya S., Nath D.J., Khandelwal S.K. Molecular characterization and PCR-based screening of cry genes from Bacillus thuringiensis strains // 3 Biotech. 2017. Vol. 7, no. 1. P. 4. D0I: 10.1007/ s13205-016-0583-7.

26. PCR primer design / ed. A. Yuryev. Totowa: Humana Press, 2007. 431 p.

27. Хайлафян А.А. Современные статистические методы медицинских исследований: монография. М.: Ленанд, 2014. 320 с.

28. Natingga D. Data science algorithms in a week. Birmingham - Mumbai: Packt Publishing, 2018. 214 p.

29. Galea A. Applied data science with Python and Jupyter. Birmingham - Mumbai: Packt Publishing, 2018. 174 p.

1. Arthurs S., Dara S.K. Microbial biopesticides for invertebrate pests and their markets in the United States. Journal of Invertebrate Pathology. 2019;165:13-21. DOI: 10.1016/j.jip.2018.01.008.

2. Jouzani G.S., Valijanian E., Sharafi R. Bacillus thuringiensis: a successful insecticide with new environmental features and tidings. Applied Microbiology and Biotechnology 2017;101:2691-2711. DOI: 10.1007/ s00253-017-8175-y.

3. Duarte Neto J.M.W., Wanderley M.C.A., da Silva T.A.F., Marques D.A.V., da Silva G.R., Gurgel J.F., et al. Bacillus thuringiensis endotoxin production: a systematic review of the past 10 years. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2020;36:128. DOI: 10.1007/ s11274-020-02904-4.

4. Jo H., Tagele S.B., Pham H.Q., Kim M.-C., Choi S.-D., Kim M.-J., et al. Response of soil bacterial community and pepper plant growth to application of Bacillus thuringiensis KNU-07. Agronomy. 2020;10(4):551. DOI: 10.3390/ agronomy10040551.

5. Perez M.P., Sauka D.H., Onco M.I., Berretta M.F., Benintende G.B. Selection of Bacillus thuringiensis strains toxic to cotton boll weevil (Anthonomus grandis, Coleoptera: Curculionidae) larvae. Revista Argentina de Microbiología. 2017;49(3):264-272. DOI: 10.1016/j.ram.2016.12.010.

6. Soleymani S., Sarrafzadeh M.-H., Mostoufi N. Modeling of fermentation process of Bacillus thuringiensis as a sporulating bacterium. Chemical Product and Process Modeling. 2019;14(2):2018000. DOI: 10.1515/ cppm-2018-0007.

7. Guttmann D.M., Ellar D.J. Phenotypic and genotypic comparisons of 23 strains from the Bacillus cereus complex for a selection of known and putative B. thuringiensis virulence factors. FEMS Microbiology Letters. 2000;188(1):7-13. DOI: 10.1111/j.1574-6968.2000.tb09160.x.

8. Hansen B.M., Hendriksen N.B. Detection of enterotoxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains by PCR analysis. Applied and Environmental Microbiology. 2001. Vol. 67, no. 1. P.185-189. DOI: 10.1128/ AEM.67.1.185-189.2001.

9. Palma L., Muñoz D., Berry C., Murillo J., Caballero P. Bacillus thuringiensis toxins: an overview of their biocidal activity. Toxins (Basel). 2014;6(12):3296-3325. DOI: 10.3390/toxins6123296.

10. Fang Y., Li Z., Liu J., Shu C., Wang X., Zhang X., et al. A pangenomic study of Bacillus thuringiensis.

Journal of Genetics and Genomics. 2011;38(12):567-576. DOI: 10.1016/j.jgg.2011.11.001.

11. Lee M.K., Walters F.S., Hart H., Palekar N., Chen J.-S. The mode of action of the Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A differs from that of Cry1Ab delta-endotoxin. Applied and Environmental Microbiology 2003;69(8):4648-4657. DOI: 10.1128/ AEM.69.8.4648-4657.2003.

12. Sena J.A., Hernández-Rodríguez C.S., Ferré J. Interaction of Bacillus thuringiensis Cry1 and Vip3A proteins with Spodoptera frugiperda midgut binding sites. Applied and Environmental Microbiology. 2009;75(7):2236-2237. DOI: 10.1128/AEM .02342-08.

13. Bravo A., Likitvivatanavong S., Gill S.S., Soberón M. Bacillus thuringiensis: a story of a successful bioinsecticide. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 2011;41(7):423-431. DOI: 10.1016/j.ibmb.2011.02.006.

14. Crickmore N., Zeigler D.R., Schnepf E., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., et al. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998;62(3):807-813. DOI: 10.1128/MMBR.62.3.807-813.1998.

15. Van Frankenhuyzen K. Cross-order and cross-phylum activity of Bacillus thuringiensis pesticidal proteins. Journal of Invertebrate Pathology. 2013;114(1):76-85. DOI: 10.1016/j.jip.2013.05.010.

16. Ben-Dov E. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis and its dipteran-specific toxins. Toxins (Basel). 2014;6(4): 1222-1243. DOI: 10.3390/toxins6041222.

17. De Maagd R.A., Bravo A., Berry C., Crickmore N., Schnepf H.E. Structure, diversity, and evolution of protein toxins from spore-forming entomopathogenic bacteria. Annual Review of Genetics. 2003;37:409-433. DOI: 10.1146/annurev.genet.37.110801.143042.

18. Chougule N.P., Bonning B.C. Toxins for transgenic resistance to hemipteran pests. Toxins (Basel). 2012;4(6):405-429. DOI: 10.3390/toxins4060405.

19. Ohba M., Mizuki E., Uemori A. Parasporin, a new anticancer protein group from Bacillus thuringiensis. Anticancer Research. 2009;29(1):427- 433.

20. Zheng J., Gao Q., Liu L, Liu H., Wang Y., Peng D., et al. Comparative genomics of Bacillus thuringiensis reveals a path to specialized exploitation of multiple invertebrate hosts. mBio. 2017;8(4):e00822-17. DOI: 10.1128/mBio.00822-17.

21. Ye J., Coulouris G., Zaretskaya I., Cutcutache I., Rozen S., Madden T.L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific

primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinfomatics. 2012;13:134. DOI: 10.1186/1471-2105-13-134.

22. Franco-Rivera A., Benintende G., Cozzi J., Baizabal-Aguirre V.M., Valdez-Alarcon J.J., Lopez-Meza J.E. Molecular characterization of Bacillus thuringiensis strains from Argentina. Antonie Van Leeuwenhoek. 2004;86(1):87-92. DOI: 10.1023/B:ANT0.0000024913.94410.05.

23. Willumsen P.A., Johansen J.E., Karlson U. Isolation and taxonomic affiliation of N-heterocyclicaromatic hydrocarbon-transforming bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology. 2005;67(3):420-428. DOI: 10.1007/ s00253-004-1799-8.

24. Bravo A., Sarabia S., Lopez L., Ontiveros H., Abarca C., Ortiz A., et al. Characterization of cry genes in a Mexican Bacillus thuringiensis strain collection. Applied

and Environmental Microbiology 1998;64(12):4965-4972. DOI: 10.1128/AEM.64.12.4965-4972.1998.

25. Jain D., Sunda S.D., Sanadhya S., Nath D.J., Khandelwal S.K. Molecular characterization and PCR-based screening of cry genes from Bacillus thuringiensis strains. 3 Biotech. 2017;7(1):4. DOI: 10.1007/s13205-016-0583-7.

26. Yuryev A. PCR primer design. Totowa: Humana Press; 2007, 431 p.

27. Khalafyan A.A. Modern statistical methods of medical research. Moscow: Lenand; 2014, 320 p. (In Russian).

28. Natingga D. Data science algorithms in a week. Birmingham - Mumbai: Packt Publishing; 2018, 214 p.

29. Galea A. Applied data science with Python and Jupyter. Birmingham - Mumbai: Packt Publishing; 2018, 174 p.

ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРЕ

Крыжко Анастасия Владимировна,

к.с-х.н., ведущий научный сотрудник,

Научно-исследовательский институт

сельского хозяйства Крыма,

295453, г. Симферополь, ул. Киевская, 150,

Российская Федерация,

[email protected]

https://orcid.org/0000-0001-5401-0579

Вклад автора

Автор выполнил исследовательскую работу, на основании полученных результатов провел обобщение, подготовил рукопись к печати.

Конфликт интересов

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Автор прочел и одобрил окончательный вариант рукописи.

Информация о статье

Поступила в редакцию 20.08.2024. Одобрена после рецензирования 05.11.2024. Принята к публикации 30.11.2024.

INFORMATION ABOUT THE AUTHOR

Anastasiia V. Kryzhko,

Cand. Sci. (Agriculture), Leading Researcher, Research Institute of Agriculture of Crimea, 150, Kievskaya St., Simferopol, 295453, Russian Federation, [email protected]

https://orcid.org/0000-0001-5401-0579

Contribution of the author

The author performed the research, made a generalization on the basis of the results obtained and prepared the manuscript for publication.

Conflict interests

Author declares no conflict of interests regarding the publication of this article.

The final manuscript has been read and approved by the author.

Information about the article

The article was submitted 20.08.2024. Approved after reviewing 05.11.2024. Accepted for publication 30.11.2024.